SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2019/4961865 4961865 研究论文 GLP-1基因修饰的人脐带间充质干细胞可以改善2型糖尿病小鼠的血糖水平 https://orcid.org/0000-0003-4016-6200 常 应 1 2 3. 越南盾 Mingxin 2 王 严 2 余 浩田 2 太阳 Chengbiao 2 姜 鑫 3. 陈 魏 1 2 3. 王 鑫 2 4 https://orcid.org/0000-0002-2040-7639 徐 Na 2 3. https://orcid.org/0000-0002-6670-6028 刘 Wensen 2 https://orcid.org/0000-0001-6561-4829 金 Ningyi 1 2 Mandraffino 朱塞佩 1 医学院 延边大学 延吉市133002 中国 ybu.edu.cn 2 军事兽医研究所 中国人民解放军军事医学科学院 吉林省人畜共患病防治重点实验室 长春130122 中国 bmi.ac.cn 3. 吉林医科大学 吉林132013 中国 jlu.edu.cn 4 吉林农业大学 长春130000 中国 jlau.edu.cn 2019 27 12 2019 2019 02 07 2019 09 10 2019 21 10 2019 27 12 2019 2019 版权所有©2019英昌等 这是一篇在知识共享署名许可下发布的开放访问的文章，该许可允许在任何媒介上不受限制地使用、发布和复制，只要原稿被正确引用。

2型糖尿病对患者的健康构成严重威胁，但目前临床上尚无理想的治疗方法。胰高血糖素样肽-1和人脐带间充质干细胞已被证实具有抗糖尿病作用，但两者在抗糖尿病的过程中都存在一定的缺陷，不能满足临床治疗的需要。我们推测可以利用人脐带间充质干细胞作为载体构建体内长期表达GLP-1的新细胞系。这种细胞株可以降低2型糖尿病小鼠的血糖。结果显示，肌注新细胞系3周后，2型糖尿病小鼠的空腹血糖恢复到正常范围，停药后3周内仍能保持降糖效果。与此同时，在给药过程中，小鼠体重减轻，食量减少，体内GLP-1半衰期延长，IR降低，胰腺功能恢复。本研究结果表明，新细胞系能延长GLP-1的体内半衰期，有效降低血糖，是改善2型糖尿病的可行方法。

 吉林省科学技术厅 20190304027 yy 20180201033YY 1.介绍

2型糖尿病（T2DM）是由高血糖标记的一种慢性疾病。人们普遍认为其发病机制与胰岛素抵抗，胰岛素分泌缺陷，肥胖，炎症和其他因素[ 1, 2]。尽管许多方法进行测试，以治疗糖尿病，包括口服降糖药，胰岛素和干细胞，T2DM仍然没有治愈。

胰高血糖素样肽-1 (Glucagon-like peptide-1, GLP-1)是一种促肠激素，主要由肠L细胞分泌[ 3., 4]。GLP-1在葡萄糖的刺激下促进胰岛分泌胰岛素，同时抑制胰高血糖素的分泌，减缓胃排空，降低食欲，减少食量[ 5- - - - - - 9]。因此，GLP-1发挥降糖作用时并不会导致低血糖。许多学者认为GLP-1是最有前途的抗t2dm药物[ 10, 11]。然而，二肽基肽酶IV (DPP-IV)和体内肾脏的快速清除导致血浆中GLP-1的快速降解，限制了GLP-1的临床治疗潜力[ 12, 13]。

人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)是从脐带血管周围结缔组织中分离出来的气孔细胞。具有制备方便、增殖能力强、免疫原性低等优点。已成为临床可用的间充质干细胞之一[ 14]，它不仅可以用于临床治疗，而且作为其他药物[载体中使用 15]。大量动物实验和临床研究表明，hUC-MSCs可降低动物和糖尿病患者的血糖，改善胰腺微环境，促进内源性胰岛细胞增殖[ 16]。然而，hUC-MSCs并不能改善肥胖糖尿病患者的体重和脂肪比例。

