肠道微生态学的特点在间充质干细胞治疗小鼠急性肝损伤

文摘

背景。间充质干细胞(MSC)移植的机制来防止急性肝损伤肝中已得到充分的研究。然而,在此过程中相关的肠道菌群的变化了解甚少。方法。在这项研究中,紧凑bone-derived msc后被注入小鼠四氯化碳(三地₄)管理。MSC的潜在疗效评估的存活率和生化和病理结果。总体微生物群落的结构变化和肠道菌群的变化评估排序16 s rRNA盲肠和结肠的扩增子库的内容。结果。msc显著降低血清天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶水平和改善组织病理学和存活率。低表达和不连续的染色zonula occludens,以及紧密连接中断,CCl中观察到₄治疗小鼠在48小时而MSC-transplanted老鼠。此外,MSC移植肝脏导致肠道菌群的变化反映在减少大量的拟杆菌门S24-7和类杆菌,增加了大量的厚壁菌门梭菌属的,Ruminococcaceae,乳酸菌CCl的价格相比在初始时间点₄治疗的老鼠。此外,系统调查社区的重建未被注意的状态(PICRUSt)基于绿色煤电数据库显示功能生物标志物MSC-transplanted老鼠参与细胞运动、信号转导、膜运输、转录,和脂质代谢,辅因子、维生素、萜类化合物、多酮类化合物,以及外源性物质。结论。厚壁菌门和拟杆菌门比最初的改变,导致了从MSC注入到肝脏,维持肠粘膜生物学和肝脏修复体内平衡,可能是有益的。

1。介绍

的移植间充质干细胞(msc)演示了各种模型的保护作用器官损伤(1,2),包括CCl四氯化碳(₄-)诱导急性肝损伤(3),这意味着msc可以治疗有效4- - - - - -6]。然而,保护机制还没有完全定义。CCl msc可以预防₄全身急性肝损伤被区分成hepatocyte-like细胞(7由一个抗氧化的过程[],8),或通过旁分泌细胞因子的分泌,包括白细胞介素- 10”(3),而细胞外囊泡(9),包括液(10]。因为急性肝损伤削弱肠道黏膜结构和紧密连接(套)11,12),导致细菌易位和门户内毒素可以作为分摊的肝毒性机制(13- - - - - -15),我们认为msc的疗效可能涉及微生物群变化,促进屏障的完整性。

信号从肠道微生物群与维护有关健康的主机功能和各种疾病,包括非酒精性脂肪肝病/非酒精性脂肪肝炎(非酒精性脂肪肝(NASH), 1/2型糖尿病、肥胖、炎症性肠病,和自闭症16]。肝脏疾病、微生物生态失调,暴露出肠道粘膜细胞潜在有害物质,包括肠道细菌病原体(17),脂多糖(LPS)和木糖醇,以及分泌细胞因子(例如,肿瘤坏死因子-α)[18),可以扰乱套和肠道通透性增加,使肝脏可能促炎的细菌的产品可以促进肝脂肪变性(19,20.]。然而,肠道微生物群的作用在MSC治疗急性肝损伤仍是未知的。这是第一个研究揭示肠道微生物及其相关途径,以及肠道上皮套,CCl MSC治疗₄全身急性肝损伤。

2。材料和方法

2.1。动物

八周大的雄性野生型C57BL / 6小鼠(重量、20 - 25克)(上海SLAC实验动物有限公司、上海、中国)被用于诱导急性肝损伤,和天生的枚绿色荧光蛋白(GFP)两星期的转基因小鼠(C57BL / 6背景的男性和女性,南京南京大学生物医学研究所,南京,中国)被用于msc的隔离和文化。野生型C57BL / 6小鼠被安置在屏障环境中,和绿色荧光蛋白转基因小鼠被安置在一个绝缘环境。所有的动物收到人道关怀,所有程序都是动物保护伦理委员会批准第一附属医院,浙江大学。

2.2。细胞

鼠标msc的隔离和文化从密质骨进行如前所述[21]。细胞培养的MSC介质(OriCell™C57BL / 6 MSC完全培养基;Cyagen生物科学、广州、中国在37°C)有限公司5%₂孵化器(HERAcell®150;热费希尔科学Inc .,沃尔瑟姆,美国马)。从5和7段落使用msc整个实验。注入msc的表型和multipotential分化调查(补充图S1在线)。

2.3。创新领导力₄全身急性肝损伤和样本收集

CCl的解决方案₄(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)和橄榄油的比例(Sigma-Aldrich) 1: 1和剂量的3毫升/公斤体重管理腹腔内(i.p)在一个单一的剂量。控制老鼠管理ip注入同等体积的橄榄油(3毫升/公斤)。接下来, msc在100年μL的磷酸盐(PBS)或100年μPBS的L通过尾静脉注入小鼠CCl后6 h₄管理。

老鼠被腹腔注射4%水合氯醛麻醉(Sangon生物科技、上海、中国)的剂量10μL / g体重,血液样本来自的下腔静脉48 h, 1周(w), 2 w CCl之后₄管理。放血后,肝脏、小肠段,盲肠和结肠内容是精确的解剖和收获,液氮快速冻结,储存在-80°C,直到进一步的分析。的部分肝脏和回肠立即固定在10%中性缓冲福尔马林病理组织检查。

