间充质基质细胞表皮和真皮的牛皮癣患者:形态、Immunophenotype, T细胞增殖分化模式和监管

文摘

牛皮癣是一种皮肤病,其特征是角质细胞的增生和慢性炎症。间充质干细胞/基质细胞(msc)展览的免疫调节功能,可以改变这些病人的皮肤。然而,迄今为止,msc的存在和功能能力的真皮和表皮的牛皮癣患者尚未完全建立。在目前的研究中,我们评估了msc在患者的皮肤获得贴壁细胞的真皮和表皮lesional和nonlesional地区比较的方式,描述他们与相应细胞经表皮真皮(HD-MSCs)和(HE-MSCs)健康的捐赠者。我们确定是否附着的细胞已经immunophenotypic概要文件和分化潜能,msc的特征。此外,我们分析了他们的免疫抑制功能通过评估降低T细胞增殖的能力。我们的研究结果表明msc在真皮和表皮的存在健康的捐赠者和牛皮癣患者;附着皮肤来源的细胞表现出MSC特征,如表达CD73, CD90、CD105标记和缺乏造血和内皮标记表达式。然而,获得的细胞群显示差异对脂肪形成的分化潜能,成骨,chondrogenic血统。另外,我们观察到一个低MSC obtention频率nonlesional表皮样本(NLE-MSCs),也显示改变形态和增殖率。 Interestingly, MSCs from both the nonlesional dermis (NLD-MSCs) and lesional dermis (LD-MSCs) showed higher HLA class I antigen (HLA-I) expression than HD-MSCs. Moreover, NLD-MSCs showed a low T cell proliferation suppression capacity. In summary, this study demonstrates the presence of MSCs in the epidermis and dermis of patients with psoriasis and suggests that such cells may favor the inflammatory process and thus psoriatic lesion development through high HLA-I expression and low immunosuppression capacity.

1。介绍

牛皮癣是一种皮肤病,其特征是慢性炎症,neoangiogenesis,和角化细胞增生,导致表皮增厚。这种疾病的发病机制尚不清楚,但免疫系统的疾病特点是渗透细胞,如中性粒细胞、巨噬细胞、树突细胞和T细胞,真皮和表皮,以及hyperactivation这些细胞(1,2]。此外,促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),干扰素-γ(IFN -γ()、白介素)- IL - 2, IL - 6,引发,IL-17A, IL - 12、IL - 22生成时,和IL-23高度集中在这种疾病(1- - - - - -3]。因此,炎症在银屑病发展具有重要作用。

间充质干细胞/基质细胞(msc)人口的多功能细胞最初确定的骨髓(BM)和已经获得不同的组织。因为没有具体的标志,这些细胞已经建立了某些准则的特征:他们必须附着;他们必须表达标记CD90、CD105 CD73, CD13、HLA-I^低;是负HLA-II、CD45、CD34 CD31、CD14;他们必须有潜在的脂肪形成的,成骨,chondrogenic分化(4,5]。msc的主要特性之一是调节免疫反应的能力;这些炎症细胞迁移到网站,在那里他们被促炎细胞因子激活,如干扰素-γ肿瘤坏死因子-α、il - 1和IL-17 [6- - - - - -8]。一旦激活,msc开始表达和分泌各种分子产生抗炎环境通过调节活化,增殖,分化的免疫细胞。msc诱导T淋巴细胞和树突状细胞的分化,具有管理性质(9,10]。此外,他们减少NK细胞的激活和增殖,影响Th1和Th17淋巴细胞分化8,9,11- - - - - -13]。因为炎症在牛皮癣的一个重要的角色,一些研究提出可能的msc参与这种疾病的发展。

先前的研究已经表明,msc在牛皮癣患者的皮肤14,15];然而,这还没有完全建立。事实上,尽管炎症过程明显的真皮和表皮这种疾病的患者,没有研究识别和特征的存在相比,这些皮肤层和msc msc与获得健康的捐赠者。MSC描述是相关的,因为这些细胞的免疫调节作用在牛皮癣患者的皮肤可能会受到影响,因此导致疾病的发病机理。我们所知,这是第一个研究来评估MSC在真皮和表皮的牛皮癣患者,确定生物MSC特征差异牛皮癣患者和健康的捐赠者。的细胞群的形态学特征,获得增殖,immunophenotype,分化潜能。此外,我们分析他们降低T细胞增殖的能力来确定他们的免疫抑制功能。在这项研究中,我们比较皮肤与MSC来源于正常骨髓MSC (BM-MSCs),这被认为是MSC黄金标准。

