的建设和评价皮下细胞脾静脉注射端口串行Intraportal交付在小鼠疾病模型

文摘

肝脏是最大的内部器官和稳态代谢的中心。因此,Liver-directed细胞移植是一个有吸引力的治疗选择的治疗各种代谢紊乱以及肝脏疾病。虽然临床liver-directed细胞移植需要多种细胞注射到门户静脉系统,缺乏小鼠模型允许我们执行重复的细胞注射到门户静脉系统。在这里,我们提出一个手术模型,利用脾脏作为皮下注射端口。小鼠脾脏转移皮肤下有完整的血管状。人类胎盘干细胞移植进行了一个星期后这个港口建设和重复三次。人类DNA细胞分布分析了量化人类Alu-specific底漆使用。大约50%的移植细胞均匀位于肝脾端口注入后一小时。使细胞跟踪和反人类的线粒体细胞免疫组织化学研究表明,局部主要在门户小远端分支。类似的多个细胞注射后观察细胞分布。 These data confirm that the subcutaneous splenic injection port is suitable for performing repetitive cell transplantation into the portal venous system of mouse models.

1。介绍

肝细胞移植是一种有前途的再生方法恢复或补偿受损的肝脏功能(1- - - - - -3]。虽然这种方法的治疗效果在100多个临床试验已经证明,有限的可用性的人类肝细胞禁止使用这种治疗肝脏疾病患者选择从先天性代谢紊乱肝硬化(4,5]。最近的进展干细胞源性干细胞生物学表明hepatocyte-like细胞可以是一个有吸引力的替代稀缺的使用人类肝细胞(6,7]。

干细胞技术先进,要求增加一个合适的啮齿动物模型进行临床前liver-directed细胞移植研究。在临床上用于治疗人类疾病,肝细胞移植到门户多次循环为了获得治疗剂量。这是完成通过导管放置在肝内门静脉,中间绞痛静脉、肠系膜下静脉、或专利脐静脉的新生儿。然而,由于大小限制,细胞注入路线在啮齿动物模型是有限的。小鼠肠系膜静脉的大小以及获得止血的困难在这个网站禁止其使用的注射部位。虽然肝直喷技术可用于无毛的新生儿小鼠模型,直接注射肝方法无法避免的可能性将细胞注入肝静脉系统,并获得止血是很困难的。这使得intrasplenic细胞注入当前的“黄金标准”过程细胞移植的动物模型。Intrasplenic细胞注射也最小化的风险导致门户压力增加脾脏可以作为缓冲地带的压力。

在这里,我们报告一个外科手术动员鼠标脾到皮下的口袋是用作皮下注射端口重复intraportal静脉注射细胞的性能。这些移植细胞的体内分布随后评估小鼠模型。

2。材料和方法

2.1。老鼠

本研究中使用的所有老鼠繁殖和安乐死适当协议后批准的南加州大学制度动物保健和使用委员会和美国国立卫生研究院的指导后进行护理和使用实验动物。增殖杂合的双NOD.129 -Prkdc (B6)^scidIdua^tm1Clk老鼠从杰克逊实验室获得(# 004083),坐落在specific-pathogen-free条件和提供定期chow (TEKLAD # 2018)和无菌水/酸化。与特定的引物进行pcr基因分型根据杰克逊实验室的指令。

2.2。皮下注射脾港口建设

一周计划细胞注射之前,鼠标脾港口被下面的技术准备。简单地说,左边的头发上背和主干区域是剃,化学消除使用脱毛膏。脾脏是一个皮肤切口,然后皮下的口袋是准备直接止血剂(图1(一))。肌肉层开放在脾脏安全地访问gastrosplenic韧带,连接的上杆脾和胃。脾脏是动员和转移到皮下的口袋(图1 (b)),肌肉层随后关闭无血管的地区之间保留脾脏的脾血管皮下口袋(数字1 (c)- - - - - -1 (g))。最后,与6 - 0缝合皮肤被关闭。值得注意的是,最初的皮肤切口相对比通常需要一个简单的脾细胞注入,因为它允许更好的接触腹腔解剖的识别。

