成人干细胞群的隔离和表征人类硬膜外脂肪

文摘

研究设计。隔离和表征人类硬膜外脂肪干细胞/祖细胞(医疗公平基金)。客观的。确定一个祖人口医疗公平基金内,确定他们是否满足最小条件的间充质干细胞(MSC)。背景资料概述。生物功能(如果有的话)对医疗公平基金尚未确定。msc在医疗公平基金的存在可能表明再生医疗公平基金中的潜力。方法。医疗公平基金是独立于10在选择性脊柱手术患者。医疗公平基金沿骨的细胞分化、adipo, chondrogenic血统,分化通过qPCR和组织学分析。医疗公平基金的细胞表面受体细胞流式细胞术了。医疗公平基金细胞也通过胶原蛋白收缩分析化验。这种破坏^CreERT2GFP:R26R^TdTomatoMSC lineage-tracking老鼠用来确认EF MSC在活的有机体内。结果。医疗公平基金细胞系得到所有10个病人的研究。从2/10病人展示完整的MSC潜在细胞,而细胞的病患中,有6/10的人展示了祖潜能;2/10的患者伴有细胞只保留脂肪形成的潜力。医疗公平基金细胞表现出MSC表面标记表达式。所有患者的细胞系胶原凝胶收缩。一个这种破坏艾滋病人口鼠标硬膜外脂肪似乎有助于观察脊髓的硬脑膜在活的有机体内。结论。MSC和祖种群内存在医疗公平基金。msc并不确定在所有的病人检查在当前的研究中。此外,所有患者行了胶原蛋白收缩能力,表明人口污染激活成纤维细胞或医疗公平基金msc /祖细胞也展示一个呈表型。在活的有机体内分析表明,这些细胞群可能导致硬脑膜。整体而言,这些结果表明,细胞内硬膜外脂肪可能发挥生物学作用在上面的当地环境提供一个机械缓冲。

1。介绍

间充质干细胞(msc)是众所周知的自我更新能力和分化成多种细胞谱系的能力(1]。也有证据证明msc可以直接修复通过immune-modulating属性(2- - - - - -6]。具体来说,msc可以调节扩散,活动,和分化淋巴细胞(7,8和自然杀伤细胞9]。对于这些有吸引力的属性,msc在临床试验中曾为许多疾病(10- - - - - -13),但它可以辩称,我们仍然缺乏一个清晰的理解他们的角色在成人组织。

msc被Friedenstein等人第一次描述了骨髓(14),随后孤立点蚀(1]。msc也被成功地分离出滑膜(15],脐带血[16)、肺(17],肌肉[18),脂肪组织(19],牙髓[20.),胰腺(21),和其他人。最常见的来源骨髓msc在临床前和临床试验(22- - - - - -25和脂肪组织26- - - - - -28]。大多数解剖网站的脂肪在人体特征,包括他们的潜在来源msc (19,29日,30.];然而,对人类的作用硬膜外脂肪(医疗公平基金)。经常在脊柱手术中,硬膜外脂肪去除掉,丢弃;然而,医疗公平基金的研究非常有限,生物特征的医疗公平基金从来没有承诺我们的知识。1997年,Beaujeux等人得出的结论是,医疗公平基金是一个功能性组织(基于组织学分析)31日]。2009年,一个电子显微镜研究提出医疗公平基金担任机械缓冲提供缓冲和支持椎管内的囊壁(32),但这并不证明在功能水平。膝关节脂肪垫是一个解剖脂肪网站也一度被认为是仅仅为机械缓冲,但这已经被广泛的研究近年来30.,33,34]。膝关节脂肪垫现在被认为是生物活性,包含可以诱导msc分化成多种细胞细胞系(30.,35- - - - - -38),与其他类似的结果中观察到的脂肪类型(19,39]。因此,而不是生理上的冗余或机械缓冲,脂肪垫可能促进某种程度上滑膜组织维护和修复的环境,但至少包含细胞再生潜力在体外(30.,36]。这些和其他体内脂肪细胞研究网站作为理由调查医疗公平基金的生物学特性,并检查它的一个潜在来源MSC和/或祖细胞数量。如果是,这可能会迫使我们目前考虑硬膜外脂肪的复审,我们是否应该继续清除和经常丢弃它。