2。方法

2.1。隔离和BM-MSCs文化

BM样本来自5个志愿捐献者Villacoapa医院的伦理指导方针后,墨西哥社会安全研究所(IMSS)。单核细胞被隔绝BM如前所述[16),之后,这些细胞被resuspended低葡萄糖杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM /低葡萄糖;马里兰州洛克维尔Gibco BRL)与10%胎牛血清(补充的边后卫;Gibco BRL)、谷酰胺4毫米100 U /毫升青霉素,链霉素100毫克/毫升、庆大霉素和100毫克/毫升(所有试剂都来自Gibco BRL);细胞被播种密度 细胞/厘米²在T-25培养瓶(康宁公司/配角;纽约,纽约)。经过4天的文化,不依从细胞被移除,和新鲜的培养基添加到文化。一旦文化融合达到了80%,细胞收获与胰蛋白酶(0.05%胰蛋白酶,EDTA 0.53毫米;Gibco BRL)和密度的亚文化 细胞/厘米²在t - 75烧瓶(康宁公司/合演)。第二通道,这些细胞被收获,分析,低温贮藏,以供将来使用。

2.2。皮肤样品和隔离msc的集合

皮肤活检获得来自牛皮癣患者皮肤“Ladislao de la帕斯夸河”中心。控制人的皮肤得到承认胃肠手术进行的原因除了自身免疫性问题Centro医生Nacional Siglo第二十一章。在这两种情况下,制度伦理指南,其中包括捐赠者的书面同意。只有一个活检被从控制个人( ),虽然两个样本取自牛皮癣患者( ):一个来自lesional皮肤和一个来自nonlesional皮肤。nonlesional皮肤样本来自一个网站至少20厘米远离病变。皮肤样本被放置在一个管RPMI 1640培养基(HyClone,通用电气医疗集团生命科学,小都,英国)和dispase II(蛋白酶II级,罗氏公司巴塞尔瑞士)。第二天,真皮是机械与表皮分离,两人都是孵化72小时37°C和5%的公司₂在DMEM /低葡萄糖补充10%胎牛血清,4毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,链霉素100毫克/毫升和100毫克/毫升庆大霉素(所有试剂都来自Gibco BRL)。外植体的培养皿中保持了大约20天,每3天与介质的变化。随后,附着数量与trypsin-EDTA分离(0.05%胰蛋白酶,EDTA 0.53毫米;Gibco BRL)和受移植者的密度 细胞/厘米²。细胞的总数和生存能力的文化与血细胞计数器用台盼蓝染色法测定(Gibco)。从第二或第三篇文章获得的细胞群被用于表征形态、immunophenotypic概要文件,和分化能力,所有的这些特征进行根据previouslydescribed协议(16]。

2.3。msc的形态学分析

识别msc从不同的来源获得之间的形态差异,第2通道细胞生长在培养皿中(康宁)4000个细胞的密度/厘米²。4 - 5天的文化后,细胞与甲苯胺蓝染色(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)和相差显微镜下检查。20个随机领域/培养皿中得分。

2.4。细胞表面抗原分析msc

Immunophenotypic表征msc描述的方法显示了蒙特西诺斯et al。16]。单克隆抗体表面标记使用msc的特征:CD105-PE, CD90-APC, CD73-PE, HLA-I-FITC, HLA-II-PE,和CD45-APC (BD生物科学,圣地亚哥,CA);CD13-PE和CD14-PE (Caltag白金汉,英国);和CD31-FITC CD34-APC(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。总共 msc在100毫升resuspended磷酸盐3% EDTA的边后卫和1毫米(血细胞计数缓冲区)与相应的抗体孵化20 - 30分钟。接下来,这些细胞被洗1毫升的缓冲和固定与流式细胞仪赖氨酸溶液(BD生物科学)。库尔特史诗的样本分析是流式细胞分析仪(贝克曼库尔特,沥青,CA),并收集至少10000事件。阳性细胞百分比和平均荧光强度(MFI)。数据分析与FlowJo 7.6.1软件。

