识别的异常表达的基因在大鼠髓核细胞的衰老

文摘

髓核细胞(npc)扮演着至关重要的角色在维持体内平衡的椎间盘(试管)。先前的研究已经发现npc表现出故障由于细胞衰老在圆盘衰老和退化;这可能是试管退化的关键因素之一。因此,我们进行了本研究为了调查改变biofunction和衰老的潜在基因和通路npc。我们分离和确定npc的尾盘(2个月),老少(24个月)SD大鼠和证实了通过SA -衰老表型β加染色。CCK-8化验、transwell试验和细胞划痕实验采用检测两组的增生和迁徙的能力。然后,一只老鼠基因芯片Clariom™年代数组是用来检测差异表达基因(度)。经过严格的生物信息学分析的原始数据,完全,1038个差异表达基因 被确定的23189调查。其中,617是调节和421是表达下调。此外,基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)途径进行了分析和揭示了许多方面的丰富和npc的信号通路与衰老有关。(PPI)蛋白质相互作用网络的度构造用搜索工具(STRING)相互作用的基因数据库的检索和Cytoscape软件。PPI网络模块进行了分析使用Cytoscape MCODE插件。中心发现的基因在Cytoscape CytoHubba插件。派生5基因中心和最重要的——或者表达下调的基因被实时PCR进一步验证。本研究调查了衰老的潜在机制npc在全基因组范围内。照明的npc衰老的分子机制可能协助开发新型生物治疗退行性椎间盘疾病的方法。

1。介绍

下腰痛(LBP)是一个主要的与年龄相关的疾病,不仅有助于患者的痛苦和残疾,也对社会造成大的经济负担1]。椎间盘变性(类)已被证实是一个最基本的病理变化的枸杞多糖(2]。很大程度上由于未知类机制,有效的治疗方法仍需要调查。

传统的治疗策略包括手术和保守治疗旨在缓解症状而不是再生退化盘。因此,生物方法主要集中在结构和功能恢复的试管被认为更有前途(3,4]。椎间盘的结构可分为三个不同的区域:髓核(NP),纤维环(AF)、软骨终板(CEP) [5]。NP是一种凝胶状的组织包含细胞外基质(ECM)包括高度水合蛋白多糖、胶原纤维,aggrecan [6]。它的生理功能起着至关重要的作用在维护试管因为NP可以吸收压力试管时,面对不同的机械冲击(7]。髓核细胞(npc)瀑特异性细胞位于髓核(8]。npc负责ECM代谢体内平衡的生产胶原蛋白,胶原蛋白II,和蛋白多糖的凝胶状结构的主要组件NP (9]。在试管的衰老和退化,npc的正常功能是中断,从而导致ECM的异常代谢,加速的过程类(10,11]。Cytotherapy被激活退化npc提出了一个理想的生物治疗方法治疗类(11]。然而,人大变性的具体机制仍然未知,阻碍了cytotherapy的发展。

细胞衰老是定义为一个细胞程序,导致稳定增长逮捕以及不同的表型改变和表示senescence-associated分泌表型(SASP) [12,13]。椎间盘细胞衰老已被广泛接受为试管退化和老化的主要因素之一(14,15]。NP的活细胞数量减少,和npc被受损的细胞功能随着年龄的增长,最终导致生物力学失败和退化的试管(15,16]。历史上有两种形式的衰老:一是复制衰老缩短端粒长度有关;另一个是压力诱导过早衰老由多种环境刺激诱导(17,18]。其中,时间积累的细胞复制和复制衰老被认为是更多的与衰老有关19]。积累的研究集中在振兴岁npc通过阻止衰老(11]。然而,小进步取得了由于不清楚潜在的npc监管者或衰老的机制。因此,阐明主要的监管机构和npc衰老的机制将有助于我们更好地理解试管衰老和退化的发病机制和可能说明一个新的治疗目标,5岁的恢复。

基因微阵列技术可以同时分析成千上万个基因的表达水平的差异从预定义组样本20.]。它也有高效的优势评价整个全基因组表达的变化(21]。这项技术为研究人员提供了一个新颖的观点更深入地调查不同疾病的机制。虽然NPC的衰老起着重要的作用在类,然而有有限数量的研究,关注异常表达基因在人大老化。