2。材料和方法

2.1。道德的声明和人口特征

制度伦理批准是卡尔加里大学的研究伦理委员会(ID: reb17 - 0220)。所有患者签署知情同意释放医疗公平基金形式,在常规外科手术过程中去除掉。年龄和性别对每个病人都被记录下来。本研究进行了符合赫尔辛基宣言。

医疗公平基金从腰椎管被隔离10例(5米/ 5 F;24 - 80岁)在主要选修后脊髓减压退行性腰椎狭窄。所有的病人有ASA得分为1或2,和患者恶性肿瘤的历史,自身免疫性疾病,或炎性关节病被排除在外。

2.2。硬膜外脂肪消化

医疗公平基金样本消化在37°C的90分钟过滤1毫克/毫升IV型胶原酶(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)。细胞悬液过滤在70年μm和洗两次DPBS (Lonza BioWhittaker, Walkersville,马里兰州),然后播种在MSC媒体(详情如下)12-well盘子和37°C和5%孵化有限公司₂。confluency 70%,细胞被洗DPBS通道和胰蛋白酶(Lonza BioWhittaker)。允许细胞增殖与介质的变化进行每2天。

2.3。分化分析

扩大细胞诱导分化为骨,软骨,脂肪。并给出了详细的协议如下:

2.3.1。成骨分化

细胞被播种为单层膜( 细胞在DMEM /在24-well板块)/ F-12补充10%的边后卫,1% antibiotic-antimycotic(大家),1% MEM不必要的氨基酸(NEAA)从热费希尔科学(所有),和osteogenesis-inducing代理包括地塞米松(Dex 10⁻⁴米),L-ascorbic酸(50μg / mL)β甘油磷酸酯(10毫米)从Sigma-Aldrich(所有)。这种区分协议进行21天每两天与介质的变化。

2.3.2。Chondrogenic分化

细胞颗粒状( 每个颗粒细胞,在6分钟5000 rpm)离心机,软骨形成培养诱导了球团矿在DMEM / F-12补充嗜为1%,1% NEAA从热费希尔科学(所有),和chondrogenesis-inducing代理包括地塞米松(10 nM) (Sigma-Aldrich)、抗坏血酸(50μg / mL) (Sigma-Aldrich), TGF -β3 (10 ng / mL) (PeproTech Inc .,落基山,新泽西州),BMP-2 (500 ng / mL) (PeproTech Inc .)、丙酮酸钠(热费希尔科学)和胰岛素转铁蛋白硒(其)(Lonza BioWhittaker)。这种区分协议进行21天每两天与介质的变化。

2.3.3。脂肪形成的分化

细胞被播种为单层膜( 细胞在DMEM /在24-well板块)/ F-12补充10%的边后卫,1%的嗜,1% NEAA (all from Thermo Fisher Scientific), and adipogenesis-inducing agents including dexamethasone (1 μ米)、胰岛素(10μ米)、吲哚美辛(200μ和isobutylmethylxanthine(500米)μ从Sigma-Aldrich米)(所有)。媒介的变化进行每周两次在21天的差异化协议。

2.4。定量PCR (qPCR)

收集mRNA,使用了两种不同的方法根据分化过程。信使RNA从细胞进行成骨、脂肪形成的差异化是孤立的通过一个试剂盒试剂(热费希尔科学),当细胞接受chondrogenic分化的信使RNA提取的总RNA工具包(ωBio-tek, VWR)。双方都能接受的协议的元素包括添加1毫升的试剂盒试剂与糖原(热费希尔科学)细胞,其次是增加200μL(氯仿(Sigma-Aldrich)。样本漩涡,孵化,然后离心/制造商的指示。