2.4。肝脏生化和肠道和肝脏组织学

组织病理分析,formalin-fixed肝脏和回肠标本石蜡包埋,切片(5μ米厚度),与苏木精和伊红染色。的部分被随机编号前阅读和观察到一个有经验的病理学家。图像获得使用NanoZoomer 2.0 rs扫描仪(滨松光子学KK,日本滨松市)配备扫描仪软件。终端原位dUTP尼克结束标记(TUNEL)染色(罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国)执行根据制造商的指示和复染色4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的血清样本测量使用干化学分析仪(富士DRI-CHEM 4000 ie;富士胶片公司(日本东京)根据制造商的指示。

2.5。实时定量聚合酶链反应

从回肠组织总RNA分离使用试剂盒试剂(美国生命技术公司,卡尔斯巴德,CA)。1的互补脱氧核糖核酸合成μ使用QuantiTect g的总RNA逆转录工具包(试剂盒、希尔登,德国)。实时定量聚合酶链反应(qPCR)都使用了ABI 7500实时PCR系统和SYBR预混料交货Taq™II工具包(豆类生物有限公司、志贺、日本)根据制造商的指示。寡核苷酸引物对小鼠zonula occludens -(佐薇)1 (5 - - - - - -ACTCCCACTTCCCCAAAAAC-3和反向5 - - - - - -CCACAGCTGAAGGACTCACA-3 )和β肌动蛋白(前5 - - - - - -ACAGGCATTGTGATGGACTC-3和反向5 - - - - - -ATTTCCCTCTCAGCTGTGGT-3 )被Sangon生物技术合成。

2.6。免疫荧光分析ZO-1

Formalin-fixed,石蜡包埋部分回肠deparaffinized,加热在柠檬酸缓冲(pH值6.0;武汉Goodbio科技有限公司,武汉,中国),和阻塞PBS含有5%牛血清白蛋白(Sangon生物技术公司)在室温下30分钟。部分与初级孵化兔anti-ZO-1抗体(1:400;英杰公司生活技术,卡尔斯巴德、钙、美国)在一夜之间在4°C。随后,部分被孵化与Alexa488-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 50;英杰公司生命技术)在室温下60分钟,和核复染色与4 ,6-diamidino-2-phenylindole为2分钟。被检查的部分使用共焦显微镜系统(蔡司lsm - 710;德国卡尔蔡司AG)从)。图片是使用禅宗2012软件。

2.7。透射电子显微镜法

回肠样本立即固定使用2.5%戊二醛(Sangon生物技术)和保持在4°C 2 - 4 h,紧随其后的是有1%锇酸固定在0.1 M磷酸盐缓冲剂(PB;pH值7.4)在20°C 2 h与分级和脱水酒精系列(50、70、80、90、95、100和100%,每15分钟)。最后,样本渗透与1:1丙酮和SPI-Pon 812一夜,一夜之间嵌入SPI-Pon 812环氧树脂。超薄部分(60 - 80 nm)沾2%醋酸双氧铀,其次是柠檬酸铅15分钟,和观察到的透射电子显微镜(TEM;Tecnai G²F20 S-TWIN;范、Hillsboro或美国)。

2.8。细菌DNA测序

均化后的小鼠盲肠和结肠内容Precellys 24均质器中使用玻璃珠(贝尔坦公司技术、Montigny、法国),细菌的DNA提取使用QIAamp DNA凳子迷你包(试剂盒)。引物319 f (5 - - - - - -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3 )和806 r (5 - - - - - -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3 )被用来放大16 s rRNA的V3-V4域(rRNA)基因。PCR进行如前所述[22]。循环参数如下:30年代在98°C的变性,紧随其后的是30 15秒的周期在98°C,退火为15秒58°C,和伸长15年代在72°C,最终扩展为60年代在72°C。扩增子接受了正常化,池,焦磷酸测序使用Illumina公司Miseq桌面编曲( bp paired-end运行)。

1.9.0 QIIME(版本,http://qiime.org)被用来执行顺序读取处理,质量减少,多路分解和分类任务(23]。α多样性,包括香农的索引,辛普森、系统发育多样性——(PD)整个树,Chao1,使用QIIME和观察到的物种,是计算。加权UniFrac主坐标分析使用QIIME (PCoA)被执行。功能微生物群落的分析预测的系统发育重建调查社区的未被注意的状态(PICRUSt)基于绿色煤电数据库(24]。线性判别分析(LDA)效果(LEfSe)进行估计每个分类单元的效果显著的微分(丰度25]。输出文件进一步分析利用宏基因组资料的统计分析(邮票)软件(26]。

2.9。统计分析

我们进行了两组的比较 - - - - - -测试(正态分布和方差相等)或白色的非参数 - - - - - -测试(非正态的分布)使用SPSS(21.0版本;IBM公司,美国纽约阿蒙克)。所有的数据都表示为 。一个价值<0.05被认为是显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。CCl后微生物群落的整体结构变化₄和MSC治疗