因此,本研究的目的是调查mRNA表达的异常和信号通路在人大老化的微阵列分析方法和生物信息学分析。我们也比较了年轻人和老年人之间的迁移能力npc因为降低试管迁移细胞可能成为另一个试管再生潜力下降的重要原因。这些分析有助于阐明npc的衰老机制,这有助于识别的关键因素需要恢复npc类患者的影响和促进cytotherapy在类。

2。材料和方法

2.1。道德的声明

实验过程描述的打击都是实验动物伦理委员会审查和批准的解放军总医院的第六个医疗中心,北京,中国,按照指导方针和有关规定进行。

2.2。隔离和npc的文化

12 Sprague-Dawley (SD)老鼠参与这个实验,根据他们的年龄分为两组:年轻组( ,2个月大)和旧组( ,24个月大)。24-month-old老鼠被定义为老组根据一项研究[22]。然后,他们牺牲的腹腔内注射5毫升10%水合氯醛。浸泡在70%乙醇后1 h,尾骨的NP组织(C3-C7)每个老鼠收集的眼科手术器械无菌解剖显微镜下。与PBS洗了三遍后,收获NP组织机械碎和消化0.2%胶原酶II (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在杜尔贝科的修改鹰中低葡萄糖(DMEM-LG, Solarbio科技有限公司、北京、中国)4 h。悬架是离心机在1000转/分钟5分钟。暂停的解决方案是丢弃,和球团resuspended标准包含DMEM-LG培养基,10%的边后卫(Gibco BRL,宏伟的岛,纽约,美国),和1% penicillin-streptomycin(美国Hyclone)。最后,颗粒细胞培养在25厘米²细胞培养瓶在37°C和5%湿润孵化器有限公司₂。培养基是每两天更换一次。当细胞融合达到70 - 80%,他们收集使用0.25% trypsin-EDTA(美国Gibco)和亚文化在1:3;细胞通道2被用于实验。

2.3。细胞表型鉴定

确定年轻和年老npc的细胞表型,一系列的表面标记被检测到。收集两组的npc P2和resuspended冷PBS的浓度 细胞/毫升。然后,100年μl细胞悬液与CD34-PE抗体孵化,CD24-FITC, CD29-PE, CD45-FITC, CD90-PerCP-Cy5.5 (Abcam、剑桥、马、美国)30分钟在黑暗中在4°C。然后,细胞被洗两次,500年resuspendedμl PBS。最后,定量分析每个样品的表面标记物的表达进行使用FACSCalibur系统(美国BD FACScan)。

2.4。Senescence-Associatedβ牛乳糖(SA -β加)染色

npc培养80% -90%融合时,SA -β加染色(Beyotime生物技术研究所、中国)进行分析的速度衰老细胞年轻和年老组根据制造商的协议。简单地说,细胞被PBS洗了三遍,然后用固定剂固定解决方案在RT 15分钟,用PBS洗两次,沾包含SA -半乳糖苷β加工作解决方案在一夜之间在37°C没有有限公司₂。荧光显微镜下量化分析确定的平均百分比总SA -β-gal-positive 5随机选择领域的每一个细胞。

2.5。细胞计数Kit-8扩散试验

比较年轻和年老npc的扩散能力,P2细胞被镀在96孔板1000细胞/好,培养在标准中含有10%的边后卫1,3,5,7,9天。在每个时间点,媒介被混合解决方案包含100所取代μl新的媒介和10μl CCK-8试剂。在湿润孵化器孵化后37°C和5%的公司₂4 h,每个样品的吸光度为450 nm使用标仪(型号680,Bio-Rad实验室株式会社日本东京)。

2.6。细胞划痕实验

年轻和年老npc被播种在6-well盘子的浓度 细胞/毫升。增长到100%融合后,平行的划痕是底部的6-well板200毫升移液管小费。无血清培养基的悬浮细胞被冲洗掉,观察划痕的宽度和照片在0 h和24小时在一个光学奥林巴斯显微镜。细胞的迁移决定通过测量使用ImageJ软件伤口边缘之间的距离。每组三个不同区域测量,平均距离计算进行分析。