2.5。对MSC分化

msc分化能力的评估根据先前描述的协议(16]。短暂,脂肪形成的分化诱导干细胞设备TM(干细胞技术,Inc .)、温哥华BC,加拿大)。14天的细胞被孵化脂肪形成的媒介,和脂肪形成的分化是由可视化的存在油红O-stained (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)脂质空泡。与干细胞成骨分化也诱导工具包TM(干细胞技术)。21天的细胞培养成骨的媒介,和成骨分化进行碱性磷酸酶染色。chondrogenic分化, 在150 g细胞离心5分钟形成颗粒状细胞micromass底部的管。28天的沉淀细胞孵化chondrogenic介质(Cambrex生物科学、Walkersville Inc . Walkersville, MD)补充10 ng / mL转化生长因子-β(Cambrex生物科学)。结果细胞micromasses固定、嵌入式和切片。横截面与阿尔新蓝染色染料(Sigma-Aldrich)。

2.6。Coculture msc和外周血单核细胞(PBMCs)

Cocultures msc和PBMCs信息联系在24-well准备盘子。PBMCs来源于外周血样本三个志愿捐献者通过密度梯度离心法Ficoll-Paque + ( ;通用电气医疗集团生物科技AB,乌普萨拉,瑞典)。PBMCs ( 细胞),先前沾5μM carboxyfluorescein succinimidyl酯(CFSE)被激活5μg / mL植物凝集素(PHA)没有或存在 BM-MSCs, HD-MSCs、NLD-MSCs LD-MSCs、HE-MSCs NLE-MSCs或LE-MSCs。经过6天的文化,CD3细胞收获来确定变化⁺通过流式细胞术T细胞增殖。细胞检查使用FACSCanto二流式细胞分析仪(正)。每样至少10000事件收集,数据分析与FlowJo 7.6.1软件。

2.7。统计分析

数据的平均值和标准误差表示为的意思。使用SPSS 20.0软件进行统计分析。Mann-Whitney比较组间进行测试或配对 - - - - - -测试。一个值< 0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。msc在皮肤的表皮和真皮从健康的捐赠者和牛皮癣患者

在目前的工作中,我们获得贴壁细胞健康的皮肤样本捐赠者和牛皮癣患者的活检和分析他们的形态、增殖,immunophenotype以及他们的脂肪形成的能力,成骨,chondrogenic分化;BM-MSCs存在所有这些特性,因此,BM-MSCs被认为是MSC黄金标准,与其他皮肤样品作为参考进行比较。为此,皮肤样本获得的健康献血者是腹部手术,和两个活检收集每个牛皮癣患者:一个对应于nonlesional区域,另lesional区域。真皮和表皮被隔离,单独处理获得贴壁细胞。细胞与成形态被收集和分析以确定他们是否有独特的MSC(图特征1)。

成功的比例从所有皮肤来源获得msc是变量;对于健康的捐赠者,可以从大英博物馆获得msc,表皮(HE-MSCs)和真皮(HD-MSCs)在所有样品处理(100%)。在牛皮癣患者样本,MSC obtention百分比类似于NLD-MSCs (93%)、LD-MSCs(95%),和LE-MSCs (74%)。然而,NLE-MSC obtention比例仅为14%,最低的价值(表1)。

3.2。形态和msc的增殖分析健康的捐赠者和牛皮癣患者

后我们发现msc在皮肤层的存在,我们决定分析这些msc的生物学特性解释他们可能参与银屑病发展。因此,我们评估了形态和msc的增殖率。在MSC文化中,我们确定了小细胞(长度小于70μ米)成形态(纺锤状细胞)和大细胞(长度大于70μ米)(图2(一个))。有趣的是,在NLE-MSCs文化,我们发现显著增加的百分比大细胞( ; )的价格相比HE-MSCs ( )和LE-MSCs文化( )。也观察到类似的结果HD-MSCs、NLD-MSCs LD-MSCs文化(图2 (b))。有趣的是,大细胞中观察到BM-MSCs文化( )。我们还观察到细胞增殖值(褶皱变化)在NLE-MSCs显著降低( , )比观察HD-MSCs ( ),NLD-MSCs ( ),LD-MSCs ( ),和HE-MSCs ( )。相比之下,LE-MSCs扩散值( )和BM-MSCs ( )也低,但没有显著不同于NLE-MSCs(图2 (c))。值得注意的是,在一个NLE-MSC文化,扩散停止在第四段。