2.3。人类羊膜上皮细胞系制备使不灭的

主要人类羊膜上皮细胞(hAECs)从五个不同的捐赠者是永生的使用SV40慢病毒载体(pLenti-SV40-T + t,应用生物材料有限公司,里士满,公元前,加拿大)。一行(iAE124)被选中,用于进一步慢病毒GFP标记(PL-SIN-EF1a-EGFP)。

2.4。细胞移植

一周后皮下注射脾港口建设,使用GFP-positive细胞注入了无限增殖hAECs (iAE124-GFP)和主hAECs。200年共有150万个细胞被停职μl 50%台盼蓝/ PBS的解决方案。收件人老鼠与异氟烷吸入麻醉。皮下脾脏是可见的和明显的皮下(图1 (h))。Intrasplenic通过皮肤细胞注入了400μl / min注射速度。针针对的是脾的低杆,和针尖端插入脾(图的中间1(我))。细胞注射后,针被没有额外的止血措施。多个细胞注入测试三个老鼠。每个老鼠收到150万个细胞的主要hAECs每注射三次一个星期。一周过去主要hAEC注射后,iAE124-GFP细胞被注入确认皮下注射脾端口的功能。

2.5。人类DNA量化

一小时注射细胞后,这些动物安乐死和细胞注射部位和周围组织检查台盼蓝染色(图1 (j))。肝、肺、肾和脾收获了人类DNA组织学分析和量化。肝脏解剖,每个叶是识别和分离:左外侧叶(iii),中间左叶(MLL),中部叶(推广),右侧侧叶(RLL)和尾状叶(CL)(图2(一个))。DNA分离基因组DNA隔离设备(zr - 96 Quick-gDNA Zymo研究、欧文、钙、美国)从每个整个叶和全肺、肾、脾组织。量化人类DNA,铝合金元素,形成一个丰富的地区啮齿动物和人类的进化趋异后,发现了用实时定量PCR (qPCR)。的intra-Alu Yb8引物(转发:5 - - - - - -注册会计师GGC GGG TGG ATC ATG gg条t - 3和反向:5 - - - - - -TCT GTC GCC CAG GCC GGA CT-3 )使用与SYBR绿色系统(8]。这组引物的敏感性是0.01%。总共有四只动物检查( )。

2.6。人羊膜上皮细胞(hAEC)检测在老鼠的肝脏

为了检测hAECs收件人小鼠肝脏、两个细胞识别方法,使细胞跟踪(GFP-positive hAEC注射)和反人类的线粒体免疫组织化学染色,。

受体肝脏切片在5毫米厚度和沉浸在4%多聚甲醛/ PBS缓冲固定在一夜之间在4°C。样本分为两组cryosection和石蜡包埋/部分。cryosection样本嵌入在一个10月化合物和切割8点μ米厚度。简要的部分用PBS和安装不变色安装介质与DAPI(表达载体)。肝脏结构可视化使用Alexa萤石594 Phalloidin(英杰公司)作为复染色。石蜡切片是沾了反线粒体抗体(MAB1273,克隆113 - 1,MilliporeSigma)在1:300稀释一夜之间在4°C。检测进行了过氧化物酶检测设备(ImmPRESS合试剂盒/山羊anti-mouse免疫球蛋白,矢量实验室)和过氧化物酶的底物(ImmPACT束射功率管,矢量实验室)按照制造商的指示。组织学分析使用荧光倒置显微镜(尼康te - 2000)和图像捕获与NIS-Elements显微镜成像软件。

2.7。统计分析

结果表示为 平均误差(SEM)。5.0统计分析与棱镜(GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。实验和对照组比较配对或未配对单向方差分析(Bonferroni事后分析和Dunnett多重比较)。的值 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。建立一个外科手术利用脾脏作为皮下注射端口