2.7。Transwell化验

年轻和年老npc的迁移能力评估transwell细胞培养(孔隙大小8μ美国康宁m),这些腔插入24-well盘子。众议院充满了600毫升中有10%的边后卫和参议院包含150μl的DMEM和 细胞。24小时后,媒体在两院被移除和nonmigratory细胞在参议院被一个棉签轻轻擦拭掉。以4%的多聚甲醛固定后,迁移的细胞在下院沾0.1%结晶紫在室温下30分钟。然后,细胞穿越膜计算在光学显微镜下三个随机选择的领域(奥林巴斯光学有限公司,日本东京)在100 x放大。

2.8。RNA提取和质量控制

融合后增长到90%,年轻和年老的npc组处理试剂盒。然后,核糖核酸酶的总RNA提取和纯化设备(Bio-Rad、钙、美国)。派生的mRNA的质量是由分光光度计测量(nanodrop - 1000,热科学、马、美国)。信使rna和DNA完整性污染被琼脂糖凝胶电泳检测(结果见补充材料(可用在这里))。

2.9。微阵列分析

RNA从年轻和年老npc杂交获得鼠GeneChip Clariom™年代数组从Affymetrix公司。微阵列杂交和扫描的程序进行根据整个成绩单(WT)表达阵列Affymetrix公司的用户指南。短暂,在调查的过程中设置信号集成、背景校正,和分位数正常化,这些文件都被转移到Affymetrix转录组分析控制台软件分析差异表达基因(度)。阈值设置为- - -表达下调的基因 和 。基因表达数据已经上传到NCBI综合(GEO)和可以通过访问地理系列加入[GEO GSE126883):https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE126883)。

2.10。功能和KEGG通路富集分析

数据库的注释、可视化和综合发现(大卫,http://david.abcc.ncifcrf.gov/)是一种基因功能分类实施,提供一套功能注释工具进行调查分析基因的生物学作用和执行(基因本体)和KEGG(京都基因和基因组的百科全书)通路富集度的分析。功能和通路的浓缩,表达下调度使用大卫数据库进行分析。一个 和 被认为是截止条件。

2.11。PPI网络建设和模块分析

功能PPI分析解释关键细胞的分子机制至关重要的活动。检索的搜索工具相互作用基因(字符串,https://string-db.org/)数据库采用获得PPI度的关系。简单地说,度上传到数据库的字符串,评分结果的相互作用是超过0.7(高信心)在Cytoscape可视化软件。此外,重要模块检测通过MCODE(分子复杂的检测)插件Cytoscape构造基于PPI网络的标准 , ; ,和 。去得分最高的功能和KEGG通路富集分析模块进行了使用大卫。

2.12。基因鉴定中心

Cytoscape软件应用于分析中心的基因,与许多重要节点互动合作伙伴。我们利用CytoHubba插件Cytoscape找到中心基因和使用六个计算方法:学位,EPC,怪癖,MCC,瓶颈和跨国公司。使用这六个算法交叉基因推导表示与重要的生物监管职能重要候选基因。这些基因中心进一步由大卫和KEGG通路富集分析使用数据库。

2.13。实时聚合酶链反应

验证芯片结果,推导出5基因中心和最重要的——或者表达下调基因选择实时PCR验证。简而言之,互补DNA(互补)被反向转录合成使用Quantscript RT工具包(TianGen生物技术,中国)根据制造商的协议。然后,派生的互补是定量实时PCR (qPCR)使用SYBR预混料交货Taq™(Tli RnaseH +;豆类生物,大津,日本)珀尔帖热循环(Bio-Rad实验室株式会社、东京、日本)的最终反应体积20μl。互补放大40周期。GAPDH被选为内部控制计算目标基因的相对表达的2^{- - - - - -ΔΔCT}方法。所有反应进行了一式三份,使用的引物序列如表所示1。