后一代的多路复用读取基于每个样本和过滤序列的核苷酸条形码读取使用QIIME质量,从所有获得的2132586个高质量的序列样本,平均50776(范围:30927 - 70878)每个样本序列用于下游统计分析。具体地说,319780年从橄榄油获得序列控制;291936、314004和313643序列从三地获得₄治疗组(48 h, 1 w, CCl后2 w₄分别处理);到347219年,273154年和272850年从MSC-transplanted获得序列组(48 h, 1 w, 2 w CCl之后₄治疗,分别)。所有序列都集中到1517年操作分类单位97%(辣子鸡)使用QIIME基于序列相似性和分为249个细菌群体在属水平。每个样本组使用QIIME OTU数量计算。具体地说,有586了解辣子鸡的橄榄油控制;CCl 656、896和794个辣子鸡₄治疗组(48 h, 1 w, CCl后2 w₄分别处理);到713年,596年和668年辣子鸡MSC-transplanted组(48 h, 1 w, 2 w CCl之后₄治疗,分别)。好所有样品和群体的报道是99.5%以上,表明足够的社会保险。细节如表所示1和表S1。在48 h, CCl相比₄MSC-transplanted集团治疗组有更高的香农指数(4.9732和5.3811)和较低的辛普森指数(0.9336和0.9279),和没有显著差异( 和 ,分别)。然而,有显著差异( )两组之间在48 h PD树形索引(15.8604和19.0074)。丰富度指数Chao1(347.88065和459.8725)和观察到的物种(280和374)在48小时显示两组之间无显著差异( 和 )。在1和2 w,三地之间没有明显差异₄治疗和α多样性MSC-transplanted组织措施(香农和辛普森指数),PD树形索引和丰富度指数Chao1和观察到的物种(图1(一))。

有趣的是,同₄治疗组显示稳步增加α多样性值(香农和辛普森指数)和丰富度指数(Chao1和观察到的物种)。MSC-transplanted组显示增加α多样性值(香农和辛普森指数),但降低了丰富度指数(Chao1和观察到的物种)(表1)。稀疏曲线观察到的物种走向一个高原,表明所有样品的测序工作充分覆盖的辣子鸡(图1 (b),补充图S2在线)。排名丰度曲线下降缓慢,表明样品并不是由几个辣子鸡而是大部分low-abundance辣子鸡(图1 (c))。改变所有组的微生物群组成和样本根据PCoA(图中标注1 (d))。此外,主成分分析(PCA)使用邮票软件显示大部分CCl的样本₄治疗和MSC-transplanted组织分离在48 h和聚集在一起逐渐从1到2 w(数字1 (e)- - - - - -1 (g))。

3.2。肠道菌群的改变对急性肝损伤和msc

CCl描述相关的肠道菌群的变化₄msc的全身急性肝损伤和管理,我们建立和测序16 s rRNA盲肠和结肠的扩增子库的内容。老鼠接受同等体积的橄榄油其次是牺牲在48小时被用作控制。在门级,5的比例占主导地位的细菌类群(拟杆菌门,壁厚菌门,变形菌门、Deferribacteres Verrucomicrobia) >占95%所有序列组(图2(一个))。有趣的是,与同治疗组₄显示稳步增加壁厚菌门丰富但互惠降低拟杆菌门。组静脉注射msc表现出相反的结果,表现出逐渐增加在厚壁菌门和拟杆菌门丰富但是逆减少变形菌门。

此外,厚壁菌门和拟杆菌门的比率MSC-transplanted组减少(图2 (b))。在较低的家庭层面,梭菌属的(不明身份的家庭),Lachnospiraceae,Ruminococcaceae是最丰富的硬壁菌门菌门的代表。的家庭S24-7,类杆菌,Rikenellaceae,Prevotellaceae,细菌性的(不明身份的家庭),Paraprevotellaceae是最丰富的代表吗拟杆菌门门(图2 (c))。的家庭肠杆菌科和Verrucomicrobiaceae是最丰富的变形菌门的代表和Verrucomicrobia门,分别。总的来说,MSC-treated组,CCl相比₄治疗组,显示梭菌属的(不明身份的家庭)(16.8%至42.6%, )扩张和S24-7(45.2%至22.2%, ),类杆菌(8.3%至0.4%, ),和Verrucomicrobiaceae(0.9%至0.003%,p在48小时(图= 0.027)收缩2 (d))。在肝脏修复阶段(1 w CCl之后₄MSC-treated集团注入),相比之下,三地₄治疗组,显示梭菌属的(不明身份的家庭)(11.0%至27.5%, )和Ruminococcaceae(6.9%至13.3%, )浓缩和减少类杆菌(10.9%至4.2%, )和Verrucomicrobiaceae(1.7%至0.1%, )。CCl MSC-treated和没有区别₄治疗组2 w CCl之后₄除了相对更高比例的注入Helicobacteraceae(4.6%至1.0%, )CCl的₄治疗组(图2 (d))。因此,的比率梭菌属的(不明身份的家庭)/S24-7随着时间的推移MSC-transplanted组也减少。统计分析的细节在门和家庭层面补充图所示S3网上。