2.4.1。修改协议Chondrogenic分化mRNA隔离

短暂,最终试剂盒的水层一步转移成HiBind RNA迷你列和离心机。RNA洗我添加到列和recentrifuged缓冲区。RNA洗第二缓冲区添加离心机;这是重复两次。DEPC水被添加到列和离心机,信使rna是储存在−80°C到使用。

2.4.2。成骨的或脂肪形成的差异化mRNA隔离

试剂盒的水层试剂与异丙醇补充,漩涡,孵化,然后离心机。合成颗粒被75%的乙醇和离心机。信使rna颗粒resuspended 20μL RNA的超纯水(VWR)和存储在−80°C到使用。

2.4.3。第一链的合成

第一链cDNA生成使用高容量从提取的mRNA cDNA工具包(热费希尔科学)后,制造商的协议。互补脱氧核糖核酸样本存储在−20°C到使用。

2.4.4。实时定量PCR (qPCR)分析

骨生成的表达水平Osterix(Sp7),Runx2被量化。脂肪生成,脂联素测量。对软骨形成,Sox9和Col2a被检查。核糖体18岁采用作为内部控制/管家基因(所有Taqman化验从热费希尔科学)。

微安光学反应板(热费希尔科学)被作为反应容器。掌握混合是为每个探测器/标记包含0.5μL的具体调查,5μL TaqMan普遍PCR主人没有AmpErase混合(应用生物系统公司)和3.5μ超纯水的L。在每个好吧,最后一卷9μL掌握混合的混合1μL的互补。三个复制运行每个示例。

循环阈值(CT)值(一式三份)为每一个标记从qPCR获得数据计算对CT值18 s看家基因。

2.5。流式细胞术

在HEF-derived细胞分化条件下放置,还检查了一个整除的细胞使用流式细胞仪进行细胞表面标记表达式。这些细胞被孤立使用胰蛋白酶然后沾CD271, CD105, CD90、CD73, CD44(所有从BD生物科学,富兰克林湖,新泽西州)。

2.6。胶原蛋白收缩试验

纯化牛I型胶原蛋白(3毫克/毫升,先进BioMatrix)与医疗公平基金混合细胞获得最后一个细胞的浓度 细胞/毫升。胶原蛋白/细胞混合物聚合使用的1 M氢氧化钠。由此产生的凝胶是流离失所的文化从而使收缩。

2.7。组织学

补充qPCR分析,组织学分析完成的分化。简单,细胞被固定为10%中性缓冲福尔马林(NBF)一小时在室温下,然后为特定的组织学染色试剂为每个血统。成骨的文化与茜素红染色检测钙(Sigma-Aldrich)。脂肪形成的文化是沾油红O检测脂质(Sigma-Aldrich)解决方案。chondrogenic文化是沾染了红色染料O检测粘多糖(Sigma-Aldrich)。

2.8。血统追踪

所有老鼠都依照加拿大动物保健指导委员会的建议,和动物协议是卡尔加里大学动物保健委员会批准。的这种破坏/Prrx1-cre / ERT2 -EGFP^{1 smkm}/ J小鼠行用于本研究提供的请Shunichi村上博士(克利夫兰凯斯西储,哦)。Gt (ROSA) 26琼^{tm14 Hze (CAG-tdTomato)}从杰克逊实验室/ J小鼠购买。生成转基因老鼠,育种计划工作如下:Prx1-cre / ERT2 -EGFP^{1 smkm}/ J^{+ / +}老鼠培育Gt (ROSA) 26琼^{tm14 Hze (CAG-tdTomato)}/ J^{+ / +}小鼠产生Prx1-cre / ERT2 -EGFP^{1 smkm}/ J^{+ /−};Gt (ROSA) 26琼^{tm14 Hze (CAG-tdTomato)}/ J^{+ /−}。三苯氧胺的活性异构体((Z) 4-hydroxytamoxifen Sigma-Aldrich)是溶解在filter-sterilized葵花油使解决方案的最终浓度10毫克/毫升。老鼠注入了约100μL它莫西芬的解决方案(100毫克/公斤)每天一次超过5天,紧随其后的是一个一个星期的等待期允许重组。

