GLP-1基因修饰的人脐带间质干细胞系的改善血糖水平在2型糖尿病小鼠

抽象

2型糖尿病构成了对患者的健康造成严重威胁，但目前临床上尚无理想的治疗方法。胰高血糖素样肽-1和人脐带间充质干细胞已被证实具有抗糖尿病作用，但是它们两者具有抗糖尿病，这不能满足临床治疗的需要的过程中的某些缺陷。我们假设，人脐带间充质干细胞可以用来作为载体来构建体内GLP-1表达了一个长的时间的新的细胞系。和此细胞株导致在2型糖尿病小鼠中降低血糖。结果表明，3周新细胞系的肌肉内注射后，2型糖尿病小鼠的空腹血糖恢复到正常范围，以及降血糖作用在3个星期内结束了药物后维持。同时，给药，小鼠体重减轻期间，食物摄入减少，GLP-1的半衰期延长在身体中，IR降低，胰腺功能恢复。这项研究的结果表明，新的细胞系可以延长GLP-1在体内的半衰期和有效降低血糖，这是提高2型糖尿病的一个可行的方法。

1.简介

2型糖尿病(T2DM)是一种以高血糖为特征的慢性病。一般认为其发病机制与胰岛素抵抗、胰岛素分泌缺陷、肥胖、炎症等因素有关[1,2]。虽然已经测试了许多治疗糖尿病的方法，包括口服降糖药、胰岛素和干细胞，但T2DM仍未治愈。

胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是主要由分泌的肠L细胞的肠降血糖素激素[3.,4]。GLP-1促进葡萄糖的刺激胰岛素下的胰岛分泌，同时抑制胰高血糖素的分泌，延缓胃排空，降低食欲，减少食物摄取[5- - - - - -9]。因此，GLP-1发挥降糖作用时并不会导致低血糖。许多学者认为GLP-1是最有前途的抗t2dm药物[10,11]。然而，二肽基肽IV（DPP-IV）和快速肾清除在体内导致GLP-1血浆中的快速降解，限制的临床治疗潜力GLP-1 [12,13]。

人脐带间充质干细胞（HUC-MSCS）是从结缔组织中分离脐带周围血管气孔细胞。它得到的易得性，强大的增殖能力，以及低免疫原性的优点。它已成为临床上可用的间充质干细胞的一个[14]，它不仅可以用于临床治疗，而且作为其他药物[载体中使用15]。大量动物实验和临床研究表明，hUC-MSCs可降低动物和糖尿病患者的血糖，改善胰腺微环境，促进内源性胰岛细胞增殖[16]。然而，HUC-MSC的不改善肥胖的糖尿病患者的体重和脂肪的比例。

我们利用腺病毒感染的干细胞对人脐带间充质干细胞进行GLP-1基因修饰，应用于高脂高糖饮食联合链脲佐菌素诱导的T2DM小鼠，观察其降糖作用。探讨其降血糖作用的机制。本研究旨在为2型糖尿病的治疗提供新的思路和方法。

2.材料与方法

2.1。腺病毒和人类脐带间充质干细胞来源

这两种腺病毒和人脐带间充质干细胞，吉林大学捐赠，其中GLP-1和GFP基因在病毒Ad-GLP-1共表达。只有GFP基因写成的Ad-GFP。

2.2。新细胞系的构建

HUC-MSC的置于2个T75cm瓶在 细胞/mL，所需病毒体积计算 。按计算病毒量将Ad-GLP-1和Ad-GFP加入T75cm瓶中，3小时后更换。新培养液接种48小时后弃去;加入约1ml不含EDTA的胰蛋白酶，37℃培养箱培养1-2 min，离心，生理盐水洗涤2次;然后计算细胞数量。制备了Ad-GLP-1-hUC-MSCs和Ad-GFP-hUC-MSCs两株细胞系。

2.3。动物实验

雄性8周龄的C57BL / 6J小鼠（来自辽宁昌盛购买）被称重 克。饲养在标准动物室内(温度21-23℃，湿度50%，光照12:12 h，光/暗循环)，免费饮食水。在开始实验前，老鼠已经适应了一周的环境。