描述特定的细菌类群在48 h, 1 w, CCl后2 w₄治疗和MSC移植,LEfSe算法使用。的进化分枝图显示CCl的占主导地位的细菌类群₄治疗和MSC-transplanted团体在不同的时间在图所示3。LEfSe分析分别发现了24日25日和12 (LDA区别的特征 )。MSC-transplanted组48 h和1 w主要显示细菌类群的成员在厚壁菌门门;CCl的拟杆菌门是丰富的₄治疗组48 h,而Verrucomicrobia Deferribacteres, CCl变形菌门被丰富₄治疗组48 h, 1 w,分别和2 w(图3),结果与上述结果一致。有趣的是,我们发现主要科或属不总是LDA分数高,表明一些nonpredominant微生物区系的叠加效应可能不会被忽视。在48小时,Sutterella,Dehalobacterium,乳酸菌MSC-transplanted组中最丰富的,f_S24-7,拟杆菌,肠球菌,AkkermansiaCCl最丰富₄治疗组。1 w,Oscillospira和DehalobacteriumMSC-transplanted组中最丰富的,普罗透斯,Mucispirillum,普氏菌,Odoribacter,Dysgonomonas,AF12,Anaerostipes,真细菌,肠球菌CCl最丰富₄治疗组。在2 w,f_Helicobacteraceae,f_Bradyhizobiaceae,Dehalobacterium,Allobacullum最丰富的CCl只在吗₄治疗组。此外,在不同阶段微生物群的区别(48 h, 1 w, 2 w) MSC-transplanted团体也分析(48 h与1 w;48 h比2 w)。一些细菌(普氏菌,Flexispira,Holdemania,瘤胃球菌属,Sutterella,Anaerostipes,真细菌,Dysgonomonas,和Coprobacillus)得分高LDA MSC-transplanted小组发现了48 h。然而,只有o_Burkholderiales,f_Alcaligenaceae,g_Sutterella显著改变MSC-transplanted小组48 h, CCl相比₄治疗组,说明Sutterella可能更重要的是MSC-transplanted组在上述细菌。

3.3。CCl的肠道微生物的潜在功能₄治疗和MSC-Transplanted团体

京都基因和基因组的百科全书(KEGG;http://www.genome.jp/kegg/)通路被PICRUSt预测基于绿色煤电数据库(24]。此外,LEfSe应用研究每个KEGG途径的效果显著微分丰富。图4显示44岁,54岁,和3生物标志物发现途径level_3三地₄治疗组和12、12和1 MSC-transplanted组,在48 h, 1 w,分别和2 w。在48 h, 27 CCl代谢途径中被发现₄治疗组(61.4%;27下44途径)的氨基酸代谢、碳水化合物代谢,多糖生物合成和代谢,生物合成的次生代谢物,能量代谢,代谢代数余子式和维生素,多酮类化合物和萜类化合物代谢,代谢的其他氨基酸,异型生物质生物降解、代谢和脂类代谢的类别。

此外,最高的歧视nonmetabolic通路是孔隙离子通道在细胞过程和信号类别。此外,还指出“细胞分裂”。然而,MSC-transplanted组,三个最高歧视性的权力的途径“细菌运动性蛋白质,”“鞭毛大会,”和“细菌趋化性细胞运动性类别,其次是信号转导和膜运输类别。三个代谢途径发现MSC-transplanted组在脂类代谢,代谢的代数余子式和维生素,异型生物质生物降解、代谢类(图4(一))。1 w,最高的通路CCl歧视性的权力₄治疗组“脂多糖生物合成蛋白质”下的多糖生物合成和代谢范畴。另外,“脂多糖生物合成”、“糖基转移酶,”和“N-glycan生物合成”。第二个识别途径是“膜和胞内结构分子”的细胞过程和信号类别下还包含“毛孔离子通道,”“其他ion-coupled运输车,”“无机离子运输和代谢,”“细胞活性和分泌,”和“电子转移载体”的途径。通路在这组主要是新陈代谢下分类类别(55.6%;30的54通路)。MSC-transplanted组,两个最高歧视性的途径是“运输车”和“ABC转运蛋白在膜运输类别,紧随其后的是“孢子形成(非保密),”“转录因子,”和“细菌趋化性”孢子形成通路,转录和细胞活性类别,分别。六个代谢途径MSC-transplanted组中发现了其他氨基酸的代谢,脂质代谢,代谢多酮类化合物和萜类化合物,异型生物质生物降解、代谢类(图4 (b))。在2 w, CCl三通路被发现₄治疗组,且只有一个检测MSC-transplanted组,表明两组(图往往是一致的4 (c))。

3.4。肠道微生物群落的变化在MSC移植改善肠组织病理学和上皮紧密连接

回肠组织病理学结果从不同的实验组,每组如图5(一个)。橄榄油控制老鼠,回肠组织表现出正常的绒毛,黏膜下层,内外肌层和浆膜。在48 h, CCl的回肠₄治疗小鼠显示萎缩、侵蚀和绒毛脱落,杯状细胞数量减少,内部损伤,肌层和炎性细胞浸润。老鼠的回肠与msc移植了分散和微绒毛萎缩,但常规肌层的体系结构。1 w, CCl的回肠₄治疗小鼠显示增生绒毛和无序排列,而MSC-transplanted绒毛的老鼠表现出正常的安排和分布。在2 w, CCl的回肠₄治疗和MSC-transplanted老鼠回归正常绒毛的长度和安排。

评估上皮紧密连接(套,我们检查ZO-1的表达和分布,直接与交互的一种蛋白质跨膜TJ蛋白(27),由qPCR和免疫荧光分析。在48 h, MSC移植增加ZO-1 mRNA (m和c; ; - - - - - -在回肠测试),但降低ZO-1 mRNA (c与o, , - - - - - -CCl的测试)₄治疗组。在1和2 w,这些组之间没有明显差异,尽管ZO-1 CCl的低表达₄治疗组(图5 (b))。因此,免疫荧光进行回肠部分显示不连续染色为ZO-1顶端细胞边界(28,29日CCl的48小时₄治疗组,表明摧毁了TJ蛋白网络。此外,在48 h, MSC移植改善上皮套。在1和2 w,三地₄治疗和MSC-transplanted组显示完整的上皮套(图5 (c))。因为TJ multiprotein复杂,TEM是用于验证ZO-1超薄部分结果。套的低电子密度只有CCl明显₄治疗组48 h(图5 (d))。