首先,我们建立了一个外科手术包括分离从胃和脾脏的搬迁与一个完整的血管蒂皮下的口袋里。不同于传统的脾脏注射,需要一个相对较大的皮肤切口在脾脏的上部。访问gastrosplenic韧带,胃大弯被抓住,用于操作。来测试这一手术的可行性为未来使用与疾病小鼠模型,我们使用semi-immunodeficient Idua基因敲除小鼠的接受者。尽管使用这种相对脆弱的疾病模型鼠标,没有与过程相关的死亡率。一个并发症包括皮肤的失败关闭由于皮下口袋大小不足,表明一个慷慨的皮下口袋应该开发为了有足够的空间容纳脾(图1(一))。防止动员脾脏回落到生理位置在腹腔,肌层缝合在脾门的中间无血管的区域(数据1 (e)- - - - - -1 (g))。总手术时间约为10分钟。一个星期后,切口仍然关闭,几乎完全愈合(图1 (h))。皮下脾脏是可见的和明显的。我们已经测试了不同规格大小的针头从30 g 25克。大针会倾向于减少剪切应力对细胞的影响。25 g针没有造成任何止血或泄漏问题(图1(我))。台盼蓝染料注入确认没有泄漏一小时后注入的200μl细胞悬液注入(图1 (j))。尽管规模相对较大的皮下的口袋,脾是严格封装没有过度皮下死腔。正如所料,皮肤层充当封口机是出现在其他常见静脉注射预防出血不需要止血过程。

3.2。使不朽的人类羊膜上皮细胞

主要人类羊膜上皮细胞(hAECs)从五个不同的捐赠者是永生的使用SV40慢病毒载体(pLenti-SV40-T + t,应用生物材料有限公司,里士满,公元前,加拿大)。建立永生化hAEC行形态学评估(图2 (b))。一行(iAE124)被选中,用于进一步慢病毒GFP标记(PL-SIN-EF1a-EGFP)。GFP-positive细胞被fluorescence-activated随后孤立细胞排序(流式细胞仪)和用于建立GFP-positive无限增殖hAEC线(iAE124-GFP)(数据2 (c)和2 (d))。

3.3。体内和肝内细胞分布

评价体内细胞分布水库脾细胞注射后,人类DNA的存在被qPCR量化使用人类Alu sequence-specific引物(8]。脾、肝、肺和肾脏是收获,并从这些器官DNA分离。考虑到血液流动模式,我们认为肺作为前哨细胞泄漏点附近的肝脏,和肾脏用于检测任何系统循环注入人体细胞。一个小时后细胞注射, %的发现人类DNA被发现在脾脏和肝脏中50.43%是(图2 (e))。在大多数情况下,人类DNA水平下肺样本或边缘检测水平(< 0.01%)。然而,在一个案例中,我们发现0.51%的人类肺的DNA样本。这一发现表明,细胞可以从肝内门静脉系统泄漏注入肝静脉系统。

我们进一步调查的详细解剖肝脏叶肝内细胞分布。人类DNA的数量在每个肝脏叶估计,和肝内细胞分布比例计算(图2 (e))。左外侧叶(iii)和尾状叶(CL)的存在一个相对更高的移植的细胞的数量;然而,没有显著差异。虽然个体差异被观察到,人类DNA的总体数量在每个叶与叶的湿重( )(图2 (f))。这些数据表明,细胞分布遵循肝脏血流动力学和均匀分布在整个肝脏。

GFP-positive细胞追踪和反人类的线粒体细胞免疫组织化学显示,一般位于每个叶。GFP-positive细胞主要被发现在小远门户分行平均距离肝脏表面 μm(图3(一个))。一些细胞观察门静脉周的地区相对大型门户网站的静脉,有些细胞形成细胞聚合门户(微)肝内毛细血管。一个小时后细胞注射后,一些细胞已经位于肝实质(图3 (b))。类似的细胞分布格局与反人类的观察线粒体免疫组织化学分析。人类mitochondrion-containing细胞中观察到肝内门户毛细血管(图3 (c)(图)以及门静脉周的区域3 (d))。