我们使用人脐带的GLP-1的基因修饰间充质干腺病毒感染的干细胞的细胞，并将其应用到具有高脂肪和高糖饮食菌素，观察其降血糖作用结合诱导的T2DM的小鼠。降血糖作用的机理进行了探讨。这项研究的目的是用于2型糖尿病的治疗提供创新的思路和方法。

 2.材料和方法 2.1。腺病毒和人脐带间充质干细胞的来源

腺病毒和人脐带间充质干细胞均由吉林大学捐赠，其中GLP-1和GFP基因在腺病毒Ad-GLP-1中共表达。只有GFP基因是用Ad-GFP写的。

 2.2。新细胞系的构建

hUC-MSCs置于2个T75cm的瓶子中 5 × 10 6 细胞/mL，所需病毒体积计算 莫伊 = 30. 。按计算病毒量将Ad-GLP-1和Ad-GFP加入到T75cm的瓶中，3小时后更换。接种新培养液48小时后弃去培养液;加入约1ml不含EDTA的胰蛋白酶，37℃培养箱培养1-2 min，离心，生理盐水洗涤2次;然后计算细胞数量。制备了Ad-GLP-1-hUC-MSCs和Ad-GFP-hUC-MSCs两株细胞系。

 2.3。动物实验

8周龄雄性C57BL/6J小鼠(购自辽宁昌盛)体重 20. ± 22 克。饲养在标准动物室内(温度21-23℃，湿度50%，光照12:12 h，光/暗循环)，免费饮食水。在开始实验前，老鼠已经适应了一周的环境。

 2.4。诱导型2型糖尿病模型

在给予高脂饮食(北京华福康动物公司)四周后，腹腔注射新鲜制备的链脲佐菌素溶液(130 mg/kg)，一周后测定空腹血糖水平。有多尿、多食和空腹血糖的小鼠 值 ≥ 7.8 更易 / 毫升 被认为是成功诱发2型糖尿病的。

 2.5。治疗项目

实验中，小鼠随机分为3组，处理方案如下( n = 10 )。

组我 n = 10 ): Ad-GFP-hUC-MSC集团

第二组( n = 10 ): Ad-GLP-1-hUC-MSC集团

第三组( n = 10 ）模型组

第一组和第二组肌肉注射 5 × 10 5 的Ad-GFP-HUC-MSC和广告-GLP-1-HUC-MSC的，分别和III组用相同剂量的生理盐水注射。各组小鼠被加料，每周一次，持续3周。的Ad-GFP-HUC-MSC的肌内注射和Ad-GLP-1-HUC-MSC的后，将血液从在不同时间点后静脉丛取，得到血糖，GLP-1和胰岛素值。At the end of the experiment, the collected blood was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, and serum was taken for correlation detection. The pancreas was collected from each group of mice for morphological examination. All laboratory and animal care procedures are performed in accordance with the regulations approved by the Animal Care and Use Committee of Jilin Medical College (2018-LW010).

 2.6。血浆分析:测定GLP-1、胰岛素和血糖

小鼠不喂养12小时，采集血液样本。用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆GLP-1分泌水平和胰岛素水平;用葡萄糖氧化酶法测定血清血糖水平。

 2.7。胰岛素敏感性评价

胰岛素抵抗程度根据Matthews等的方法通过稳态模型评价HOMA-IR评分来估计。HOMA-IR得分计算公式如下: 禁食 等离子体 葡萄糖 更易 / l × 禁食 血清 胰岛素 μ U / 毫升 / 22.5 ( 19]。

 2.8。葡萄糖耐量试验(OGTT)

小鼠禁食12小时，灌胃d -葡萄糖(2 g/kg体重)。采用葡萄糖氧化酶法检测灌胃后0、30、60、90、120分钟血糖水平。

 2.9。组织学检查

小鼠腹腔注射100mg /kg溴脱氧尿苷(BrdU;在杀戮前5小时。取出胰腺，4%多聚甲醛固定24小时，石蜡包埋。取3mm的切片，苏木精和伊红染色。切片用尼康显微镜检查(尼康日蚀80i;通过计算机随机系统扫描切片，并使用成像软件(ACT-2U version 1.52;尼康)。测量胰岛面积和胰岛数目时采用盲法。

