抗生素杆菌肽保护人类肠道上皮细胞和肠道干细胞瀑样艰难梭状芽胞杆菌毒素TcdB

文摘

杆菌肽是本地应用程序的建立抗生素,抑制革兰氏阳性细菌的细胞壁合成。最近,我们发现了一个完全不同的行动模式的杆菌肽和报道,这种药物可以保护人类细胞中毒的各种医学相关细菌蛋白质毒素包括CDT,二进制的肌动蛋白ADP-ribosylating毒素梭状芽胞杆菌(C。)难相处的。杆菌肽阻止了CDT的运输到靶细胞的胞质,最有可能通过抑制传输函数绑定亚基的毒素。在这里,我们向TcdB杆菌肽的影响,测试的主要毒力因子梭状芽孢杆菌造成严重的梭状芽孢杆菌相关疾病(CDAD)包括pseudomembranous结肠炎。杆菌肽保护人类肠道干细胞瀑样以及人类肠道上皮细胞与TcdB中毒。此外,它阻止了TcdB-induced上皮细胞由肠道上皮细胞的破坏在体外和维护的屏障功能被测量transepithelial电阻(te)。杆菌肽的存在,TcdB无法达到人类上皮细胞的胞质衬底Rac1,最有可能因为其pH-dependent运输穿越细胞膜进入胞质下降了杆菌肽。总之,除了直接对抗生素的活动梭状芽孢杆菌及其对CDT毒素抑制作用,杆菌肽中和外毒素TcdB这个重要的致病细菌。

1。介绍

3 d瀑样干细胞培养技术曾被用于建立人类复杂疾病建模新方法,利用organ-like结构,表现出特定功能的终端分化的组织类型。与单层细胞培养,瀑样干细胞包括所有相关的分化细胞类型的一个特定的器官(1]。使用iPSC-derived瀑样解剖毒性机制和潜在的细菌蛋白质毒素是一种很有前途的临床前药理抑制剂在体外屏幕的新方法治疗毒素抑制剂(2,3]。

艰难梭状芽胞杆菌感染(CDI)感兴趣的主要医疗在西方国家,因为他们导致院内antibiotic-associated腹泻病例(25%4- - - - - -8]。的临床症状梭状芽孢杆菌(CDAD)从轻微腹泻相关疾病危及生命的pseudomembranous结肠炎。梭状芽孢杆菌是一种革兰氏阳性,厌氧细菌孢子形成产生蛋白质毒素,代表高的毒性因子和直接归因于CDAD [9- - - - - -12]。毒素A (TcdA)和B (TcdB)单链毒素进入人体肠道细胞通过受体介导的内吞作用介导的绑定/传输单元(13最后交付他们保持酶的活性单元从酸化endosomal囊泡到靶细胞的胞质(14,15为审查[](16])。那里,酶亚基monoglucosylateρ,Ras-GTPases [17),通过这些中央抑制信号转导分子开关(审查[16])。Rho-GTPases结果的TcdB-mediated抑制肌动蛋白细胞骨架的破坏与几个细胞病变效应包括colonocyte死亡和破坏的肠道屏障功能13]。一些hypervirulent梭状芽孢杆菌菌株产生除了TcdA和TcdB三分之一毒素,二进制CDT (转移酶梭状芽胞杆菌)[18,19]。细胞内酶亚基的CDT mono-ADP-ribosylates G-actin,导致细胞骨架的破坏伴随着微管结构的改变(审查[16])。因为的酶活性梭状芽孢杆菌毒素在人类肠道上皮细胞的胞质是细胞毒性作用的先决条件和与CDAD相关临床症状,具体药理抑制剂,防止人类肠道细胞毒素的毒性作用的发展需要新的治疗选择。

杆菌肽(Bac)是一种建立抗菌药物,能抑制革兰氏阳性细菌的细胞壁合成主题的应用程序,因为它不是有效的再吸收从肠道20.- - - - - -23]。Bac已经临床检测患者的疗效梭状芽孢杆菌全身的腹泻与万古霉素相比。有趣的是,Bac相当于在解决临床症状,但在消除劣质梭状芽孢杆菌。潜在toxin-neutralizing Bac加上劣质的抗生素效价的影响梭状芽孢杆菌对这种现象可能是一个解释(24]。