完整的鼠标脊柱解剖和固定在中性缓冲福尔马林(Sigma-Aldrich) 5天,然后脱钙Cal-Ex(费舍尔科学)10天。后10天脱钙作用过程中,样品接受了石蜡切片组织处理。连续矢状部分(10μ米)绿色与红色染料costained O和快。可视化番红精O染色或内生荧光(EGFP或TdTomato)、一个Axio扫描。Z1滑动扫描显微镜(卡尔蔡司)配备Plan-Apochromat目标(10 x / 0.8 M27)被用于图像幻灯片。以下过滤器应用:DAPI(353海里/ 465海里),EGFP(493海里/ 517海里),和安全域(563海里/ 581海里)。

3所示。结果

3.1。分化潜能

细胞分离出医疗公平基金为他们的多能干细胞分化能力进行评估。分子(qPCR)和组织学结果措施了。因此,对于一个积极的结果到一个特定的谱系分化,一个积极的结果qPCR和组织学结果必须获得一个给定的细胞系。

三个内细胞群有明显的效能医疗公平基金被确认:细胞(1)trilineage (MSC), (2) bilineage,和(3)unilineage潜力。总结在表描述的所有人口潜力1。的在体外数据在数据1- - - - - -3代表的结果的一个例子每种类型的干细胞/祖人口。

以确定病人年龄与细胞能力/潜力,进行相关性分析。观察医疗公平基金效力和患者年龄之间没有相关性( , )。

3.2。间充质干细胞

2 10个病人中,细胞与multilineage(骨,软骨,脂肪)的表型定义msc分化潜力的会议是孤立和特点。基于qPCR分析(图1),这些细胞表现出chondrogenic mRNA表达的诱导,分化后成骨、脂肪形成的标记。组织学染色证实分化的分子分析。细胞表现出积极的对红色染料染色O(葡糖氨基葡聚糖)、茜素红(钙)、油红O(脂)(图1)。

细胞表面蛋白通常用来识别msc进一步检查使用流式细胞仪(国际社会最低标准的细胞治疗(ISCT)) (40]。流式细胞仪数据表明几乎所有细胞表达CD73, CD90、和CD44, CD105表达的只有一个的人口比例和CD271表达缺席(图1)。因此,按照设定的最低标准ISCT [40),细胞2 10个病人中会见了标准被定义为msc。

3.3。Bipotent祖细胞

在6 10个病人中,细胞与部分multilineage分化潜在的分离和特征。这些细胞的数量区分能力有限与msc相比,然而他们做演示bilineage能力。从分化细胞信使rna提取证明upregulation成骨的和脂肪形成的标记相比,未分化的细胞分离出相同的病人;然而,这两个Col2a和Sox9(chondrogenic标记)下调/不表示(图2)。组织学分析表明,这些细胞染色阳性茜素红和油红O确认qPCR结果。然而,细胞颗粒也呈阳性番红精啊,标志着粘多糖的存在没有chondrogenic标记(Col2a和Sox9)(图2)。细胞表面标记的表达谱bipotent祖细胞类似于msc。CD73 Bipotent祖细胞阳性,CD90、和CD44,而约。30%的人口是CD105和CD271表达阳性(图缺席2)。

3.4。单能性的潜在

在2的患者,multilineage有限的细胞分化潜在的分离和特征。这些细胞分化成软骨细胞、成骨细胞缺乏能力但保留向脂肪细胞分化的能力。信使rna提取细胞分化了的upregulation脂肪形成的标记相比,未分化的细胞分离出相同的病人;然而,chondrogenic和成骨的标记缺席(图3)。这些细胞组织学分析表明,油红O染色阳性(脂)确认qPCR结果。然而,细胞颗粒也为红色染料O染色弱阳性,表示粘多糖的存在没有chondrogenic标记(图3)。茜素红染色是负数表示缺乏钙沉积(图3)。

