光记录人类诱导性多功能干细胞心脏动作电位的单个细胞和单层膜产生长QT综合征1型患者

文摘

诱导多能干细胞(万能)1型长QT (LQT1)患者可以分化成心肌细胞(CMs)包括心室细胞修复疾病表型。尽管使用膜电位染料光学录音监控动作电位(APs)据报道,没有研究调查心脏的疾病表型channelopathy与心脏亚型在单细胞水平。我们从三个控制和三个诱导iPSC-CMs LQT1病人。单细胞分析使用一个快速响应染色证实,心室细胞主要亚型(control-iPSC-CMs: 98%, 88%, 91%;LQT1-iPSC-CMs: 95%, 79%, 92%)。此外,LQT1-iPSC-ventricular细胞显示早期afterdepolarizations(频率的增加 )。心肌细胞层构成了心室细胞主要来源于LQT1-iPSCs显示长期美联社持续时间(adp) ( )。高通量分析使用心肌细胞单层膜在96 -孔板证明我_{基米-雷克南}抑制剂长期美国在控制和LQT1-iPSC-CM单层膜。我们证实了APs在单个细胞和单层膜的光学记录来自控制——LQT1-iPSC-CMs可以用来评估arrhythmogenicity,支持膜电位的可行性dye-based大规模筛选研究室性心律失常引起的基因channelopathy或cardiotoxic药物。

1。介绍

1型长QT综合征(LQT1),一种常见的先天性LQT综合症(cLQTS) [1),是由缓慢的减少引起的延迟整流K⁺当前的(我_Ks),与功能丧失的突变KCNQ1基因(2]。KCNQ1A341V被称为最频繁和严重KCNQ1突变(3]。与野生型的coexpressionKCNE1我的β亚基_Ks通道,使一个病态的减少_Ks(4),表明构建的重要性来概括体外病理生理条件。人类诱导性多功能干细胞心肌细胞(hiPSC-CMs)被证明改变离子通道调节人类心脏的电生理活动,成功地概括LQT1表型(5- - - - - -8]。

先前的相关论文,cLQTS特定的hiPSC-CMs证实疾病表型膜片钳方法单独使用手册(5,7]或结合微电极阵列(MEA)系统(6,8]。然而,该领域潜在的持续时间(FPD),这反映了在心电图QT(心电图),比心房心室hiPSC-CM层长iPSC-CMs当使用意味着系统(9),这意味着需要一个高比例的心室hiPSC-CMs分析室性心律不齐的疾病。膜片箝分析心脏亚型分类标准,但它需要大量的时间和专业知识(10]。自动化膜片箝技术可以解决这些缺点,但他们引起细胞产生自发动作电位(APs),不稳定是由于酶治疗前立即分析(11]。

FluoVolt(艘)是一种新的膜电位VF2.4。CI染料(12,13]。它调节photo-induced电子转移(PeT)从电子供体荧光团通过合成分子线(12,14在微秒时间尺度)和响应,这使得它比基因编码的电压指标(15,16]。此外,它有一个更高的荧光比率(大约20%ΔF每100 mV / F)和较低的光毒性比di-4-ANEPPS等电致变色的染料(12,17),使单个心肌细胞的亚型分类(18]。

艘渔船和VF2.1。从iCell Cl被用来分析APs^®心肌细胞层或3型LQTS-iPSC-CM层以及药物对多井板影响读者(19,20.]。不过,这些层ventricular-type细胞的比例还没有经过验证。自arrhythmogenic变化发生在心室细胞LQTS,是至关重要的调查这个特定亚型的电生理特性。

在目前的研究中,我们提出一个新的方法,包含阵线和结合了光学测量单个心肌细胞的膜电位和心脏层识别亚型和亚型与两者相关联的属性。我们表明了这种方法的有效性使用病人hiPSC-CMs LQT1建模。

2。材料和方法

2.1。一代的人类“诱导多能性”细胞从三个1型LQTS患者

本研究经伦理委员会批准的医学研究生院京都大学和京都大学医院。从患者获得书面知情同意是依照《赫尔辛基宣言》。LQT1-iPSCs生成三个病人使用游离向量(21]。三行iPSC来源于健康的捐赠者(201 b7 (22),409 b2 (21),和692年d2 (23)被用作控制万能。人类则保持在停止给料机层与灵长类动物ES细胞培养基培养(ReproCell、横滨、神奈川、日本),如前所述[22]。

2.2。心脏分化和Fluorescence-Activated细胞排序

人类被分化的细胞则形成拟胚体(EBs),如前所述[24,25进一步的细节(见补充材料)。29天,EBs分离,分散到纤连蛋白(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)涂布6厘米。第二天,收集的种子细胞Accumax(创新电池技术、圣地亚哥、钙、美国)10分钟并受fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)(咏叹调II, BD生物科学、圣何塞、钙、美国)。净化心肌细胞,SIRPa-positive与血统(CD31、CD49a CD140b, CD90、或TRA-1-60) -细胞排序(26)和低温贮藏STEM-CELLBANKER(日本Zenyaku Kogyo、郡山市、日本)−80°C。几周后,cryotubes被转移到一个液氮储罐。