2.14。统计分析

所有的数据都表示为 。组之间的比较分析是由独立的样本 - - - - - -通过SPSS 20.0软件测试来确定显著差异(美国芝加哥IL)。枚举数据采用卡方检验。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。年轻和年老的Immunophenotypes npc

npc被成功分离大鼠髓核组织。P2年轻一代的npc表现出小的特点,spindle-like形态,丰富的细胞质中含有大卵圆形和突出的核仁。老npc更相对圆形和多边形平面形态(图1(一))。

选择一系列的细胞表面抗原检测细胞表面标志的年轻和年老npc (23,24]。两组的npc高CD29, CD90 CD24阳性(数字1 (b)和1 (c))。然而,CD24的表达显著低于旧组比年轻组( )。积极的利率CD29年轻组( ),CD90 ( ),和CD24 ( )。积极的利率在旧组CD29 ( ),CD90 ( ),和CD24 ( )。npc都负CD34造血干细胞标记( 年轻组 老组)和CD45 ( 年轻组 在旧的集团)(数据1 (b)和1 (c))。

3.2。β牛乳糖(SA -β加)染色和体内增殖和迁移能力下降

β牛乳糖(SA -β加)染色是一个敏感的测量来检测衰老细胞,结果显示更高的旧组(阳性染色细胞百分比 )比年轻组( )( )(数据2(一个)和2 (b))。评估年轻和年老的扩散npc, CCK-8化验。结果显示旧的npc早期进入高原期约。7天之后最初文化和年轻的npc才进入增长高原文化(图9天2 (c))。迁移能力评估通过transwell试验和细胞划痕试验。transwell化验结果显示减少迁移细胞数量在旧组( )较年轻组细胞( )( )(数据2 (e)和2 (f))。量化后的迁移面积百分比的24小时的年轻组(41.02±6.13%)高于旧组( )( ),显示旧的npc(数据的迁移速度下降2 (d)和2 (g))。因此,我们的研究结果清楚地表明一个戏剧性的减少衰老期间npc的增生和迁徙的能力。

3.3。差异表达基因的识别

检测分子因素参与人大老化,我们执行芯片杂交与RNA NPC的年轻和年老组。共检测到1038个差异表达基因(度),包括617个调节基因和421个表达下调基因。表达的调节基因是指增加老npc。火山的阴谋策划的度两组根据基因表达值(图3)。所示的层次聚类热图补充材料。最大的调节激肽原基因1 ( ),其次是lipocalin 2、调节和EGF-containing fibulin-like细胞外基质蛋白1,调节。最伟大的表达下调基因periostin ( ),其次是神经regeneration-related蛋白质,表达下调,dermatopontin,表达下调。前十,和表达下调基因如表所示2和3。

3.4。度的功能和KEGG通路富集分析

的功能,表达下调度进行评估,大卫。方面的分析表明,生物过程(BP),调节基因主要是富含脂多糖和有机环状化合物反应和负调节细胞增殖(表4和图4)。表达下调的基因主要富集在细胞粘附,内皮细胞分化,骨化(表5和图5)。细胞的组件(CC)、调节基因主要富集在细胞外空间和细胞外的外来体(表4和图4)。表达下调基因主要富集在细胞外基质和基底膜(表5和图5)。的分子功能(MF),调节基因主要富集在肽链内切酶抑制剂活性和转录激活活动(表4和图4),而表达下调基因主要富集在细胞外基质的结构成分和钙离子绑定(表5和图5)。

KEGG路径分析表明,36通路的调节基因丰富;最重要的途径是肿瘤坏死因子信号通路,和五大重要途径如表所示4和图4。19通路的表达下调基因丰富;其中,最重要的途径是ECM-receptor交互,五大重要途径如表所示5和图5。