细胞表面标记的表达谱单能性的祖细胞类似于msc和bipotent祖细胞。单能性的祖细胞阳性CD73, CD90和CD44,大约。25%的人口是CD105和CD271表达阳性(图缺席3)。

3.5。成纤维细胞的活动

来确定这些细胞的数量由医疗公平基金展示fibroblastic-like活动,胶原凝胶收缩进行了分析。所有细胞群测试,无论力量,展示了一种胶原凝胶收缩(图的能力4)。

3.6。在活的有机体内血统追踪

探讨硬膜外脂肪msc在活的有机体内这种破坏(脂肪MSC标记)血统记者鼠标采用(40,41]。细胞主动表达这种破坏co-express GFP,而细胞表达这种破坏它莫西芬注射的时候也与tdTomato永久标记。Prx1) +msc被发现硬膜外脂肪组织内相邻脊髓(图5)。此外,的后代这种破坏+细胞(GFP - tdTomato +)发现了大量丰富的硬脑膜(图5),特别是在硬膜外脂肪的地方连接到硬脑膜。

4所示。讨论

当前研究的关键发现是,从医疗公平基金分离出来的细胞新陈代谢活跃和有能力分化为骨的,细粒,脂肪形成的血统。

符合ISCT指南,细胞分离出2/10的患者所需满足的最低标准定义为MSC通过展示自我更新能力和分化能力(42]。病人细胞系的其余部分演示了bi -(6/10)或单一血统(2/10)的潜力。细胞表面标记分析了MSC标记的存在(CD90 + CD73 +、CD44 +和CD105 +)在所有patient-derived细胞系没有标记表达式和分化潜能之间的联系。此外,细胞收缩性试验也积极的在所有样本表明成纤维细胞的人口在医疗公平基金的存在或这些医疗公平基金msc /祖细胞的存在也证明一个激活成纤维细胞表型。

为了进一步证实msc在硬膜外脂肪的存在在活的有机体内,这种破坏记者老鼠雇佣,他们展示了阳性染色的假定的msc在硬膜外脂肪。有趣的是,这是发现在硬膜外脂肪的地方接触到脊髓的硬脑膜,硬脑膜是丰富的后代Prx1) +细胞。硬脑膜的细胞起源和细胞数量保持这个组织通过成年仍不清楚。因此,更多的研究需要充分描述的贡献这种破坏+细胞硬脑膜和验证这些细胞来自于硬膜外脂肪。

目前还不清楚为什么有些患者样本中细胞完全致力于脂肪血统相比仍为msc;然而,它可能是假定的影响可能是由于年龄和/或疾病严重程度。一个更大的研究与正常控制样品需要测试这个假说。

在目前的研究中,我们提出了数据表明医疗公平基金的一种新型生物活性。在这一点上,它仍然是未知的,如果/这些细胞如何与当地的环境交互;然而,并不是不合理的考虑到医疗公平基金作为储层的细胞局部组织维护/再生以及作为当地的免疫调节和细胞信号组织,符合其他解剖网站脂肪的作用。脂肪组织详细研究,这是坚定与强有力的组织生物活性和能力服务的当地和系统功能,更不用说它的潜力作为再生组织来源(5,6,8,9,19,28,29日,33,38,43,44]。科学、术中硬膜外脂肪仍然收到很少或根本没有关注和临床上很大程度上被认为是无关紧要的。这个的结果体外学习是改变这种看法,扩大Beaujeux提出的角色,以及强调进一步研究被认为检查医疗公平基金的稳态和再生潜力。

数据可用性

原始数据和必要的细节可以由相应的作者提供合理的请求。

信息披露

罗马Krawetz和弗兰克·g·里昂是文章的第二作者。我们也愿意承认部分的手稿被视为一个抽象的第十八届科学会议加拿大脊柱的社会。

的利益冲突

没有贡献的作者有任何利益冲突声明。

确认

作者要感谢索菲娅Shah的援助与组织学分析。我们也感谢工作人员卡尔加里大学的流式细胞仪核心设施的援助。我们感激地承认卡尔加里骨科研究和教育基金(COREF)提供赠款资助这个项目。

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