2.3。定量聚合酶链反应(qPCR)

总RNA提取后流式细胞仪使用QIAzol裂解试剂(试剂盒、希尔登,德国)。执行中存在与TaqMan基因表达分析(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。要想知道更多的细节,请见补充材料。

2.4。解冻冷冻iPSC-CMs

穿孔膜片箝记录,cryotubes在37°C水浴解冻,在300 g离心5分钟,播种fibronectin-coated 2号封面上玻璃(Matsunami,大阪,日本)充满StemPro 34 SFM(热费希尔科学)含有缓冲和10 ng / ml VEGF。播种后五到十天,细胞受到膜片钳实验。

2.5。电流钳记录

穿孔全细胞电流钳模式使用执行补丁两性霉素B (Sigma-Aldrich), B Axopatch 200放大器(分子器件、桑尼维尔,美国),和pCLAMP软件(分子设备)。最大舒张潜力(MDP),美联社振幅(APA),和动作电位持续时间(adp) 90%复极化(adp_90年)计算的平均美联社10连续稳定在1赫兹节奏模式与pCLAMP软件。详细的协议,见补充材料。

2.6。电压钳记录

我_Ks电流记录从单个心肌细胞破裂全细胞膜片箝技术。我_Ks被减去计算电流与细胞外灌注后解决方案包含30μ(-)- [3 r, 4 s] -chromanol 293 b (Tocris生物科学,英国布里斯托尔)灌注前电流。我_Ks电流是由去极化引起的步骤从40 mV−−20的潜力,0,4 s 20和40 mV。其次是2 s复极化阶段。详细的协议,见补充材料。

2.7。播种高密度iPSC-CM单层

2μl 50μg / ml纤连蛋白被放在一个直径35毫米玻璃底菜(Matsunami)或5μl是放置在一个96孔板和清晰的平底井(美国纽约康宁,康宁公司)。一个小时之后,纤连蛋白是吸气,2μl解冻4×10的珠子⁴iPSC-CM悬挂放置在35毫米盘或5μl珠解冻的5×10⁴iPSC-CM悬挂放置在96孔板。另一个小时孵化后,适当的媒体添加轻轻卷。这道菜或板在37°C,孵化有限公司5%₂。媒体的构成是一样的在天7 - 29日。交换媒介是每2到3天。

2.8。加载阵线

当加载FluoVolt(阵线;热费希尔科学),介质交换修改Tyrode的解决方案和阵线(0.1%体积)。普朗尼克表面活性剂不用于本研究。二十分钟后加载、媒介与修改刷新Tyrode和每个试验中使用的解决方案。

2.9。光记录APs的单个细胞或心肌细胞层

细胞成像在35毫米直径的玻璃底菜37°C和修改Tyrode的解决方案相同的用于膜片箝记录。子阵列图像记录每8女士在单个细胞或每4 ms在单层使用AquaCosmos软件(滨松光子学)。感兴趣的区域(roi)层被定义为单像素的512×32 1 Hz踱来踱去。adp的绘图和计算_90年进行OriginPro 2016 (OriginLab,北安普顿,妈,美国)。要想知道更多的细节,请见补充材料。

2.10。APs的光记录心肌细胞单层膜在高通量板读者

fds /μ细胞成像平台(滨松光子学)使用。LED电流300毫安。激发波长是使用标准输出设置492个基点20 nm和发射滤波器540 af40(美国VTω光学,伯瑞特波罗)。装箱将4×4,和测量间隔每4 ms。心肌细胞单层膜后7 - 10天播种在每个刺激在1赫兹1去极化脉冲女士在10 V。美国的分析_90年心肌细胞和fds进行波形分析软件(U8524-12;滨松光子学)。

2.11。电影

闪烁的单层膜与AquaCosmos软件记录30 fps。

2.12。统计分析

所有统计分析验证未配对t以及使用Excel 2016(美国微软,微软,佤邦)。被认为具有统计显著性值表示 和 的数字。

3所示。结果

3.1。建立三个LQT1 iPS细胞系

我们选择三个LQT1病人作为iPSC推导的捐助者。捐赠者之一是一个50岁的女人(II-2图1(一))经历了几次晕厥先兆时她在初中,经历了反复晕厥在她三十岁。她在静息心电图QT延长(图显示突出1 (b))和运动心电图。其他捐助者被她的两个女儿的QT间隔延长根据学校体检。基因检测诊断的母亲和两个女儿1型长QT综合征KCNQ1A341V突变(c.1022C > T)(图1 (c))。跨膜区域的突变位于段6孔附近的我_Ks通道(图1 (d))和报道类型的LQT1[最严重的国家之一3]。药物治疗(beta-blockade)和生活方式措施足以防止复发事件三个病人。5 6个家庭成员积极的KCNQ1突变有经验的晕厥,第六(III-1图1(一))没有。所有航空公司延长在心电图显示高职院校学前教育专业。