2.4。诱发2型糖尿病模型

给予高脂饮食(北京华福康动物公司)四周后，腹腔注射新鲜制备的链脲佐菌素溶液(130 mg/kg)，一周后测定空腹血糖水平。有多尿、多食和空腹血糖的小鼠 被认为是成功的2型糖尿病的诱导。

2.5。治疗项目

在实验中，小鼠根据以下治疗方案，随机分成3组（ )。（一世）组我 ）：广告-GFP-HUC-MSC组(2)第二组( ）：Ad-GLP-1-hUC-MSC集团(3)第三组（ )模型组

组I和II肌肉注射 的Ad-GFP-HUC-MSC和广告-GLP-1-HUC-MSC的，分别和III组用相同剂量的生理盐水注射。各组小鼠被加料，每周一次，持续3周。的Ad-GFP-HUC-MSC的肌内注射和Ad-GLP-1-HUC-MSC的后，将血液从在不同时间点后静脉丛取，得到血糖，GLP-1和胰岛素值。At the end of the experiment, the collected blood was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, and serum was taken for correlation detection. The pancreas was collected from each group of mice for morphological examination. All laboratory and animal care procedures are performed in accordance with the regulations approved by the Animal Care and Use Committee of Jilin Medical College (2018-LW010).

2.6。等离子分析：GLP-1，胰岛素的测量和血糖

小鼠不喂养12小时，采集血液样本。用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆GLP-1分泌水平和胰岛素水平;用葡萄糖氧化酶法测定血清血糖水平。

2.7。胰岛素敏感性评价

胰岛素抵抗的程度是由HOMA-IR的稳态模型评估分数根据由Matthews等人描述的方法进行估计。的HOMA-IR分值是使用以下公式计算： [19]。

2.8。葡萄糖耐量试验（OGTT）

The mice were fasted for 12 hours, and D-glucose (2 g/kg body weight) was intragastrically administered. The glucose oxidase method was utilized to detect blood glucose levels at 0, 30, 60, 90, and 120 minutes after gavage.

2.9。组织学研究

Mice were intraperitoneally injected with 100 mg/kg bromodeoxyuridine (BrdU; Sigma) 5 hours before killing. The pancreas was removed and fixed in 4% paraformaldehyde for 24 hours and then embedded in paraffin. Sections (3 mm) were obtained and stained with hematoxylin and eosin. Sections were microscopically examined using Nikon (Nikon Eclipse 80i; Tokyo, Japan), and the data was collected by scanning the sections in a random system using a computer with imaging software (ACT-2U version 1.52; Nikon). The islet area and the number of islets were measured blindly.

2.10。统计分析

数据表示为 并使用SPSS for Windows版本13.0（SPSS，芝加哥，IL，USA）进行分析。统计显着性由学生决定 -检验或单因素方差分析其次是学生纽曼 - 科伊尔斯事后检验。在差异 被认为是显著。

3.结果

3.1。间充质干细胞的腺病毒感染

为了确定腺病毒是否感染间充质干细胞，我们首先用荧光显微镜观察腺病毒感染的间充质干细胞48h。结果表明，腺病毒Ad-GFP和Ad-GLP-1感染间充质干细胞。然而，在感染程度上没有显著差异(图)1(一))。在48小时内病毒感染的后的细胞的GLP-1的相对表达水平通过实时PCR评估。GLP-1的在Ad-GLP-1感染的间充质干细胞中的相对表达比在Ad-GFP感染的间充质干细胞显著更高（图1 (b))。

3.2。改性间充质干2型糖尿病小鼠的细胞的GLP-1的释放

为了评估腺病毒感染的间充质干细胞是否在体内释放GLP-1，我们测量了肌注后24小时内血清中GLP-1的水平。两小时后肌内注射Ad-GLP-1-hUC-MSCs和Ad-GFP-hUC-MSCs Ad-GLP-1-hUC-MSC老鼠的glp - 1在血清内容开始增加,在8小时达到峰值,表明Ad-GLP-1-hUC-MSCs可以有效分泌2型糖尿病小鼠。注射ad - fp - huc - mscs后小鼠血清GLP-1含量变化不大。这表明腺病毒感染的Ad-GFP-hUC-MSCs在小鼠中不能释放GLP-1(图)图2（a）)。