3.5。CCl msc防止₄全身急性肝损伤

鼠标ALT和AST水平、肝组织病理学和生存曲线是msc的化验来评估治疗效果。结果显示血清ALT和AST水平升高和广泛的肝细胞坏死和脂肪变性CCl在48 h₄治疗组,但显著降低血清ALT和AST水平和坏死和脂肪变性区域的总大小MSC移植组(数字6(一)和6 (b))。1 w,三地₄治疗组显示正常的生化但点状坏死,而MSC-transplanted组显示生化和组织学恢复。在2 w,三地₄治疗和MSC-transplanted组显示正常的生物化学和肝脏组织学。此外,MSC移植小鼠生存显著改善2 w(图从45.5%降至77.3%6 (c)在48小时(图)和减少细胞凋亡6 (d))。

4所示。讨论

我们的研究系统分析了肠道微生物的变化与CCl MSC治疗有关₄全身急性肝损伤。功能性KEGG路径分析表明特定的肠道菌群在指定的时间和不同的途径(48 h, 1 w, 2 w)与肝损伤和修复有关。此外,基于微生物群变化,回肠组织病理学和上皮套评估。此外,CCl msc的治疗效果₄全身急性肝损伤评估。

CCl的影响₄政府对小鼠肝细胞损伤在很大程度上被研究过,虽然效果似乎是相关基因应变因素,C57BL / 6小鼠显示中间更易感BALB / c应变之间的病变,显示组织学恢复3 w,易SJL / J应变越小,显示了1 w[组织学恢复30.]。因此,在提交数据,C57BL / 6小鼠表现出正常的生物化学和肝脏组织学2 w ip注射后3毫升/公斤50% (v/vCCl)₄。此外,与msc移植显示显著的治疗效果,在生化和组织学恢复1 w。尽管创新领导力₄中毒不会导致永久性肝脏损伤,表现为大量坏死在48 h后一段时间的修复(31日),66.7%(8/12)的老鼠死了6或7天,表明其他因素导致持续的肝损伤或死亡。因为gut-liver轴在肝脏疾病中扮演着重要角色32),我们也假定的肠道微生物群中扮演一个重要的角色在这个模型的结果。事实上,肝脏移植的 msc显示相当大影响微生物群落的组成与没有移植相比,尽管在α多样性无显著差异测量除了PD树形索引之间的团体,可能是因为小样本大小的两组。

在48小时和1 w,更高的厚壁菌门丰富有关梭菌属的(不明身份的家庭)Ruminococcaceae,而拟杆菌门收缩与下降S24-7和类杆菌MSC-transplanted组。厚壁菌门和拟杆菌门是最丰富的细菌类群影响宿主的生理机能在人类和老鼠33,34]。厚壁菌门和拟杆菌门不均衡比例与各种疾病过程[有关35]。例如,高脂肪饮食和ob / ob老鼠增加了壁厚菌门和ob / ob老鼠也有较低的拟杆菌门随着时间的推移而精益控制(36,37]。此外,肥胖者少拟杆菌门和厚壁菌门比精益控制(38),并降低拟杆菌门,特别是家庭S24-7和类杆菌在试图阶段,发现了关节炎(39]。然而,纳什病人减少了大量的家庭Lachanospiraceae和Ruminococcaceae,属于门壁厚菌门,增加家庭的富足Prevotellaceae和肠杆菌科,分别属于门的拟杆菌门和变形菌门(40]。此外,糖尿病小鼠厚壁菌门和拟杆菌门比例较低(41),克罗恩病和溃疡性结肠炎患者的一个子集的特征是损耗的厚壁菌门和拟杆菌门的相对膨胀变形菌门(42]。在2 w,最明显的CCl肠道微生物组之间的差异₄治疗和MSC-transplanted团体是一个家庭的比例相对较高Helicobacteraceae,这通常与胃肠道疾病相关的动物属于门变形菌门(43]。此外,几乎没有家庭的证据Verrucomicrobiaceae,它只包括属AkkermansiaMSC-transplanted和橄榄油对照组。以前的报告显示,平均相对丰度值Akkermansia在肠道微生物群的老鼠和人类健康成年人0.003%和0.744%,分别为(44]。mucus-degrading细菌Akkermansia,启动粘液降解产生低聚糖和醋酸,导致殖民地细菌生长和抗致病性细菌,有利于微生物群mucus-associated组成(45]。此外,mucus-colonizing微生物一直被认为有助于恢复的微生物群46];在体外,Akkermansia可以坚持肠道上皮细胞,加强肠上皮细胞单层完整性(47]。这种细菌的活性增长可能对肠道微生物区系的原因之一是创新领导力的自动复位₄治疗组。有趣的是,我们的数据也表明,主要的家庭或属并不总是有很高的LDA的分数。在48小时和1 w,Sutterella,Dehalobacterium,乳酸菌(物种这种),Oscillospira在MSC-transplanted最丰富的属组。这种乳酸菌可显著提高TJ-associated蛋白质的表达(48),减少细菌易位(49),以及降低血清甘油三酯和增加高密度脂蛋白,低密度脂蛋白的比值(50]。它也有强大的直接抗炎作用于上皮细胞移植抗炎分子神经生长因子和抑制核转录因子κB (NF -κB)易位细胞核(51]。它已被证明Dehalobacterium和Oscillospira可以防止动脉粥样硬化,可能通过脂质代谢52]。然而,对非保密的作用Sutterella在肠道。