3.3。健康的捐赠者和牛皮癣患者的皮肤msc显示低分化能力

msc来自不同来源的分化能力是评价BM-MSCs的相对比例。因此,以下几类被分配根据我们观察到的脂肪形成的或成骨分化潜能:(一)高分化潜能(50 - 80%的阳性细胞),(b)中间分化潜能(30 - 40%的阳性细胞)和(c)低分化潜能(低于10%的阳性细胞)。图3表明HD-MSCs、NLD-MSCs LD-MSCs中间脂肪形成的潜力和成骨分化。相比之下,HE-MSCs NLE-MSCs显示,低脂肪形成的成骨分化潜能。有趣的是,LE-MSCs显示一个中间成骨分化潜能。最后,chondrogenic分化能力观察msc获得所有样品(图3)。

3.4。msc牛皮癣患者的皮肤显示更高HLA-I表达式

标记的表达细胞群进行了分析,曾被报道BM-MSCs和缺乏造血和内皮标记。如数据所示4(一)和4 (b)CD13的表达水平,CD90 CD73, CD105在msc来源于健康的捐赠者和牛皮癣患者相似。所有的人口缺乏CD45, CD34、CD31、CD14表达。有趣的是,我们发现HLA-I表达的差异;具体来说,在HLA-I的百分比显著增加⁺观察细胞(图5 (b)在NLD-MSCs) ( )和LD-MSCs ( )相比之下,在HD-MSCs ( )。

相似的变化观察的MFI HLA-I(图5 (c))NLD-MSCs(增加8.7倍)和LD-MSCs(增加2.8倍)的价格相比HD-MSCs(增加8.8倍)。相比之下,HE-MSCs、NLE-MSCs LE-MSCs显示低HLA-I表达式( , ,和 ,分别),这些细胞群之间没有明显差异(图5)。

3.5。牛皮癣患者的皮肤msc显示低免疫调节能力

T细胞浸润和overactivation牛皮癣的皮肤疾病的病理学的一个关键因素。因此,我们分析了msc降低T细胞增殖的能力。图6只显示HD-MSCs ( )和LD-MSCs ( )减少CD3⁺积极的扩散控制T细胞增殖(100%),尽管他们与BM-MSCs效果弱于观察( )。msc从其他来源获得没有这个能力:NLD-MSCs ( ),HE-MSCs ( ),NLE-MSCs ( ),和LE-MSCs ( )。

4所示。讨论

先前的研究已经暗示的msc在牛皮癣患者的皮肤;然而,尽管真皮和表皮被认为与这种疾病的病理2),没有研究分析了存在这些细胞在皮肤层或msc源自lesional之间生理上的差异和nonlesional地区。因此,在目前的工作中,我们获得msc真皮和表皮的牛皮癣患者皮肤活检从健康的捐赠者和(lesional和nonlesional地区)。我们进行一个完整的描述这些样品通过分析他们的形态、增殖,标记表达式,trilineage分化能力,和免疫调节功能。

在我们的文化中,我们得到的贴壁细胞与成纤维细胞的形态类似于BM-MSCs观察。我们发现MSC人口几乎所有真皮和表皮样本健康的捐赠者和真皮牛皮癣患者。然而,NLE-MSCs的百分比很低(14%)。

有趣的是,贴壁细胞只获得三nonlesional表皮样本。许多研究相关MSC形态与MSC的增殖能力17,18],分化[19,20.),免疫抑制21),和细胞衰老22]。因此,我们决定确定可能的形态学差异MSC人口从不同的来源获得和发现,除了低频nonlesional MSC的表皮,这些文化中所开发的细胞有显著提高的百分比大细胞和较低的扩散能力。样品的最大的潜力,扩大文化、纺锤状细胞成为主流(17- - - - - -22]。可能在nonlesional表皮样本,微环境影响某些MSC特征已经存在,这可能导致病变的发展。