GLP-1是已知的具有抑制食物摄取和减轻体重的效果。为了进一步评价GLP-1通过的Ad-GLP-1-HUC-的MSCs在小鼠的发布，我们给药后记录在食物摄入量的变化肌肉注射和每周的食物总摄入后24小时内，并记录在每周体重的变化。正如预期的那样，是Ad-GLP-1-HUC-MSC组中的小鼠的食物摄取和体重比那些的Ad-GFP-HUC-MSC组中显著降低。该结果再次表明，广告-GLP-1-HUC-MSC可在肌内注射（图小鼠后释放的GLP-1图2（b）,图2（c）,图2（d）和图2（e）)。

3.3。改良的间充质干细胞改善2型糖尿病小鼠的空腹血糖和糖耐量

为了评估修饰的间充质干血糖细胞在T2DM小鼠的影响，我们在第0周，3周，停药3周后进行的禁食12小时的血糖和葡萄糖耐受性试验。3周给药后，广告-GLP-1-HUC-MSC组和Ad-GFP-HUC-MSC组能够改善血糖和葡萄糖耐受性2型糖尿病小鼠模型组比较。然而，广告-GLP-1-HUC-MSC组的改善效果更显著，和的空腹血糖水平的Ad-GLP-1-HUC-MSC的3周停药后保持在较低的血糖水平。这些结果表明，所述的Ad-GLP-1-HUC-MSC组是在改善血糖的2型糖尿病小鼠更有效，并且可以保留更长的时间周期（图3.)。

3.4。改性间质干细胞提高胰岛素的敏感性在2型糖尿病小鼠

为了测试是否改性间充质干细胞可以改善2型糖尿病小鼠中胰岛素敏感性，我们在空腹小鼠血清中测量胰岛素和血糖水平，并根据HOMA-IR得分它们。是Ad-GLP-1-HUC-MSC组中的胰岛素水平明显高于那些是Ad-GFP-HUC-MSC组中显著较高，但空腹血糖水平降低显著。该实验中所利用的HOMA-IR分值作为胰岛素敏感性的指标。具有修饰的间充质干细胞处理的3周小鼠具有较低的HOMA-IR值比糖尿病组（图图4（a）和图4（b）)。这表明的Ad-GLP-1-HUC-MSC组具有改善2型糖尿病小鼠的胰岛素抵抗性的效果。同时，胰岛素耐受性测试还表明，采用胰岛素也是Ad-GLP-1-HUC-MSC组比对的Ad-GFP-HUC-MSC组更有效。这些结果表明，所述的Ad-GLP-1-HUC-MSC组提高了B细胞在2型糖尿病小鼠的胰岛素敏感性（图图4（c）和图4（d）)。

3.5。改性间质干细胞改善胰腺功能的2型糖尿病小鼠

为了确定改良间充质干细胞对空腹血糖的影响是否与胰腺功能恢复相关，我们对胰腺进行了形态学分析。3周后注射Ad-GLP-1-hUC-MSCs Ad-GFP-hUC-MSCs,每组胰腺形态明显改善与模型组相比,和胰岛总面积的百分比/胰腺总面积和胰岛数量/胰腺总面积显著增加。而Ad-GLP-1-hUC-MSC组与Ad-GFP-hUC-MSC组基本相同(图)5)。提示T2DM小鼠空腹血糖的改善可能与胰岛功能的恢复有关。

4.结论

利用质粒或病毒进行基因治疗以维持血浆中GLP-1水平的方法正变得越来越复杂。将连接GLP-1基因的腺病毒或质粒肌肉注射到1型糖尿病小鼠体内，可降低db/db小鼠的空腹血糖水平，并诱导小鼠胰岛B细胞数量增加。干细胞因其免疫原性低、增殖能力强而被认为是优良的药物载体。在本实验中，我们利用人脐带间充质干细胞的特性建立了一种高效的新型基因传递系统。它在2型糖尿病小鼠模型中产生治疗水平的GLP-1，并延长GLP-1作用的持续时间。