3.4。多个细胞注射

皮下脾细胞注射口的功能多个hAEC证实移植注射GFP-positive hAECs。下的皮下脾清晰可见皮肤和明显的手术后一个月。三个注射non-GFP-labeled hAECs每隔一个星期,GFP-positive无限增殖hAECs注入(图4(一))。GFP-positive细胞被发现在收件人的肝脏(数字4 (b)和4 (c)),细胞数量和分布模式是单独注入情况下的相同。没有证据表明在注射部位的泄漏,并没有炎症的迹象。

4所示。讨论

重复注射细胞往往需要足够数量的细胞移植改善疾病表型。临床肝细胞移植的研究表明,大约1亿个细胞每公斤体重需要更换约5 - 20%的病人的缺失酶功能,所需表型稳定/改善[5]。例如,30公斤体重婴儿需要三十亿个细胞。提供如此大量的细胞在人类患者,需要多个细胞移植。然而,当前鼠标intrasplenic细胞注射方法不适合多个细胞移植的传导过程。重复开放手术导致强调接受者老鼠和增加出血的风险。为了执行多个细胞注入小鼠模型,我们建立了一个微创手术模型,利用脾脏作为皮下注射端口。结果表明,多个细胞注射的性能是可行的,而不需要进一步的手术。

在这项研究中,我们调查了体内和肝内细胞分布。虽然一个肺样本包含人类DNA检测,在大多数的情况下,注射细胞保留在脾脏和肝脏。肝内细胞分布与每个叶的大小相关。这些数据进一步支持使用荧光珠之前的研究表明,门静脉流均匀分布到每个叶(9]。使用体内荧光显微镜,蒂姆等人观察到微栓塞的形成在门户小远端分支注入同源的肝细胞。他们还展示了异构门户静脉灌注导致一个高度异构intrasplenic注射后的细胞分布(10]。而肝动脉流均匀散布肝脏腺泡,荧光染料注入门户静脉系统显示清晰的解剖边界定义高度,半,nonportal静脉灌注肝腺泡。由于细胞的数量有限,我们不可能得出结论是否intralobular细胞分布均匀或不均匀。然而,我们观察到的趋势,主要标识的移植细胞在门户小远端分支平均距离约100μ米从肝脏表面。进一步调查使用这个模型将阐明细胞分布模式,如果存在,机制导致异质细胞分布。

这个模型将有助于优化各种临床治疗条件下使用不同的小鼠疾病模型。我们报道的治疗疗效hAEC通过经皮肝脏直接注入新生小鼠模型的黏多糖病我11]。进一步优化包括细胞剂量可以执行这个intrasplenic多个细胞移植模型。许多疾病模型小鼠敏感和容易受到物理搅拌,使其不适合进行重复手术或设备植入。因此,皮下注射脾端口可能是有用的测试治疗生物和非生物的产品在这些疾病小鼠模型。

5。结论

我们建立了小鼠模型,允许多个细胞注射的微创性性能。细胞分布分析表明肝脏叶之间的细胞均匀分布,和异构分布在肝脏叶。皮下脾细胞注射口多个细胞注射后功能。这个模型将有用的模拟临床肝细胞移植和促进临床研究使用干细胞肝细胞移植研究。

缩写

绿色荧光蛋白:	绿色荧光蛋白
流式细胞仪:	Fluorescence-activated细胞分类
hAEC:	人羊膜上皮细胞
大典时:	左外叶
MLL:	中间左叶
推广:	中间的叶
RLL:	右侧侧叶
肤色线:	尾状叶
10月:	最佳切削温度
PBS:	磷酸盐
DAPI:	4 ,6-diamidino-2-phenylindole
聚合酶链反应:	聚合酶链反应
TF:	组织因素。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢博士锡昂比散打赢,博士和尼尔Kaplowitz提供试剂对细胞不灭。我们承认分析/仪器核心南加州大学研究中心的肝脏疾病(P30DK048522)使用各种工具。这部分工作是由加州再生医学研究所(CIRM)格兰特古墓3 - 05488 (TM)。

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