胰岛素增强屈肌腱来源的祖细胞的体外成骨能力

抽象

还有就是增加肌腱疾病的发病率和减少肌腱愈合人与糖尿病（DM）的能力。最近的研究还表明在人与DM修复肌腱骨化病变。因此，本研究的目的是调查胰岛素补充，DM的一个重要的病理生理的刺激，对腱祖细胞（TPC）的增殖和体外成骨能力的影响。通道3级的TPC从胶原酶消化，马数字浅屈肌腱隔离。TPC proliferation was measured via MTT assay after 3 days of monolayer culture in medium supplemented with 0, 0.007, 0.07, and 0.7 nM insulin. In vitro osteogenic capacity of TPCs (Alizarin Red staining, osteogenic mRNA expression, and alkaline phosphatase bioactivity) was assessed with 0, 0.07, and 0.7 nM insulin-supplemented osteogenic induction medium. Insulin (0.7 nM) significantly increased TPC proliferation after 3 days of monolayer culture. Alizarin Red staining of insulin-treated TPC osteogenic cultures demonstrated robust cell aggregation and mineralized matrix secretion, in a dose-dependent manner. Runx2, alkaline phosphatase, and Osteonectin mRNA and alkaline phosphatase bioactivity of insulin-treated TPC cultures were significantly higher at day 14 of osteogenesis compared to untreated controls. Addition of picropodophyllin (PPP), a selective IGF-I receptor inhibitor, mitigated the increased osteogenic capacity of TPCs, indicating that IGF-I signaling plays an important role. Our findings indicate that hyperinsulinemia may alter TPC phenotype and subsequently impact the quality of repair tendon tissue.

1.简介

肌腱炎和腱病是人共同和衰弱的伤害[1-4]。最近的研究表明，患有糖尿病（DM）已因结构变化[增加肌腱疾病的发病率和部分介导五，6]。此外，糖尿病患者的肌腱损伤有所减少肌腱愈合能力，并在复发性损伤的风险更大[五-7]。增加肌腱大小[8，9]，紊乱的胶原纤维[8，9]，并且在腱修复异常骨化[10，11]在人DM报道了一些病症。在跟腱插入增加钙沉积已患有糖尿病，这随后导致肌腱断裂被观察到。修复肌腱内骨化病理减少肌腱的弹性，增加重复受伤的风险，并且是慢性疼痛和不适的人源[12，13]。虽然最近的研究表明在人与DM肌腱病变增大，负责生物和细胞机制了解甚少。

筋的细胞级分，其由成熟肌腱细胞和多能腱祖细胞（的TPC）的，是非常小的（<1％），但是负责形成腱组织的体积[合成和细胞外基质（ECM），成交14]。腱祖细胞集落生成证明，多潜能，和自我更新的通用干细胞特征，以及它们的生物活性在很大程度上依赖于它们的当地环境/基质相互作用[14-16]。健康和病理肌腱组织中肌腱祖细胞的体内外表型有明显差异[15-17]。在体内，在修复肌腱TPC都牵涉于chondrodegeneration愈合期间注意到[17，18]。类似地，从受损肌腱分离的TPC的体外多能受到限制，朝向chondroosteogenic表型的变化[17，19]。最近的一项研究Shi等。证明来自DM分离的TPC具有降低tenogenic表型和表达较高水平chondroosteogenic基因[20]。两者合计，病理刺激存在于DM的影响下的TPC的异常分化可以负责钙化存在于受伤/愈合腱病理组织。

外源性胰岛素用于临床管理DM。此外,系统性高胰岛素血次要受损的胰岛素敏感性可以发生在糖尿病早期。而tpc tenogenic表现型的DM肌腱受伤组织在离体培养与high-glucose浓度明显降低,高胰岛素浓度的影响在tpc没有调查(20，21]。外源性胰岛素和重组胰岛素样生长因子-I（IGF-I）增加的成骨细胞和牙周膜细胞[体外成骨能力22，23]。因此，我们推测外源性胰岛素影响TPC增殖，增强其体外成骨能力。In the first set of experiments, the effects of exogenous insulin (Humulin™ 0, 0.07, and 0.7 nM) on proliferation and in vitro osteogenic capacity of equine flexor tendon-derived TPCs were assessed. Secondly, in order to determine if differential effects of insulin on insulin/IGF-I signaling exist, osteogenesis experiments were conducted in the presence of insulin and picropodophyllin (PPP), a selective inhibitor of IGF-I receptor.