我们在2型构造新的细胞系的Ad-GLP-1-HUC-MSC的和Ad-GFP-HUC-MSC的，GLP-1在Ad-GLP-1-HUC-MSC细胞系中高度表达，并且GLP-1糖尿病小鼠可连续释放。我们研究的两种细胞系在2型糖尿病模型小鼠的治疗效果。制备2型糖尿病的小鼠模型中后，将新的细胞系肌肉注射，每周一次，连续3次以测试小鼠的空腹血糖。在2型糖尿病小鼠的空腹血糖水平与恢复到正常水平是Ad-GLP-1-HUC-MSC细胞系注入，并且所述细胞系停止后，治疗效果可维持3周。GLP-1是葡萄糖依赖性的，并且在给药没有观察到低血糖事件。在3周葡萄糖耐量试验，在不同的时间点的Ad-GLP-1-HUC-MSC组的曲线下的面积比所述的Ad-GFP-1-HUC-MSC组和模型组的小。这一结论表明的Ad-GLP-1-HUC-MSC组改善2型糖尿病小鼠的血糖比的Ad-GFP-1-HUC-MSC组更好。这种现象可能是相关的胰腺功能和胰岛素敏感性的提高。胰腺功能测试和HOMA-IR支持这一结论。

以前的报道表明，GLP-1对B细胞肿瘤的形成和分化的长期影响允许GLP-1维持血糖在12周龄小鼠ZDF 16天。在我们的研究中，虽然血浆GLP-1水平迅速下降，是Ad-GLP-1-HUC-MSC组的改进的葡萄糖耐受性仍高于21天，但B细胞的数量增加，并且B细胞功能的改善。在总胰岛面积/总胰岛面积和总胰岛/胰岛面积的增加证实了这一结论。

GLP-1或其类似物已被证明在提高动物模型和人类2型糖尿病患者的胰岛素敏感性。通过该GLP-1改善胰岛素敏感性可以涉及胰岛素信号介质如胰岛素受体底物回收机构（IRS-1），蛋白激酶C，Akt的活化在肌肉或肝脏和减少肝脏糖异生。我们分析了HOMA-IR分值和胰岛素抵抗的2型糖尿病小鼠中的改进处理后用Ad-GLP-1-HUC-MSC的可能与血糖水平的快速下降和胰岛素分泌增加在小鼠。

GLP-1对食物摄入的影响包括延迟胃排空，胃酸分泌的抑制，和食欲下降[13]。在一些报道，GLP-1基因治疗导致食物摄取量减少，减少体重增加，降低胰高血糖素，这与我们的实验结果（补充一致1)。这种影响主要是在给药后的最初几天。GLP-1的厌食作用被认为是在中枢神经系统发生并且经常产生的恶心和呕吐的不良反应。然而，这种不利的反应并没有在这款鼠标的实验中发现。

GLP-1在胰岛素分泌和合成中起主要作用，以及在B细胞增殖和预防细胞凋亡。据报道，GLP-1可以稳定胰岛素的mRNA，增加胰岛素的转录，并增加胰岛的数目[17,18，这与我们的实验结果一致。即我们实验中Ad-GLP-1-hUC-MSC细胞系治疗后血清胰岛素水平升高。与此同时，一些报道表明，当GLP-1改善胰岛素敏感性时，治疗动物的血清胰岛素水平会降低。这些比较可能是由于糖尿病动物模型的不同特点，如糖尿病的严重程度和细胞功能的保留。在本研究中，我们利用腺病毒载体系统评估了GLP-1在T2DM动物模型中的疗效。肌肉注射Ad-GLP-1-hUC-MSC细胞系后，可发挥GLP-1和人脐带间充质干细胞的作用。2型糖尿病小鼠的空腹血糖明显降低，食量减少，体重改善。此外，Ad-GLP-hUC-MSC细胞系可通过提高血液胰岛素水平和改善空腹血糖来提高胰岛素敏感性。

数据可用性

用于支持该研究结果的数据包括在项目之内。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

致谢

这项工作是在工程项目协议吉林省科技厅（第20180201033YY，20190304027YY）的支持。

补充材料

增补1：在第3周在各组小鼠的血胰高血糖素含量。^一个 ,^b ,与糖尿病对照组小鼠相比;^C ,^d ,与Ad-GFP对照组小鼠相比。(补充材料)

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