生成的细胞则从三个病人的外周血使用病毒的方法(21和通过EB分化成心肌细胞形成24,25)(图1 (e))。没有显著差异基因的表达影响美国控制-和LQT1-iPSC-CMs(补充图1)。

3.2。膜片箝分析

Ventricular-type心肌细胞来源于三个控制,三行LQT1-iPSC受到当前夹录音(图2(一个))。尽管没有显著差异在MDP或APA,美国有显著差异_90年在节奏控制在1赫兹,LQT1-iPSC-CMs(图2 (b))(值,0.0026)。此外,电压钳记录显示293年chromanol b-sensitive我小得多_Ks电流从LQT1-iPSC-CMs控件(数字2 (c)和2 (d))。

3.3。动作电位记录单hiPSC-CMs阵线染料

我们将心肌细胞亚型APs的基础上获得的单个细胞阵线(数字3(一个)和3 (b)和补充图2)。心室、心房和节点心肌细胞被定义为美国_90年美国/₅₀< 1.4、1.7 <美国_90年美国/₅₀和1.4 <美国_90年美国/₅₀分别为< 1.7,之前报道(补充图2)[27,28]。我们标记心室细胞的adp超过1秒为“美国心室细胞长。“这些细胞被更频繁地观察LQT-iPSC-CMs(数字3 (b)和3 (c)比control-iPSC-CMs)(数据3(一个)和3 (c))。ventricular-like心肌细胞的控制和LQT1-iPSC-CMs构成的主要人口(201 b7(控制),98%;409 b2(控制),88%;692 d2(控制),90%;LQT1A1(母亲),95%;LQT1B1(姐姐),79%;和LQT1C1(妹妹),93%)(图3 (c))。心室细胞的频率与长adp control-iPSC-CMs (201 b7, 16%;409 b2, 17%;和692年d2, 19%)低于LQT1-iPSC-CMs (LQT1A1, 50%;LQT1B1, 31%;和LQT1C1 32%)(图3 (c))。有趣的是,我们观察了早期afterdepolarizations (EADs)比control-iPSC-CM LQT1-iPSC-CM人口数量(数字3 (d)和3 (e))(值,0.031)。

3.4。动作电位记录hiPSC-CM单层膜的阵线

我们下测量了adp节奏中高密度心肌细胞文化(图4(一))。十连续波染料加载后平均(图4 (b)和补充电影)。美国_90年从LQT1-iPSC-CMs显著长于从control-iPSC-CMs(图4 (c))(值,0.000096)。

3.5。adp阵线在高通量测量板的读者

我们下一个测量hiPSC-CM阵线单层膜的高吞吐量96孔板组成的系统。APs在单层膜稳定之前和之后1赫兹(图踱来踱去5(一个))。APD车辆_90年平均从10连续波LQT1B1-iPSC-CMs超过从control-iPSC-CMs,和美国cisapride延长了_90年的心肌细胞来源于iPSC组(图5 (b))。此外,我们管理一个β兴奋剂模拟条件劳累型或情绪压力,疾病的表型更突出(5,6]。在100 nM异丙肾上腺素(ISP),我们评估的影响几个代理在药物长QT综合征(diLQTS)。红霉素和adp cisapride延长_90年在iPSC-CM组在ISP,但美国_90年LQT-iPSC-CMs一直高的浓度(数字5 (c)和5 (d))。这些发现支持膜染料系统的适用性high-throughput-based药物发现和毒理学测试。

4所示。讨论

iPSC-CMs心脏亚型的比例或心脏层和美联社参数据报道取决于文化持续时间(29日),这表明的重要性高比例的心室亚型建模时室性心律失常的疾病表型。在这项研究中,我们提出了一个简单的方法,使用阵线来衡量单个心肌细胞和心肌层来自正常和LQT1-iPSCs。光学记录单个心肌细胞识别每个细胞的心脏亚型和电生理特性(数据证实了他们的变量3(一个)- - - - - -3 (c)),这与先前的报道是一致的基因编码的膜电位传感器(15,16]。高电生理变化的单一iPSC-CMs认股权证评估人口众多的建模心室性心律失常心室细胞。我们的研究结果表明光记录识别心脏亚型的可行性和评估大量的电生理特性同时iPSC-CMs。