2.方法

2.1。腱祖细胞（TPC）隔离

的TPC从先前描述的使用协议成年马三个健康（4-6岁）浅数字屈肌腱分离[14-16，24]。这些细胞通过细胞表面标记物的表达（CD 44，其特征在于⁺，CD29⁺，CD90⁺和CD45^-)及上文所述的体外三叶分化[15，16，24]。一个完整的前肢浅屈肌腱从安乐死无关的骨骼疾病原因，年轻的成年马收获。一个1-2 cm length of the midsubstance tendon specimen, free of peritendinous tissue, was diced into 0.25 cm³件和消化在0.2％胶原酶（沃辛顿）的DMEM，在37℃在补充有2％胎牛血清（双子生物医学）16小时。释放的细胞通过过滤和离心分离，将细胞以500个细胞/平方厘米接种²在高葡萄糖单层培养DMEM补充有10％胎牛血清，37.5 μg/mL抗坏血酸，300μ克大号-glutamine/mL 100 U of sodium penicillin/mL, and 100 μ克硫酸链霉素/毫升（基础培养基）。这些细胞接种到细胞培养瓶中，并在37℃，5％CO培养₂以使集落形成。培养基每3天更换。一旦可辨别的菌落形成（> 200个细胞/集落），将细胞用0.02％EDTA和0.05％胰蛋白酶分离。细胞数通过计数使用血球和反相光学显微镜得到的悬浮液的等分试样来计算。台盼蓝染料排除来评估细胞存活力。主小区分离物在再接种 /厘米²在融合度80-90%时传代2次，扩大细胞数量，丰富祖细胞。

2.2。细胞增殖

第3级的TPC分别在接种 /厘米²在96孔板中的基础培养基。一个fter 1-day culture, insulin (at 0 nM, 0.007 nM, 0.07 nM, and 0.7 nM concentrations; Humulin™ U-100, Lilly, USA) treatments were added and incubated for 3 days. Three replicate wells for each treatment group were used to measure the cell numbers via a mitochondrial metabolic assay (Cell Titer MTT 96 aqueous one solution cell proliferation assay, Promega) which was used in accordance with the manufacturer’s instructions. In brief, 20 μ含测定试剂四唑L的溶液中加入到96孔板中含100的每个孔 μ新鲜培养基的L和在37℃下温育2.5小时。一个bsorbance was measured at 490 nm in a microplate reader (Tecan™ Infinite 200 PRO plate reader) to detect concentrations of the metabolic product, formazan. The mean value was calculated from replicate wells to provide a single data point. These optical density values from plated TPCs from each horse were reported.

2.3。成骨分化

第3级的TPC分别在接种 细胞/平方厘米²在6孔细胞培养板和在完全DMEM维持，直至它们达到80-90 %%汇合。Complete DMEM was then substituted with osteogenic medium (complete DMEM supplemented with 10 mMβ甘油醛-3-磷酸，50 μg/mL抗坏血酸，100 nM地塞米松)或含有0.07或0.7 nM胰岛素的成骨培养基(Humulin®U-100，礼来，美国)。培养基每48-72小时更换一次[15，16]。培养物维持14天。In addition, TPC osteogenic cultures (with 0, 0.07, and 0.7 nM insulin) were also maintained with or without 100 nM picropodophyllin (PPP; Selleckchem, # S766802), a small molecule inhibitor of IGF-I receptor. Control osteogenic cultures were cultured (+/- insulin) with an equal amount of DMSO.

2.4。成骨文化的茜素红染色

一个t days 0, 7, and 14 of osteogenic culture, the medium was aspirated from the cell cultures and the cell monolayers were fixed with 1 mL of 4% formalin at room temperature for 30 minutes. After fixation, the cell layers were washed three times with PBS. One mL of 2% Alizarin Red (Sigma-Aldrich) solution (2 g of Alizarin Red dye dissolved in 100 mL of Milli-Q water; pH adjusted to 4.2) was added to each well and incubated at room temperature for 15 minutes. The unbound stain was then removed, and the cells were washed 3-4 times with water until the rinse solution was clear. Mineral deposits within the cell layers stained bright red. Low-magnification (10x) images were obtained prior to osteogenic differentiation and at days 7 and 14 of osteogenic culture. An inverted light microscope (Leica Microsystems, Leica Application Suite-LAS-version 6.0) was used to assess mineralized matrix deposition.