我们观察到,msc从皮肤显示一个类似于immunophenotype BM-MSCs因为没有统计上显著的标记的表达水平的差异进行了分析,除了HLA-I的表达的相关性将在稍后讨论。先前的研究已经描述了msc在真皮的存在来源于健康的捐赠者和牛皮癣患者,虽然在某些情况下,一个完整的描述没有执行(23]。例如,一项研究报告的存在multipotential间充质干细胞的包皮,但没有确定CD73的表达,HLA-I, HLA-II或者chondrogenic分化能力的细胞(24]。同样,其他的研究没有分析分化潜力(25,26]。同样,msc在nonlesional报道,perilesional,和lesional地区牛皮癣患者的皮肤,但trilineage分化能力不确定(27,28]。相比之下,另一项研究表明存在msc观察CD105的表达后,CD73, CD90、HLA-DR, CD45和细胞脂肪形成的,成骨,chondrogenic分化能力。作者得出结论,烹饪和msc特征类似于BM-MSCs (29日]。在我们的研究中,我们进行了一个完整的描述的msc从皮肤样品,发现显著差异在其分化能力相比,从大英博物馆msc。

HD-MSCs的分化能力的分析,NLD-MSCs, LD-MSCs显示中间脂肪形成的成骨分化潜能。这是HE-MSCs和NLE-MSCs最为明显,这些分化潜力较低。这些观察结果支持先前的研究哺乳动物的皮肤,报告人口多能成体干细胞,可以只从真皮;这些细胞表达MSC标记,但较低的脂肪形成的特点和chondrogenic比观察MSC分化能力来源于脂肪组织(30.]。取得了类似的结果在人群间叶细胞祖细胞的皮肤,其分化潜能是低于BM-MSCs [31日]。有趣的是,LE-MSCs油红O积极和碱性磷酸酶阳性在lesional更频繁地观察到表皮nonlesional表皮。这一发现可能表明存在炎症刺激刺激迁移或激活lesional msc的表皮。msc分泌营养因素已经被证明有利于组织重构通过激活居民干细胞在组织30.,32]。从这个意义上讲,msc很可能导致不完全膨胀lesional表皮和表皮干细胞的分化,这将导致表皮增厚(14]。在这方面,它已被证明,msc有利角化细胞增殖(33]。

最后,我们观察到HD-MSCs NLD-MSCs, LD-MSCs并没有呈现不同的分化潜能。这些结果支持先前的研究从健康的捐赠者真皮msc和牛皮癣患者获得;作者报道MSC人群中没有差异,分析了(15,34,35]。重要的是,我们所知,这是第一个研究,分析了chondrogenic msc分化能力的获得与牛皮癣皮肤(NLD-MSCs, LD-MSCs、NLE-MSCs LE-MSCs),我们观察到chondrogenic分化的细胞群,我们检查了。

的表达HLA-I NLD-MSCs和LD-MSCs HD-MSCs相比增加了。因为这个结果是观察到即使在NLD-MSCs,这是可能的变更可能导致牛皮癣患者病变的发展。这个假说是由以前的研究报告高浓度的血管内皮生长因子(VEGF),即使在nonlesional皮肤,但这个浓度降低后12周的治疗与肿瘤坏死因子-α抑制剂(27,36]。这些结果表明,在真皮的牛皮癣患者,甚至在一些地区没有明显的损伤,居民msc已经处于激活状态由于促炎细胞因子的存在,如肿瘤坏死因子-α。

HLA-I之间的关系和牛皮癣的发病机制已经建立。然而,尽管如此密切联系,很少有研究分析的模式HLA-I表达式病变本身或在不同的细胞类型,存在于皮肤。迄今为止,一般mRNA分析,特别是HLA-C mRNA,并不意味着健康的皮肤和银屑病皮肤之间的差异(37]。此外,Carlen等人分析了HLA-C表达水平在总蛋白提取和发现高HLA-C表达lesional皮肤比在健康或nonregional皮肤。最高的HLA表达式牛皮癣患者的皮肤主要是观察到免疫细胞和基底膜的渗透38]。本研究支持我们的结果,这显示增加HLA-I表达NLD-MSCs LD-MSCs,并强调的重要性分析HLA-I表达在特定的和孤立的细胞群。