作为一个被遗忘的器官,肠道微生物区系相关的集体代谢和免疫调节能力举办健康和疾病(53]。肠道微生物的潜在功能MSC-transplanted组显著不同在肝损伤和修复阶段,比如在48小时和1 w,相比之下,CCl的₄治疗组。在48小时和1 w, MSC-transplanted微生物群的老鼠显示生物标志物参与细胞运动、信号转导、膜运输、转录、脂质代谢、辅因子、维生素、萜类化合物、多酮类化合物,以及外源性物质,有利于维护正常肝条件(35]。特别是在48 h(肝损伤阶段),MSC-transplanted集团大大丰富了功能基因参与细胞运动性(“细菌运动性蛋白质,”“鞭毛大会,”和“细菌趋化性”)。这表明,某些细菌运动可能有利于适应和应对刺激(如胆汁酸的变化和/或系统性炎症因素)。因为上面的三个途径厚壁菌门和拟杆菌门的比例有显著相关性在48小时( ; ;斯皮尔曼相关分析),可能是细菌运动促进一些壁厚菌门的微生物的生长和增殖,抑制LPS-producing细菌的增殖,保持肠道的屏障完整性和体内平衡。减少肠道细菌的转移可能促炎的产品为肝脏修复肝脏可能是有益的。令人惊讶的是,在48小时和1 w,最高的歧视nonmetabolic CCl肠道微生物组的途径₄治疗组细胞过程和信号类别,其次是肝脏regeneration-associated基因表达(35,最高的不同的代谢途径,氨基酸代谢和多糖的生物合成和代谢,也可能在肝脏再生(35,54]。

5。结论

总之,我们的数据进一步表明msc的广泛作用拯救CCl所致急性肝损伤₄。最初可能改变壁厚菌门和拟杆菌门率保持肠道粘膜生物学和体内平衡,有利于肝脏修复。

数据可用性

支持所有数据都包含在这篇文章和它的附加文件。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

HC的概念和设计;XD、XF和JL进行动物实验;QP和司法院做了细胞培养和免疫组织化学;ZL、YX和司法院进行微生态学;XD和ZL做数据分析;HC和XD起草的手稿;和监督研究。所有作者进行审核和批准最终的手稿。

确认

我们要感谢工作人员的实验动物中心浙江医学科学院、中国,与老鼠喂养的支持;我们还要感谢李Yanyuan病理学系的博士浙江大学第一附属医院为她组织病理学检查。这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。81620108028,没有。81471794)和干细胞转化研究中国国家重点研究和发展项目的(没有。2016 yfa0101001)。

补充材料

图S1: immunophenotypic和分化分析鼠标紧凑bone-derived msc。(一)Fluorescence-activated细胞排序结果表明,msc(7)通过CD44阳性(96.30%)、CD105(53.33%),和CD29(99.95%)和祖细胞标记本来(95.88%),但为阴性CD45 (2.89%)、CD34(9.53%),和CD11b (2.11%);内皮细胞标记CD31 (1.03%);和costimulating分子Ia(0.62%)和CD86 (1.86%)。这些细胞(b)显示典型的纺锤状形态。(c) Osteoblastogenesis msc的化验与茜素红S 21天。(d)脂肪生成评估与油红O染色在28天。图S2:稀疏曲线观察到的物种在肠道微生物群的橄榄油控件( ),CCl4-treated老鼠( ),和MSC-transplanted老鼠( )。油:橄榄油控制;c: CCl4-treated组;m: MSC-transplanted组。48 h, 1 w, 2 w表明48小时,CCl 1周,2周后₄治疗。图S3。CCl的统计分析₄治疗小鼠( )和MSC-transplanted老鼠( )在门和家庭水平48 h, 1 w,分别和2 w。显著差异确定使用白色的非参数 - - - - - -测试分类单元的平均丰度> 1%, 和95%的置信区间。CCl c:₄治疗组;m: MSC-transplanted组。48 h, 1 w, 2 w表明48小时,CCl 1周,2周后₄分别处理。表S1:数量的序列和操作分类单位,良好的报道估计,多样性指数为每个样本的焦磷酸测序分析。(补充材料)