最近,我们报道了Bac除了其抗菌活性中和各种医学相关细菌蛋白质毒素和人工培养的细胞保护等这些毒素包括二进制毒素中毒的炭疽致命的毒素和肌动蛋白ADP-ribosylating毒素CDT梭状芽孢杆菌(25]。我们发现Bac阻止pH-mediated运输这些毒素的酶亚基endosomal跨膜进入靶细胞的胞质,最有可能通过抑制的基本膜传递函数绑定/传输单元(25]。

在这里,我们表明,Bac保护人类肠道上皮细胞以及人类肠道干细胞瀑样与TcdB中毒。此外,Bac阻止TcdB-induced破坏上皮细胞由肠道上皮细胞在体外和维护TcdB的屏障功能在被测量transepithelial电阻(te)。底层详细分子机制,通过调查我们发现,Bac对TcdB的酶活性,但没有影响减少毒素的pH-dependent运输到靶细胞的胞质,从而TcdB-catalyzed glucosylation的衬底Rac1人类上皮细胞的胞质。

2。材料和方法

2.1。材料

MEM和杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)细胞培养基和胎牛血清(FCS)是来自英杰公司(德国卡尔斯鲁厄)和材料对细胞培养的TPP (Trasadingen、瑞士)。完成®蛋白酶抑制剂是由罗氏公司(德国曼海姆),蛋白质重量标记PageRuler Prestained蛋白质梯子®热费希尔科学公司(美国沃尔瑟姆,MA)。Baf A1和Bac获得Calbiochem(坏Soden、德国),和增强化学发光(ECL)系统是微孔(Schwalbach,德国)。抗体检测nonglucosylated Rac1 [26]来自BD生物科学(美国新泽西富兰克林湖),对G-actin从热费希尔科学Inc .(美国沃尔瑟姆,MA)和次要peroxidase-coupled anti-mouse抗体来自圣克鲁斯生物技术(德国海德堡)。TcdB纯化是描述(13]。

2.2。细胞培养和细胞毒性分析

海拉细胞从DSMZ(德国布伦瑞克)种植在MEM heat-inactivated FCS含有10%,1.5 g / l碳酸氢钠,1毫米丙酮酸钠、谷酰胺2毫米,0.1毫米不重要的氨基酸,在37°C和5%和1% penicillin-streptomycin有限公司₂。写明ATCC®CaCo-2(人类上皮大肠癌细胞腺癌HTB-37™)细胞在DMEM培养包括10% heat-inactivated FCS,丙酮酸钠1毫米,0.1毫米不重要的氨基酸,在37°C和5%和1% penicillin-streptomycin有限公司₂。细胞使胰蛋白酶化和受移植者最多30倍。细胞毒性实验,CaCo-2细胞被播种在培养皿中,在完全培养基孵化。分析其抑制活性,细胞和Bac preincubated 30分钟紧随其后的TcdB并进一步孵化在37°C毒素的Bac的存在与否。根据指定的孵化时间,细胞舍入由各自的活动毒素宿主细胞胞质中特定端点的中毒过程可视化使用蔡司Axiovert 40节能灯倒置显微镜(从、德国)和20 x客观与德国耶拿进步C10 CCD相机(德国耶拿)。圆的百分比,即。,intoxicated, cells were calculated from the pictures.

2.3。sds - page及免疫印迹分析

免疫印迹分析,样本在95°C变性降低样品缓冲和sds - page。之后,蛋白质转移到硝酸纤维素(绘画纸、Dassel、德国),然后,膜的阻碍进行1 h和脱脂奶粉5%磷酸盐(PBS)含0.1% Tween-20 (PBST)。Nonglucosylated Rac1发现通过使用一个特定的抗体Nonglucosylated Rac1 [26)和使用ECL可视化系统根据制造商的指示。

2.4。在体外Glucosylation Rac1从CaCo-2溶解产物TcdA和TcdB

TcdB ( )孵化了Bac(3毫米)30分钟在37°C。然后,整个CaCo-2溶解产物(40μg蛋白)添加和样品(25μl最后卷)在相同条件下孵化为120分钟。这后,样本进行sds - page和涂抹在硝化纤维膜,和nonglucosylated Rac1检测与特定的抗体和发射极耦合逻辑系统。除了确认执行检测G-actin可比蛋白质加载和印迹。因此,吸水后的样品在硝化纤维膜,孵化与anti-actin其次是孵化山羊anti-rabbit免疫球蛋白合进行检测前的发射极耦合逻辑系统。