3.5。PPI分析和基因筛查中心

基于字符串的信息数据库,PPI网络包含311个节点和696个边缘参数包括一个最低要求交互 (高信心)建成使用Cytoscape软件(图6(一))。然后,网络节点的分析通过插件MCODE标准 的数量和 。最后,选择三大模块(数据6 (b)- - - - - -6 (d))。KEGG途径丰富的基因在得分最高的模块(6.276分)是肿瘤坏死因子信号通路,PI3K-Akt信号通路,cytokine-cytokine受体相互作用;的生物学过程主要富集在细胞反应的有机物质,骨骼肌细胞分化、炎症反应(表6)。然后,我们发现网络中枢纽基因。运行CytoHubba插件后,有5中心发现的基因6计算方法(学位,EPC,怪癖,瓶颈,MCC,和跨国公司)。结果列在表中7。6最重要的基因趋化因子(C-X-C图案),配体1(处于),早期生长反应1 (Egr1) FBJ骨肉瘤癌基因(Fos)提交,胰岛素样生长因子1 (Igf1), prostaglandin-endoperoxide合酶2 (Ptgs2)。此外,我们去执行和KEGG浓缩分析基因中心的大卫。这些中心基因主要富集在肿瘤坏死因子信号通路在癌症(表和途径8)。主要去脂多糖生物过程在反应和对糖皮质激素的反应(表8)。

3.6。验证基因中心的实时PCR

来验证芯片结果的日期,我们选择了5个中心基因和最重要的——或表达下调的基因实时PCR分析。结果显示,与微阵列数据一致。基因芯片分析表明这些信使rna调节(处于)2.643倍,5.429倍(Fos)提交,2.386倍(Igf1), (Egf1), 2.369倍和3.748倍(Ptgs2)。rt - pcr结果表现出处于受控的表达 ),安全系数( ),Igf1 ( ),Egf1 ( ),和Ptgs2 ( )老组显著增加了3.8倍,4.36倍、2.39倍、3.04倍和3.27倍,分别。periostin的表达( )老组是-12.7倍的价格相比年轻组,和激肽原1的表达(P< 0.05)在旧组12.4倍的价格相比年轻组。rt - pcr结果符合微阵列数据的结果。结果如图所示7。

4所示。讨论

细胞衰老是一个重要的致病因素(12,17]。npc随着年龄的衰老密切相关,试管衰老和退化的变化(7,10,11]。在这项研究中,我们比较差异表达基因的生物功能和分析年轻和年老NPC人大衰老期间发现潜在的治疗目标。这项研究在临床上治疗类,因为有一个重要的价值的关键调控基因在全国人大衰老可以操纵激活衰老NPC。是不必要的孤立的npc组织侵入性操作,病人可能只需要接收分子恢复npc,然后可以开始自我修复过程。

识别孤立的年轻和年老的表面表型npc,采用各种表面标记检测根据先前的研究23- - - - - -25]。CD24是glycosylphosphatidylinositol-anchored细胞表面的蛋白质,被定义为一个健康的标志npc Risbud et al。23]。唐等人发现了一个强烈的CD24表达在人类NP青少年组织,和它的表达会随着年龄的增长而下降(26]。虽然物种在这个研究与以往的研究不同,我们还发现CD24旧npc的表达显著降低比年轻的npc。这一结果表明,CD24可能作为人大衰老的标志。我们进一步发现CD90的表达,这是一个cell-surface-anchored糖蛋白中发现许多种类的干细胞/祖细胞(27]。在目前的研究中,CD90老少皆npc中高度表达。然而,唐等人发现CD90只是表示在房颤细胞和可能作为non-NP标记大鼠(14]。我们认为这可能是由于在他们的研究中使用的不同的隔离方法。之前莫利诺等人的研究发现,npc高度表达CD29, Brachyury低表达CD34、CD45、CD146 [24]。在我们的研究中,CD34、CD45的表达低于5%的年轻人和老年人群体,这表明没有hematopoietic-lineage细胞的污染。无论是年轻的或年老的npc可以高度表达CD29(> 95%),和它的表达在年轻和年老npc发现没有区别,这是与之前的研究一致(24]。

然后,我们比较年轻和年老npc的扩散和迁移能力。增长的下降与年龄相关的动力学为npc之前被报道。宋等人发现,人类npc年轻患者有更高的增殖能力和更少的SA -β加染色百分比比旧的28]。符合上述研究,我们的研究也显示旧的npc的扩散能力减弱。我们进一步调查年轻和年老npc之间的迁移能力,结果显示,在旧的npc拒绝迁移能力比年轻的npc。因此,根据上面的组合结果,我们建议npc的增生和迁徙能力下降是两个试管老化的关键过程。