 2.10。统计分析

数据表示为 意思 ± SD 并分析使用SPSS for Windows version 13.0 (SPSS，芝加哥，IL, USA)。有统计学意义的是学生的 t -检验或单因素方差分析，然后是学生-纽曼-科尔斯事后检验。差异 p < 0.05 被认为是重要的。

 3.结果 3.1。间充质干细胞腺病毒感染

为了确定腺病毒是否感染间充质干细胞，我们首先用荧光显微镜观察腺病毒感染的间充质干细胞48h。结果表明，腺病毒Ad-GFP和Ad-GLP-1感染间充质干细胞。然而，在感染程度上没有显著差异(图) 1(一))。real-time PCR检测病毒感染48h后细胞中GLP-1的相对表达水平。感染ad -GLP-1的间充质干细胞中GLP-1的相对表达明显高于感染ad -GLP-1的间充质干细胞(图) 1 (b))。

间充质干细胞腺病毒感染。(a)荧光显微镜观察感染情况。(b) Real-time PCR检测Ad-GFP和Ad-GLP-1腺病毒感染间充质干细胞48小时后细胞中GLP-1的相对表达情况。d p < 0.01 与Ad-GFP-hUC-MSC控制小鼠相比。

 3.2。2型糖尿病小鼠间充质干细胞释放GLP-1的研究

为了评估腺病毒感染的间充质干细胞是否在体内释放GLP-1，我们测量了肌注后24小时内血清中GLP-1的水平。两小时后肌内注射Ad-GLP-1-hUC-MSCs和Ad-GFP-hUC-MSCs Ad-GLP-1-hUC-MSC老鼠的glp - 1在血清内容开始增加,在8小时达到峰值,表明Ad-GLP-1-hUC-MSCs可以有效分泌2型糖尿病小鼠。注射Ad-GFP-hUC-MSCs后小鼠血清GLP-1含量变化不大。这表明腺病毒感染的Ad-GFP-hUC-MSCs在小鼠中不能释放GLP-1(图) 2(一个))。

2型糖尿病小鼠间充质干细胞释放GLP-1的研究(a)单次肌注改良间充质干细胞后168小时小鼠血清GLP-1含量。(b)单次肌肉注射后24小时累积食物摄入量。(c)肌肉注射后不同时间对食物摄入量的影响。(d)不同时间对体重的影响。(e)给药3周时体重增加率。数据是 意思 ± SD ( n = 10 )。c p < 0.05 ,d p < 0.01 与Ad-GFP-hUC-MSC控制小鼠相比。

众所周知，GLP-1具有抑制食物摄入和减轻体重的作用。为了进一步评估Ad-GLP-1-hUC-MSCs在小鼠体内释放GLP-1的情况，我们记录了肌注后24小时内的食量变化和给药后每周总食量的变化，并记录了每周体重的变化。与预期的一样，ad - glp -1 huc - msc组小鼠的食量和体重显著低于ad - glp - huc - msc组小鼠。这个结果再次证明了ad -GLP-1 huc - msc在小鼠肌肉注射后可以释放GLP-1(图) 2 (b), 2 (c), 2 (d)和 2 (e))。

 3.3。改良的间充质干细胞改善2型糖尿病小鼠的空腹血糖和糖耐量

为了评估改良间充质干细胞对T2DM小鼠血糖的影响，我们分别在停药后0周、3周和3周禁食12小时血糖和糖耐量试验。给药3周后，与模型组相比，Ad-GLP-1-hUC-MSC组和Ad-GFP-hUC-MSC组均能改善2型糖尿病小鼠的血糖及糖耐量。而Ad-GLP-1-hUC-MSCs组的改善效果更显著，停药3周后其空腹血糖水平仍维持在较低水平。这些结果表明Ad-GLP-1-hUC-MSC组在改善2型糖尿病小鼠血糖方面效果更明显，且可以持续更长的时间(图) 3.)。