2.5。分析在TcdB-Treated Rac1 Glucosylation状态的细胞

CaCo-2预培养后细胞被质疑TcdB dose-titration Bac的(3、1和0.3毫米)30分钟在37°C。为控制,细胞不及时治疗或治疗只有Bac(3毫米)。在37°C进一步孵化后,细胞被冻结解冻,洗PBS和细胞溶解和细胞溶解产物被转移到sds - page。随后,nonglucosylated Rac1从这些细胞被免疫印迹检测。证实了等量的蛋白质加载G-actin的检测。

2.6。毒素易位检测穿过细胞质膜

pH-dependent毒素易位TcdB穿过细胞质膜的完整的海拉细胞如前所述执行(14一些修改的实验装置。总之,海拉细胞被preincubated 30分钟37°C的无血清培养基含有200海里bafilomycin A1 (Baf)抑制剂抑制酸化的v-ATPase endosomal腔的细胞,从而TcdB的pH-dependent运输酶域的核内体进入细胞溶质(14]。这之后,结合各自的毒素到细胞表面,细胞被孵化在4°C TcdB (200 ng / ml)。随后,细胞暴露在酸性脉冲(pH值3.8)在37°C到触发pH-driven TcdB膜插入和易位,分别穿过细胞膜进入宿主细胞胞质。在这一步中,酸性介质中含有Bac(1毫米),为了测试效果的Bac TcdB pH-driven膜运输。此后,所有细胞进一步孵化在中性介质含有FCS和37°C 200海里Baf A1。toxin-induced细胞舍入特定的和敏感的端点易位到胞质监测通过显微镜和量化计算圆形细胞显微镜图像的百分比。

2.7。Transepithelial电阻测量

Transepithelial电阻(te)测量由阻抗谱使用CellZScope(卓NanoAnalytics GmbH,德国)作为描述(25]。简而言之, CaCo-2细胞被播种24-well细胞培养插入(Transwell®渗透支持,宠物,0.4μ从康宁GmbH是一家德国威斯巴登)和37°C和5%孵化有限公司₂直到一个支流单层。细胞与Bac preincubated(2毫米)的前30分钟TcdB到上层舱。测量每35分钟的时间进行一次20 h。数据采集和分析进行了使用软件提供的CellZScope (NanoAnalytics,明斯特,德国)。

2.8。分析Glucosylation Rac1地位在人类肠道瀑样

人类使用的材料在本研究伦理委员会批准的乌尔姆大学(0148/2009号)和图宾根大学(638/2013BO1)和符合德国联邦政府的指导方针和赫尔辛基宣言关于伦理原则涉及人类受试者的医学研究。一个健康的志愿者给书面知情同意。iPSC-derived肠道瀑样生成根据既定协议(27]。人类肠道瀑样来自干细胞的插头发孵化在基底膜基质和介质27,28]。中毒实验瀑样进行描述(2]。总之,瀑样被置于24-well盘子。中毒之前,瀑样和Bac preincubated(1毫米)或不及时治疗控制在30分钟37°C。然后,TcdB (60 ng / ml)添加3 h在37°C。洗后,瀑样被释放从基底膜基质,再洗,然后固定在10%蔗糖溶液4% PFA在rt,洗后20分钟,孵化一夜之间在25%蔗糖溶液在4°C,瀑样放在cryomolds,嵌入在10月tissue-tek化合物,并在液态氮冷冻。冻结部分(8μm)是和干一夜之间在rt,补液后,样品被封锁山羊血清(10%),permeabilized (PBS Triton X100 0.2%),和治疗的抗体nonglucosylated Rac1一夜之间在4°C。Fluorescence-labeled二级Triton X100山羊血清抗体在5%和0.1%在PBS添加1 h rt,此外,细胞核被沾染了赫斯特®33342和phalloidin-FITC f -肌动蛋白。荧光图像被范iMic数码显微镜。