在目前的研究中,我们进一步揭示了年轻人和老年人之间的度npc。中表达下调的基因,periostin最显著改变基因。以前的研究已经表明periostin能调节多种细胞的增殖和分化等牙周韧带间充质干细胞(29日,30.),骨骼干细胞(31日,脂肪干细胞(32,33]。此外,periostin可能与结构的胶原蛋白相互作用,从而影响ECM在当地组织的机械结构(34]。埃格伯特等人发现periostin有助于适当的胶原蛋白功能和皮肤老化期间表达下调,表明一个重要的角色的periostin调节胶原蛋白的功能(35]。先前的研究发现,periostin也被表达在人类和老鼠试管和关联的类,因为它结合了ECM组件如纤连蛋白、tenascin,胶原蛋白V和相关等炎性细胞因子il - 4的表达和肿瘤坏死因子-α(36]。然而,蔡出版社报道的增加表达periostin试管细胞在类,这是矛盾与我们的结果37]。我们认为这是因为他们的模型代表快速试管的损伤,从而刺激periostin表达调节ECM的结构。细胞的反应环境的变化可能会随着年龄的增长而下降,因此periostin的差别显示对这些npc。与我们的假设一致,Graja出版社报道,periostin损失发生在脂肪组织老化密切相关的老年性改变脂肪组织细胞外基质(32]。此外,杜尚de Lageneste出版社发现干细胞在骨膜骨的骨再生潜力取决于periostin [31日]。因此,移植的方法表达periostin可能逆转衰老期间npc的故障。属于高表达基因,激肽原1是最高的一个。激肽原1被发现在许多病理生理条件,如关节炎(38和炎症性肠病39]。虽然没有文献报道的激肽原协会1,5老化,激肽原1与衰老的关系在其他组织已经承认40,41]。此外,戴出版社报道,裂解激肽原发病可能会加速内皮祖细胞衰老的激活ROS-p38 kinase-p16INK4a信号级联(42]。因此,激肽原1对人大衰老可能有相似的影响。

调节基因的功能注释是由去KEGG途径分析。有趣的是,前5名充实的包括英国石油(BP)对脂多糖(BP: 003249),负调控细胞增殖(BP: 0008285),和应对缺氧(BP: 0001666)。大量的文献报道,脂多糖可以诱导试管的炎症反应;因此,对脂多糖的生物过程表明炎症在人大衰老的一个重要的角色43]。此外,缺氧和炎症是两个重要的特点的环境退化试管(44];因此,这些结果强调了当地环境的人大衰老至关重要的作用。此外,最重要的信号通路调节基因包括肿瘤坏死因子信号通路(KEGG: rno04668) PI3K-Akt信号通路(KEGG: rno04151)和途径在癌症(KEGG: rno05200)。肿瘤坏死因子信号通路被公认的重要调节器中炎症级联类(45,46]。因此,我们的研究结果表明,旧的npc的生物学功能可能受到恶劣条件的影响微环境存在的试管。中表达下调的基因,功能性浓缩的英国石油公司主要富集在细胞粘附(BP: 0007155), cell-matrix粘连(BP: 0007160),内皮细胞分化(BP: 0035987)。通路富集分析主要是ECM-receptor交互(KEGG: rno04512)和粘着斑(KEGG: rno04510)。有趣的是,这些结果是符合我们的细胞实验结果显示旧的npc拒绝迁徙的能力。因此,这些结果表明老npc的迁徙能力下降。