引用

1. m·a·Matthay s Pati和j·w·李,“简洁的评论:间充质干细胞(基质)细胞:生物学和临床前证据器官功能障碍的治疗潜力外伤或脓毒症后,“干细胞,35卷,不。2、316 - 324年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. b . Parekkadan和j·m·Milwid“间充质干细胞疗法,”生物医学工程的年度审查,12卷,不。1,第117 - 87页,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. d . s . Zagoura m·g . Roubelakis诉Bitsika et al .,“治疗潜在的一个独特的人口的人类羊水间充质干细胞及其分泌的分子在小鼠急性肝衰竭,”肠道,卷61,不。6,894 - 906年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. m . n .伊斯兰教,s . r . Das m . t . Emin et al .,“线粒体转移从骨髓基质细胞对急性肺损伤肺肺泡保护,”自然医学,18卷,不。5,759 - 765年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. m . Gazdic a . Arsenijevic b·s·马尔科维奇et al .,“间充质干细胞cell-dependent调制的肝脏疾病,”国际生物科学杂志》上,13卷,不。9日,第1117 - 1109页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. h·h·c·w·李,y . f . Chen, o·k·李,“历史视角和间充质干细胞研究进展治疗肝脏疾病,”胃肠病学,卷154,不。1,46-56,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. 周x l . n .崔x m .周et al。”从人类脐cord-derived hepatocyte-like诱导细胞间充质干细胞被定义的小分子核糖核酸,”细胞和分子医学杂志》上,21卷,不。5,881 - 893年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. K.-A。曹,S.-Y。哇,J.-Y。Seoh H.-S。汉族,K.-H。Ryu”,间充质干细胞恢复CCl4-induced肝损伤的抗氧化过程中,“细胞生物学国际,36卷,不。12日,第1274 - 1267页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. 王妃,a·e·瑞恩·m·d·格里芬和t·里特,“间充质干细胞细胞外囊泡:对治疗应用游离,“分子治疗,23卷,不。5,812 - 823年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. c . y . Tan r·c·赖w . Wong y y丹,s . k . Lim和h k Ho”间充质干细胞液促进药物引起的肝损伤的肝再生模型,”干细胞研究与治疗,5卷,不。3,p。76年,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. h·l·歌,美国Lv, p . Liu”角色的肿瘤坏死因子-α在结肠紧密连接蛋白表达和肠粘膜结构在小鼠急性肝衰竭模型,”BMC胃肠病学,9卷,不。1,p。70年,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. d . e .输出信号,m . Torralba k·e·纳尔逊·d·a·布伦纳和b . Schnabl”细菌易位和肠道微生物的变化在肝脏疾病小鼠模型,”肝脏病学杂志卷,56号6,1283 - 1292年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. j·p·诺兰和ai莱博维茨,“内毒素和肝脏。三世。修改的急性四氯化碳损伤多粘菌素b——抗内毒素,”胃肠病学,卷75,不。3、445 - 449年,1978页。视图:谷歌学术搜索
14. j·p·诺兰,“肠道类毒素的介质hepatic-injury-an概念的时代已经来临,“肝脏病学,10卷,不。5,887 - 891年,1989页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. t·m·拉赫曼·h·j·霍奇森,“急性肝衰竭动物模型”,国际实验病理学杂志》上,卷81,不。2、145 - 157年,2000页。视图:谷歌学术搜索
16. b·o·施罗德和f . Backhed信号从肠道微生物群遥远的器官生理学和疾病,”自然医学,22卷,不。10日,1079 - 1089年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. j·伯克,v . k . Viswanathan s . d . Savkovic g·赫克特,“肠上皮反应肠道病原体:紧密连接障碍,影响离子运输和炎症,”肠道,52卷,不。3、439 - 451年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. d .你们美国郭、r . al-Sadi和t . y .妈,“微rna调节肠上皮细胞紧密连接的渗透率,”胃肠病学,卷141,不。4、1323 - 1333年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. c . Kuntzen和r·f·施瓦贝”肠道微生物群和toll样受体为cytokine-mediated抗菌反应在肝纤维化的失败,”肠道,卷66,不。3、396 - 398年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. c .梁l·里维拉j·b·Furness p·w·安格斯,“肠道微生物群在非酒精性脂肪肝的作用。”自然评论胃肠病学和肝脏病学,13卷,不。7,412 - 425年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. h·朱、郭z . k . x x江et al .,”一个协议隔离和文化间充质干细胞的鼠标密质骨,“自然的协议,5卷,不。3、550 - 560年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. d . w . Fadrosh, b . Ma, p . Gajer et al .,“一种改进dual-indexing方法多路16 s rRNA基因测序的Illumina公司MiSeq平台”微生物组,卷2,不。1,p。2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. j·g . Caporaso Kuczynski j·j·Stombaugh et al .,“QIIME允许社区高通量测序数据的分析,“自然方法,7卷,不。5,335 - 336年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. m·g . i Langille j . Zaneveld j·g·Caporaso et al .,“预测功能微生物群落的分析使用16 s rRNA标记基因序列,”自然生物技术没有,卷。31日。9日,第821 - 814页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. n . Segata j .伊泽德·l·沃尔德伦et al .,“宏基因组生物标志物的发现和解释,”基因组生物学,12卷,不。6,R60页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. d·h·公园、g·w·泰森,p . Hugenholtz和r . g . Beiko”邮票:统计分析的分类和功能概要,”生物信息学,30卷,不。21日,第3124 - 3123页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. m·a·Odenwald和j·r·特纳“肠上皮屏障:治疗目标?”自然评论胃肠病学和肝脏病学,14卷,不。1、9、2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. p .布朗Castagliuolo, v . d .狮子座et al .,“肥胖小鼠的肠道通透性增加了:非酒精性肝病的发病机制的新证据,”美国生理学杂志》上。胃肠道和肝脏生理,卷292,不。2,G518-G525, 2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. m·g·法夸尔和g . e . Palade交界复合体在不同的上皮细胞,”《细胞生物学》杂志上,17卷,不。2、375 - 412年,1963页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. p . s .巴瑟尔,n . r .玫瑰,i r·麦凯和s·惠廷汉姆,“碳tetrachloride-induced小鼠肝损伤应变差异,”英国实验病理学杂志》上,卷64,不。5,524 - 533年,1983页。视图:谷歌学术搜索