2.9。实验和统计的再现性

所有实验都是独立进行至少两次,结果代表实验数据所示。值(在大多数情况下 )计算为 (SD)或平均数标准误差(SEM)个人实验表明使用Prism4软件(美国拉霍亚GraphPad软件)。裁剪西方墨迹显示,污点电池板被削减和重组只用于演示目的。所有相应的蛋白质乐队最初发现在同一膜和x射线胶片。

3所示。结果与讨论

3.1。Bac保护人类肠道上皮细胞与TcdB中毒

由于我们最近观察到Bac中和各种细菌的蛋白质毒素包括CDT,我们分析了Bac是否影响与TcdB人类肠道上皮细胞的中毒。因此,被质疑TcdB CaCo-2细胞的存在和缺乏Bac和TcdB-mediated细胞分析了舍入的特定的和高度敏感的端点监控活动的TcdB这些细胞的胞质。如图1(一)TcdB治疗后,所有的细胞都在Bac保护细胞的细胞毒性效应。Bac本身没有对细胞形态的影响。

证实了这一发现Rac1 glucosylation状态的分析从细胞TcdB没有处理或Bac的存在。图所示的结果1 (b)说明修改的Rac1发现当细胞治疗与TcdB Bac浓度的增加,而Rac1完全修改时细胞对TcdB Bac的缺失。Bac本身没有影响glucosylation Rac1的地位。这个结果显然表明TcdB无法修改Rac1 Bac在场时细胞的胞质。

然而,结果没有提示是否就是如此,因为Bac抑制TcdB-catalyzed glucosylation Rac1的细胞的胞质或催化亚基的摄入TcdB进入胞液。为了解决这个问题,Bac的影响在TcdB-catalyzed glucosylation Rac1进行了分析在体外。为此,TcdB preincubated有或没有Bac然后CaCo-2溶解产物作为Rac1来源和所有必要的辅助因子是补充道。孵化后,nonglucosylated Rac1被免疫印迹检测与特定的抗体,选择性地识别普通的但不是glucosylated Rac1 [26]。Bac没有减少TcdB-catalyzed glucosylation Rac1,强烈表明,Bac防止吸收TcdB催化亚基的细胞溶质,即。,Bac可能干扰TcdB的细胞吸收。

为了验证这个假设,我们分析的细胞吸收TcdB Bac的存在和没有通过执行完善的化验,模仿的“正常”运输TcdB endosomal跨膜附着表面的上皮细胞。总之,TcdB与其受体的结合是通过孵化TcdB在4°C的细胞。在4°C,绑定而不是内化的毒素是可能的。随后,这些细胞被洗除去释放毒素,暴露在5分钟37°C到温暖和酸性媒介(pH值3.8)。这酸性脉冲触发pH-dependent易位cell-bound TcdB穿过细胞质膜的运输,从而催化亚基B细胞溶质,导致toxin-induced细胞进一步孵化后舍入细胞中性和温暖中(图2 (b)黑条),由于抑制细胞溶质的Rho-GTPases TcdB催化亚基的。相比之下,TcdB-treated细胞没有暴露在酸性一步没有围捕(图2 (b),白色的酒吧),表明酸性脉冲触发至关重要cell-bound毒素进入细胞溶质的易位。因此,这显然非常特殊和敏感的端点表示是否TcdB到达细胞溶质的催化亚基。为了防止“正常”的吸收cell-bound TcdB通过酸化endosomal囊泡,bafilomycin A1抑制endosomal酸化是永久地出现在媒体上。

大多数的细胞,这样没有Bac处理,后被轮2 h后的孵化酸性脉冲(图2 (b)黑条)。这是类似的细胞治疗的Bac只有之前和之后,而不是在酸性脉冲(图2 (b)、深灰色酒吧),这表明Bac不贴切地减少TcdB细胞的绑定。然而,当细胞Bac处理只有在酸性脉冲,有显著降低的圆形细胞2和3 h后,表明少TcdB酶活性达到这些条件下细胞的胞质。由于Bac没有酶活性的抑制作用TcdB(图2(一个)),这个结果强烈表明,Bac在酸性脉冲的存在降低了数量的催化亚基的TcdB细胞溶质通过抑制TcdB pH-dependent膜运输步骤。