细胞系注射治疗后疗效的评价。空腹12小时测定空腹血糖水平，口服葡萄糖(2 g/kg)。(a)给药3周及停药3周肌注Ad-GLP-1、Ad-GFP空腹12小时血糖。(b) Ad-GFP-hUC-MSCs和Ad-GLP-1-hUC-MSCs治疗3周后糖耐量变化。(c)治疗3周时应用葡萄糖浓度的Ad-GFP-hUC-MSCs和Ad-GLP- 1-hUC-MSCs。数据是 意思 ± SD ( n = 10 )。一个 p < 0.05 ,b p < 0.01 与糖尿病对照组小鼠相比;c p < 0.05 ,d p < 0.01 与Ad-GFP-hUC-MSC控制小鼠相比。

 3.4。改良间充质干细胞改善2型糖尿病小鼠的胰岛素敏感性

为检测改良间充质干细胞是否能改善2型糖尿病小鼠的胰岛素敏感性，我们测定了空腹小鼠血清中的胰岛素和血糖水平，并根据HOMA-IR对其进行评分。ad - glp -1 huc - msc组胰岛素水平明显高于Ad-GFP-hUC-MSC组，但空腹血糖水平明显低于ad - glp -1 huc - msc组。本实验采用HOMA-IR评分作为胰岛素敏感性指标。使用改良间充质干细胞治疗3周的小鼠的HOMA-IR值低于糖尿病组(图) 4(一)和 4 (b))。这说明Ad-GLP-1-hUC-MSC组具有改善2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的作用。同时，胰岛素耐量试验也显示，ad - glp -1 huc - msc组使用胰岛素比Ad-GFP-hUC-MSC组更有效。这些结果表明，Ad-GLP-1-hUC-MSC组提高了2型糖尿病小鼠B细胞的胰岛素敏感性(图) 4 (c)和 4 (d))。

评价3周细胞系注射后胰岛素敏感性的变化。(a)各剂量组在给药3周和停药3周空腹血清胰岛素水平变化。(b)各剂量组给药3周及停药后3周HOMA-IR变化。(c)给药3周各给药组静脉注射0.75 U/kg胰岛素，每30分钟监测血糖水平2小时。(d)胰岛素抵抗AUC。数据是 意思 ± SD ( n = 10 )。一个 p < 0.05 ,b p < 0.01 与糖尿病对照组小鼠相比;c p < 0.05 ,d p < 0.01 与Ad-GFP-hUC-MSC控制小鼠相比。

 3.5。改良间充质干细胞改善2型糖尿病小鼠的胰腺功能

为了确定改良间充质干细胞对空腹血糖的影响是否与胰腺功能恢复相关，我们对胰腺进行了形态学分析。3周后注射Ad-GLP-1-hUC-MSCs Ad-GFP-hUC-MSCs,每组胰腺形态明显改善与模型组相比,和胰岛总面积的百分比/胰腺总面积和胰岛数量/胰腺总面积显著增加。而Ad-GLP-1-hUC-MSC组与Ad-GFP-hUC-MSC组基本相同(图) 5)。这表明，在2型糖尿病小鼠空腹血糖的改善可能与胰岛功能的恢复。

在3周2个细胞系给药的T2DM的小鼠的胰岛的组织学分析。（a）中HE染色。规模：400。（b）中的百分比总胰岛面积/总面积胰腺癌。（c）中总的胰岛数/胰区域。 b p < 0.01 与对照组的小鼠相比。

 4.结论

利用质粒或病毒进行基因治疗以维持血浆中GLP-1水平的方法正变得越来越复杂。将连接GLP-1基因的腺病毒或质粒肌肉注射到1型糖尿病小鼠体内，可降低db/db小鼠的空腹血糖水平，并诱导小鼠胰岛B细胞数量增加。干细胞因其免疫原性低、增殖能力强而被认为是优良的药物载体。在本实验中，我们利用人脐带间充质干细胞的特性建立了一种高效的新型基因传递系统。它在2型糖尿病小鼠模型中产生治疗性水平的GLP-1，并延长GLP-1在体内的作用时间。