31. l·w·d·韦伯、m·鲍尔和a . Stampfl“肝毒性和卤代烷的作用机制:四氯化碳作为毒理学模型,”关键在毒理学评论,33卷,不。2、105 - 136年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. b . Chassaing l . Etienne-Mesmin, a . t . Gewirtz“Microbiota-liver轴在肝脏疾病,”肝脏病学卷,59号1,第339 - 328页,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. f·萨默和f . Backhed肠道微生物群——主机发展和生理学的大师,”自然评论微生物学,11卷,不。4、227 - 238年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. r·e·雷f . Backhed p .恩伯,c . a . Lozupone r·d·奈特和j·戈登,“肥胖改变肠道微生物生态学”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷102,不。31日,第11075 - 11070页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. H.-X。刘,c . s .罗查s Dandekar, Y.-J。伊冯湾”,功能分析肠道菌群之间的关系和肝基因和通路的表达过程中肝再生,”肝脏病学杂志,卷64,不。3、641 - 650年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. e . f·墨菲,p . d .销美国希利et al .,“作文和肠道微生物群的能量收获能力:关系饮食,肥胖小鼠模型和时间,”肠道卷,59号12日,第1642 - 1635页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. p . j .恩伯r·e·雷·m·a .马浩德诉Magrini e . r .理智型和j·戈登,”一个肥胖相关的肠道微生物组增加能量收获,能力”自然,卷444,不。7122年,第1031 - 1027页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. r·e·雷p . j .恩伯s克莱因和j·戈登,”微生物生态学——人类肠道微生物与肥胖有关,”自然,卷444,不。7122年,第1023 - 1022页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. r . Rogier, h . Evans-Marin j . Manasson et al .,“改变小鼠的肠道微生物组描述临床类风湿性关节炎及其调制变弱了关节炎,“科学报告,7卷,不。1,p。15613年,2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. c . l . x朱s . s . Baker吉尔et al .,”特征的非酒精性脂肪肝(NASH)患者的肠道微生物组:内生酒精和纳什之间的连接,”肝脏病学卷,57号2、601 - 609年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. l .温r·e·雷p y Volchkov et al .,“先天免疫和肠道微生物群在1型糖尿病的发展,“自然,卷455,不。7216年,第1113 - 1109页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. 圣阿曼达d . n .弗兰克·a·l·r·a·费尔德曼·e·c . Boedeker n . Harpaz和n . r .速度,“Molecular-phylogenetic表征微生物群落失衡在人类炎性肠道疾病,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷104,不。34岁,13780 - 13785年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. m . t . Whary和j·g·福克斯”,自然和实验幽门螺杆菌感染,”比较医学,54卷,不。2、128 - 158年,2004页。视图:谷歌学术搜索
44. t·l·a·阮Vieira-Silva, a·斯通和j . Raes”信息是人类肠道微生物群的老鼠研究如何?”疾病模型与机制,8卷,不。1,硕士论文,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. c·茨和w·m·德·沃斯·”——从教会微生物多样性函数:Akkermansia的情况下,“ISME日报》第六卷,没有。8,1449 - 1458年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. g·里德,j·a·尤尼斯·h·c·范德梅g . b . Gloor r·奈特和h . j . Busscher“微生物群恢复:自然和补充人类微生物群的复苏,”自然评论微生物学,9卷,不。1,27-38,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
47. j . Reunanen诉Kainulainen l . Huuskonen et al .,“Akkermansia muciniphila坚持肠上皮细胞,增强上皮细胞层的完整性,”应用与环境微生物学,卷81,不。11日,第3662 - 3655页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. x f·f·j·杨,a . n . Wang曾,c·l·侯h . Liu郑胜耀乔,“这种乳酸菌I5007调节紧密连接蛋白表达与LPS刺激IPEC-J2细胞和新生仔猪在正常情况下,“BMC微生物学,15卷,不。1,p。2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
49. j . Dicksved o .施赖伯,b . et al .,“这种乳酸菌维护功能粘膜屏障DSS治疗期间尽管黏液层障碍,”《公共科学图书馆•综合》,7卷,不。9 p . e46399 2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
50. m·p·塔兰托,m·美第奇g . Perdigon a . p . Ruiz Holgado g·f·瓦尔迪兹,“证据hypocholesterolemic hypercholesterolemic老鼠的这种乳酸菌的影响,“乳品科学杂志》,卷81,不。9日,第2340 - 2336页,1998年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
51. 马·d·l·p·福赛斯,和j . Bienenstock称,“住这种乳酸菌对肿瘤坏死因子的抑制作用至关重要alpha-induced interleukin-8表情,“感染和免疫,卷72,不。9日,第5314 - 5308页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
52. m . s . y . k . Chan Brar, p . v . Kirjavainen et al .,“高脂肪饮食诱导动脉粥样硬化是伴随着低结肠细菌多样性和改变的丰度与斑块大小、等离子体A-FABP和胆固醇:一个试点研究高脂肪饮食及其与乳杆菌干预GG (LGG)或替米沙坦在ApoE−−老鼠,”BMC微生物学,16卷,不。1,p。264年,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
53. a . m .奥哈拉和f·沙纳罕,“肠道菌群作为一个被遗忘的器官,”EMBO报告,7卷,不。7,688 - 693年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
54. d·a·鲁德尼克·d·j . Dietzen y . p . Turmelle et al .,“血清α-NH2-butyric酸可能在小儿急性肝衰竭预测自发的生存,”小儿移植,13卷,不。2、223 - 230年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2019院长盾等。这是一个开放分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。