我们进一步分析了基因在PPI网络中心6计算方法。所有派生5中心基因(处于受控,Egr1, Ptgs2、安全系数和Igf1)是调节在旧的群。我们进一步进行实时PCR验证芯片结果。结果显示一致的与微阵列表达趋势。处于受控,Egr1 Ptgs2已报告在试管现有组织和揭示与免疫应答和炎症关系密切。(47- - - - - -49安全系数是研究癌基因。据报道,安全系数存在椎间盘突出组织而不是健康的盘(50]。此外,最近的一项研究表明,安全系数可以调节的转录Sox9, cfos-Sox9轴对首席财务官的角色至关重要的感应chondroblastic骨肉瘤(51]。考虑到SOX-9也是一个重要的标志髓核细胞,首席财务官的角色在npc的规定老化需要深入调查。Igf1是一个生长因子激活已知矩阵的新陈代谢。Igf1也被发现与类[有着密切的关系52]。先前的研究描述,软骨细胞的响应性IGF-I随着年龄下降(53]。奥田硕出版社发现IGF-I绑定蛋白的表达增加的差别(IGFBPs)和对这些IGF-I受体可能是体内的两个关键机制停止响应igf - 1 (54]。因此,我们假设调节igf - 1的表达可能是旧npc补偿反馈。我们还去KEGG派生分析中心执行基因。结果表明,肿瘤坏死因子信号通路在脂多糖丰富,这是符合去KEGG调节基因的结果。

度的三个最重要的子提取从PPI网络MCODE分数≥4。走后的功能和KEGG通路富集分析度得分最高的模块,这个模块的基因与细胞反应相关的主要是有机物质(去:0071310),骨骼肌细胞分化(去:0035914)和炎症反应(去:0006954)。肿瘤坏死因子信号通路的通路富集(rno04668)和PI3K-Akt信号通路(rno04151),这也进一步说明了这两种途径的重要性在人大老化。

本研究有一些局限性。首先,很多RNA探针在微阵列分析和发现这个有限的基因芯片的验证结果。因此,我们只有解释基于之前的研究结果和我们的利益。据报道,NP由小的混合物位于间质细胞和大notochordal-derived细胞(26]。在成熟的NP组织,notochordal细胞逐渐消失,取而代之的是小fibrochondrocyte-like细胞(8]。然而,收获细胞在本研究中主要是fibrochondrocyte-like年轻和老组,这是不同的细胞形态学notochordal细胞(大量液泡)的特征。文化的方法在本研究中是一个单层与常氧条件,这可能很难保持notochordal的表型细胞的表型notochordal细胞离体培养后会很快消失。以来最优培养条件notochordal细胞表型的维护仍在调查中,我们的研究可能只代表人大衰老的机制的一部分。另一个限制在常氧文化存在的条件。缺氧是试管的特点之一。先前的研究表明,基因表达的npc可以变更由于文化常氧条件55]。因此,缺氧和三维文化可能更适合保持npc的表型。

5。结论

综上所述,我们发现旧的npc显示拒绝增殖和迁移的能力。此外,我们发现一系列的分子途径,有助于通过微阵列分析人大衰老和退化。需要进一步的研究来阐明下游机制的潜在目标。这些衰老过程的理解机制可能导致小说突破的预防和治疗椎间盘老化和老龄化带来的退化。

缩写

NP:	髓核
试管:	椎间盘
rt - pcr:	实时聚合酶链反应
SA -β加:	Senescence-associatedβ牛乳糖
FITC:	异硫氰酸荧光素
体育:	藻红蛋白
EPC:	边缘扩散组件
世纪挑战集团:	最大集团中心
跨国公司:	最大邻域组件。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果中包括文章和补充材料。基因微阵列基因表达数据集已经上传到NCBI综合(GEO),可以通过访问地理系列加入[GEO GSE126883):https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE126883)。其他相关数据生成和/或分析在当前研究可从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

时程和李Xiaochuan构思和设计实验。程,给贾,Yachao赵执行实验,分析数据,写的手稿。Linghan林实验提供帮助和建议。王熟食店和岩脉阮监督的整个过程研究的准确性和遵守制度规定。豫章修改了手稿。所有作者讨论的结果和评论手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81470102和81470102)和北京大学深圳医院的研究经费(JCYJ2019003RC)。

补充材料

热图和层次聚类之间的度剖面比较年轻和年老npc。红色表示高表达,绿色表示低表达。每一列代表一个组织样本,每一行表示一个信使rna探针。Z641、Z643 Z642旧组样本;Z644、Z645 Z646年轻组的样本。(补充材料)

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