我们构建了新的细胞系Ad-GLP-1-hUC-MSCs和Ad-GFP-hUC-MSCs，其中GLP-1在Ad-GLP-1-hUC-MSC细胞系中高表达，GLP-1在2型糖尿病小鼠中可持续释放。我们研究了两种细胞系对2型糖尿病小鼠的治疗作用。制备2型糖尿病小鼠模型后，每周1次肌肉注射新细胞系，连续注射3次，检测小鼠空腹血糖。注射Ad-GLP-1-hUC-MSC细胞系后，2型糖尿病小鼠空腹血糖恢复正常，停药后维持治疗效果3周。GLP-1是葡萄糖依赖性的，在给药期间未观察到低血糖事件。在3周葡萄糖耐量试验中，不同时间点Ad-GLP-1-hUC-MSC组曲线下面积小于Ad-GFP-1-hUC-MSC组和模型组。提示Ad-GLP-1-hUC-MSC组对2型糖尿病小鼠血糖的改善效果优于Ad-GLP-1-hUC-MSC组。这一现象可能与胰腺功能和胰岛素敏感性的改善有关。胰腺功能测试和HOMA-IR支持这一结论。

既往报道显示，GLP-1对B细胞肿瘤形成和分化的长期影响使GLP-1在12周龄ZDF小鼠中维持血糖16天。在我们的研究中，虽然血浆GLP-1水平迅速下降，但Ad-GLP-1-hUC-MSC组葡萄糖耐量的提高仍保持在21天以上，但B细胞数量增加，B细胞功能改善。胰岛总面积/胰岛总面积和胰岛总面积/胰岛面积的增加证实了这一结论。

GLP-1或其类似物已被证明在动物模型和人类2型糖尿病患者中改善胰岛素敏感性。GLP-1改善胰岛素敏感性的机制可能涉及胰岛素信号介质，如胰岛素受体底物恢复(IRS-1)、蛋白激酶C、肌肉或肝脏中Akt的激活，以及肝糖异生的减少。我们分析了HOMA-IR评分，发现Ad-GLP-1-hUC-MSCs对2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的改善可能与小鼠血糖水平快速下降、胰岛素分泌增加有关。

GLP-1对食物摄入的影响包括延迟胃排空，胃酸分泌的抑制，和食欲下降[ 13]。在一些报道中，GLP-1基因治疗可以减少食量，减少体重增加，降低胰高血糖素的含量，这与我们的实验结果一致(补充) 1)。这种效果主要出现在用药后的头几天。GLP-1的厌食作用被认为发生在中枢神经系统，并经常产生恶心和呕吐的不良反应。然而，在小鼠实验中没有发现这种不良反应。

GLP-1在胰岛素分泌和合成、B细胞增殖和防止细胞凋亡中发挥重要作用。有报道称GLP-1可以稳定胰岛素mRNA，增加胰岛素转录，增加胰岛数量[ 17, 18，这与我们的实验结果一致。即我们实验中Ad-GLP-1-hUC-MSC细胞系治疗后血清胰岛素水平升高。与此同时，一些报道表明，当GLP-1改善胰岛素敏感性时，治疗动物的血清胰岛素水平会降低。这些比较可能是由于糖尿病动物模型的不同特点，如糖尿病的严重程度和细胞功能的保留。在本研究中，我们利用腺病毒载体系统评估了GLP-1在T2DM动物模型中的疗效。肌肉注射Ad-GLP-1-hUC-MSC细胞系后，可发挥GLP-1和人脐带间充质干细胞的作用。2型糖尿病小鼠的空腹血糖明显降低，食量减少，体重改善。此外，Ad-GLP-hUC-MSC细胞系可通过提高血液胰岛素水平和改善空腹血糖来提高胰岛素敏感性。

 数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在本文中。

 利益冲突

作者声明没有利益冲突。

 致谢

该项工作得到吉林省科技厅项目协议(编号:20180201033YY, 20190304027YY)的支持。

 补充材料

补充1:3周时各组小鼠血液中胰高血糖素含量。一个 p < 0.05 ,b p < 0.01 与糖尿病对照组小鼠相比;c p < 0.05 ,d p < 0.01 ，与Ad-GFP对照组小鼠相比。

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