HLA-I牛皮癣的主要作用是目前CD8抗原⁺T细胞(39]。建议的步骤之一在这种疾病的发展涉及承认HLA-I CD8抗原⁺T细胞,不仅在抗原递呈细胞还在角化细胞和其他基质细胞。从这个意义上讲,高HLA-I表达式中发现NLD-MSCs在这项研究中,我们观察到的是很重要的,因为这个事件可能导致更大的由CD8抗原⁺T细胞,从而启动和加剧lesional皮肤的炎症。此外,我们的结果表明,NLD-MSCs影响T淋巴细胞增殖的能力下降而与健康同行。类似的研究结果报道在先前的研究中,作者发现,msc源自牛皮癣患者的皮肤有明显影响扩散比激活PBMCs [15]。

皮肤是机体的第一道防线。先前的报道表明,利用不同的机制来防止病原体进入皮肤;在感染的情况下,皮肤负责安装一个适当的免疫反应,保护和/或恢复组织内稳态(40,41]。可能是因为这样的保护机制,我们观察到在HD-MSCs免疫抑制能力下降与BM-MSCs相比,我们观察到一个更大数量的msc的表皮没有显示免疫抑制能力。然而,这种离散免疫抑制活动有必要维持健康的皮肤,因为作为我们的结果观察,这样的函数是迷失在NLD-MSCs,加上HLA-1表达增加可能诱发银屑病病变的发展。牛皮癣患者皮肤损伤的特点是一个加剧炎症过程,根据先前的报道将有利于msc的免疫抑制活性8]。我们的结果表明,LD-MSCs恢复HD-MSCs中观察到的免疫抑制的能力水平。

总之,我们的研究提出了几个发现可能导致对银屑病的病理生理学(图的理解7)。我们证明NLE-MSCs展示改变形态和增殖能力低,这两个特点,与细胞衰老有关。此外,NLD-MSCs呈现高HLA-I表达式并没有对T淋巴细胞免疫抑制能力;这两个方面可能与抗原表达增加有关,因此,这样的msc可以hyperactivation的初始刺激T细胞和支持银屑病病变的发展。

银屑病皮肤损伤的特点是一个加剧炎症反应(1- - - - - -3]。在这种类型的微环境,MSC招聘可以诱导(8,42),从而促进msc的百分比的增加,随着lesional我们观察到表皮,msc甚至可能显示成骨分化潜能。相比之下,在LD-MSCs HLA-I表达式是维持在高水平和免疫抑制能力恢复到健康水平观察真皮但不增加。因此,这种能力可能不足以解决银屑病病变。IL-17目前被称为银屑病皮肤损伤的主要细胞因子参与开发(43,44),最近被证明可以降低msc的免疫抑制能力(45]。此外促炎细胞因子的存在已被证实在msc刺激分泌营养因素,有利于组织重构(30.]。因此,msc在lesional真皮的存在可能导致不完全膨胀和表皮干细胞的分化;除了免疫抑制能力较低,这些msc可能有利于维护银屑病病变(图7)。

5。结论

我们所知,这是第一个研究分析的存在和生物学特性从lesional msc在真皮和表皮,nonlesional皮肤。我们观察到一个较低的频率nonlesional msc的表皮,和这些文化中所开发的细胞形态学改变和较低的扩散能力。HLA-I表达水平的差异,我们发现在NLD-MSCs LD-MSCs表明这些细胞是参与疾病的发病机理和可能的初始刺激overactivation的T细胞。支持这个想法高HLA-I表达式中观察到NLD-MSCs及其对CD3低免疫调节能力⁺T细胞。总的来说,我们的研究结果表明,在真皮和表皮nonlesional领域,已经有修改msc的生物特性的微环境,这可能有利于牛皮癣患者的病变发展。

数据可用性

immunophenotype形态学、增殖,分化,T细胞增殖数据用于支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

我们值得庆幸的是承认玛蒂娜·弗洛雷斯吉梅内斯的优秀的技术援助和moran。伊格纳西奥·马丁内斯的修订手稿和他有用的评论。这项工作得到了国家科学技术委员会(J.J.M.M. CONACYT,格兰特258205号)和墨西哥社会保障研究所(IMSS,给予J.J.M.M. 1311号)。

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