在最近的一项研究中,我们已经排除,Bac抑制细胞内吞作用的机制(25]。总之,Bac抑制pH-dependent膜易位TcdB催化亚基的,这是根据最近的发现对其他细菌毒素,也提供从酸性催化亚基核内体胞质。

3.2。Bac保护从TcdB CaCo-2单层膜和保留他们的上皮的完整性

表明,Bac保护从TcdB CaCo-2细胞后,我们下一个调查Bac是否还保留CaCo-2单层膜的上皮完整性Transwell室,还代表了一个简化的建立在体外人类肠道屏障的榜样。通过测量transepithelial电阻(te)在一段20 h(图3),很明显,Bac有很强的保护作用对TcdB这个模型。虽然治疗上皮细胞与TcdB单独导致三通的快速下降,表明屏障功能的损失,上皮细胞的t值对TcdB Bac的存在从未经处理的细胞类似,甚至20 h的治疗后,有一个完整的屏障功能。这是特别感兴趣的,因为toxin-induced失去人类肠道屏障功能是CDAD的标志。

3.3。Bac减少TcdB-Induced Glucosylation Rac1和毁灭的f -肌动蛋白在人类肠道瀑样(“Miniguts”)

由于这些结果,我们最终调查的影响Bac在TcdB临床相关的人类“minigut”模式。这些肠道瀑样干细胞与TcdB没有挑战,TcdB, glucosylation Rac1的地位和f -肌动蛋白含量瀑样,两个端点TcdB的细胞毒性作用方式,分析了共焦荧光显微镜(图4)。在瀑样对待TcdB没有Bac,没有明显的信号修改的Rac1表明大部分Rac1细胞的胞质被TcdB glucosylated。此外,只有微不足道的f -肌动蛋白的信号TcdB-treated瀑样,这是解聚反应的失活Rho-GTPases TcdB在这些细胞。f -肌动蛋白的损失是一个主要的原因失去上皮完整性和肠道屏障功能。相比之下,瀑样对TcdB Bac的存在有类似数量的修改的Rac1和f -肌动蛋白比未经处理的细胞。

4所示。结论

总之,一组实验进行演示toxin-neutralizing Bac对的影响梭状芽孢杆菌TcdB在人类肠道上皮细胞和干细胞来自这个重要的人类肠道瀑样梭状芽孢杆菌CDAD毒素,这是一个主要贡献者。结合最近的观察,Bac中和actin-modifying毒素从hypervirulent CDT梭状芽孢杆菌压力(25],结果可能会提供一个起点小说发展的治疗选项CDAD的背景下,特别是因为Bac已经批准的药物在临床使用24]。iPSC-derived肠道瀑样的实现可能会进一步巩固Bac的潜在作用的直接治疗梭状芽孢杆菌全身毒性。

缩写

Bac:	杆菌肽
Baf:	Bafilomycin
C。:	梭状芽胞杆菌
CDAD:	梭状芽孢杆菌相关的疾病
CDI:	艰难梭状芽胞杆菌感染
CDT:	梭状芽孢杆菌转移酶(二进制毒素)
DMEM:	杜尔贝科鹰介质的修改
发射极耦合逻辑:	增强化学发光
FCS:	胎牛血清
iPSC:	诱导多功能干细胞
SD:	标准偏差
sds - page:	十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
扫描电镜:	平均数标准误差
TcdA:	毒素从梭状芽孢杆菌
TcdB:	毒素B梭状芽孢杆菌
te:	Transepithelial电阻。

数据可用性

数据(细胞和瀑样图片,免疫印迹x射线的电影,和测量te)可从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

到了版面设计和监督学习和写的手稿。数据收集的Z.Z.和B.M. L.S.M.M.,和P.P. provided materials, collected data and protocols, and wrote parts of the manuscript.

确认

支持的工作是德国研究基金会(CRC 1279 /项目co2)和PharmCompNet BW (TP巴斯)。Z.Z.和B.M.国际研究生院在分子医学乌尔姆(IGradU)和谢谢IGradU的支持。Stephan菲舍尔博士的帮助下,与“minigut”实验是和善的承认。到了谢谢克劳斯Aktories博士(德国弗莱堡)富有成果的讨论在这个项目的早期阶段。

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