单层细胞成功地减少了adp的变化时同步电刺激以恒定的频率。之前报道,辅导一个电生理参数与adp高度相关30.),比心房心室hiPSC-CM层更长iPSC-CM层(9),这表明高比例的心室亚型适合于分析LQT-iPSC-CM单层膜的APs和diLQTS模型。结合单一细胞心脏亚型的识别,我们的光学记录证实,iPSC-CM层主要由心室细胞重现了长期美联社cLQTS时间和diLQT。此外,这个系统是适用于高通量分析调查对药物的反应。

虽然传统苯乙烯基电压特异性染色,如di-4-ANEPPS di-8-ANEPPS,电压的变化作出快速反应的能力,他们有低敏感性和不可忽视的光毒性(17,31日]。阵线和di-4-ANBDQBS,近红外荧光电压特异性染色,可以精确地跟踪跨膜电压较低的光动力损伤比di-4-ANEPPS [12,32,33]。此外,阵线已被用于一个大规模筛选[19]。

电弧光是一个基因编码的膜电位传感器亮荧光和微不足道的光毒性已被用于研究心肌细胞来自人类胚胎干细胞(15)和LQT2 iPSC-CMs [16]。然而,记录APs不同意与膜片箝技术由于电弧光的缓慢反应时间(34]。VSFP-CR [35],VSFP2.3的衍生物[36),以前结合subtype-specific标记基因(MLC2v,SLN,SHOX2)来分析三个iPSC-CM亚型的APs (37]。虽然基因编码的电压指标使promotor-specific电压响应,需要时间建立转基因细胞系稳定。另一方面,阵线和许多细胞系可以快速使用,因为它只需要20分钟加载。

diLQTS,这是一个获得LQTS,我主要是堵塞引起的_{基米-雷克南}通道和比cLQTS更频繁。众所周知,基因的突变负责cLQTS可能导致的风险增加diLQTS [38,39]。diLQTS也有类似的突变速率作为三大基因负责cLQTS cLQTS [40),导致1型的假设cLQTS patient-derived iPSC-CMs适合研究药物引起QT延长通过阻止我_{基米-雷克南}电流。在目前的研究中,我们使用阵线识别药物延长QT LQT1-iPSC-CM control-iPSC-CM单层膜,高通量的方式(数字5 (b)- - - - - -5 (d))。

尽管我们令人鼓舞的结果,但应该注意的是,阵线有一些局限性,因为测量APs是基于一个相对规模。APs提供MDP或APA值,也不与膜片箝分析。此外,hiPSC-CMs异构的电生理特性,包括他们的adp和自动性,很难同时测量节奏的APs心肌细胞。因此,在阵线的实验中,美国在单个细胞获得unpaced细胞与不同的跳动频率。诱导心肌细胞的异质性也可能导致录音的变化。研究调查方法成熟hiPSC-CMs [41,42),这样就可以减少异质性,从而导致更健壮和精确的大规模筛选。

尽管许多报道使用美联社morphology-based iPSC-CM亚型分类(27,28,43,44],它最近被认为美联社形态并不是一个可靠的指标(45,46]。未来的方法可以区分心肌细胞亚型诱导多能干细胞将有助于测量长adp LQT-iPSC-CMs更精确。

5。结论

总之,使用一个FV-based光学测量系统,我们成功地确定ventricular-type细胞心脏的主要人口亚型,发现他们有一个更高频率的adp延长筒子,当来自LQT1病人万能。进一步,单层膜主要人口据美联社在LQT-iPSC-CMs和diLQTS模型适用于分析二维高通量的方式。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

Yoshida博士在iPS门户拥有股票,公司虽然武田制药公司有限公司不是一个赞助商的工作,一些数据收集是由使用设备租赁公司。同时,武田制药公司有限公司支付的工资高木博士独立于这项工作。所有其他作者没有利益冲突。

确认

这项研究是由一个格兰特从再生医学研究项目的实际应用,从监管的科学研究资助药品和医疗器械,赠款的再生医学研究中心网络实现日本医学研究和发展机构的科研补助金日本社会科学,促进和iPS细胞研究基金。我们感谢Shinya Yamanaka有益的建议;Masatoshi Nishizawa Shunsuke Funakoshi,动向大武Hatani,和我们实验室的其他成员为他们的科学讨论;也陆陆续续Nishikawa Ikue武井,而成田技术援助;山本武Harita,伊敏Wuriyanghai, 29岁的膜片箝技术建议;彼得Karagiannis的批判阅读手稿;和圭佑Okita hiPSCs提供质粒向量和控制。我们也感谢洋子Uematsu行政支持。

补充材料

补充1。补充图1:相关基因的表达动作电位持续时间控制,LQT1-iPSC-cardiomyocytes。补充图2:动作电位的心室、心房和nodal-type心肌细胞记录下FluoVolt染料。

补充2。补充电影:一个闪烁的心肌细胞单层被FluoVolt染料。

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