2.5。RNA分离和定量RT-PCR

总RNA利用先前描述的方案[分离15，25]。根据制造商建议的协议在硫氰酸胍 - 苯酚 - 氯仿溶液试剂（TRIzol试剂，Invitrogen公司）将样品均质化。将所得的沉淀物使用，其中包括柱上DNA酶消化的RNeasy硅胶柱纯化。The concentration of RNA was determined by measuring the absorbance at 260 nM (A260) and 320 nM (A320) in NanoDrop One/One® (Thermo Fisher Scientific). Oneμ从每个样品的RNA的克逆转录（上标IV，Invitrogen公司），使用寡聚（dT）引物。马基因特异性引物从Genbank中，并使用ClustalW多重序列比公开的序列设计（可在http://www.ebi.ac.uk）（表1）。特异性引物通过克隆，并在优化实验测序扩增子，如前所述证实。PCR扩增通过SYBR绿的存在Taq DNA聚合酶（ABI QuantStudio 3™，赛默飞世尔科技）催化。使用2相对基因表达进行定量^-ΔΔCT方法，归一化到内参基因表达，伸长因子-1α（EF1α）26]。

2.6。碱性磷酸酶（ALP）的生物活性测量

碱性磷酸酶生物活性的测定如前所述[27]。简单地说，前和在成骨培养的第14天，将细胞收获在300 μ大号of lysis buffer (20 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, and 1% Triton X-100). Each sample was homogenized, centrifuged at 600 rcf for 15 minutes at 4°C, and kept on ice for 30 minutes. The supernatants were assayed for ALP activity using a commercially available ALP assay kit (Wako Chemicals) that measured the conversion of p-nitrophenylphosphate to p-nitrophenol. The intensity of yellow generated by this reaction after 10 minutes of incubation was measured at 405 nm wavelength (Tecan® Infinite 200 PRO plate reader).

每个样品的相对生物活性ALP通过正常化所测量的对硝基苯酚的释放/分钟至相应的DNA含量来确定。

2.7。DNA测试

DNA含量使用定量-IT的PicoGreen双链DNA试剂盒（Invitrogen）进行测定。小号amples were diluted 1 : 5 in 1X TE buffer (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5). Serial dilutions of lambda DNA were used to generate a standard curve. Duplicate 100 μ每个样品的升份数和标准品转移到黑色96孔微孔板。一百μ大号的PicoGreen试剂（1 μL PicoGreen试剂稀释200μL的1X TE缓冲液)加入到每个样品和标准品中。微板置于暗处，防止试剂光降解。孵育5分钟后，在485 nm波长下测定荧光(Tecan®Infinite 200 PRO平板阅读器)。

2.8。统计分析

定量数据（相对mRNA表达，碱性磷酸酶活性）的正常分布使用使用的SigmaPlot软件14（SYSTAT软件®）的Kolmogorov-Smirnov检验证实。该数据代表至少三次独立实验，各一式三份完成的。所有的结果都表示为 。之一-way ANOVA was used to compare 0.07 and 0.7 nM insulin supplementation with untreated osteogenic cultures at day 14 of osteogenesis. A的≤0.05值被认为是统计显著。

3.结果

3.1。胰岛素增加体外增殖的TPC（图1）

一个fter 3 days of monolayer culture with insulin, TPC proliferation with 0.7 nM insulin was significantly increased (~2-fold, ）与未处理的对照。There was no significant difference in TPC proliferation with 0.007 and 0.07 nM insulin compared to untreated control.

3.2。的TPC体外的胰岛素增加成骨分化（图2）

3.2.1。茜素红染色

胰岛素增加在TPC成骨培养物中的聚集体形成和相关的茜素红染色（图图2（a））。大号arger mineralized nodules were noted in osteogenic cultures containing 0.07 and 0.7 nM insulin, in a dose-dependent manner, at both day 7 and day 14 compared to untreated controls. By day 14, intense staining of mineralized nodules, indicative of robust osteogenic differentiation, was evident in osteogenic cultures containing insulin compared to untreated controls.

3.2.2。成骨基因表达

在当天的成骨文化的14，Runx2的mRNA水平显著上升（ ）随着增加胰岛素浓度（图图2（b））。The Runx2 mRNA level of osteogenic cultures with 0.7 nM insulin ( ）was significantly higher than that with 0.07 nM insulin ( ; ）和未处理的对照（1; ）。There was no significant difference in the Runx2 mRNA level of 0.07 nM insulin and control osteogenic cultures. Similarly, the ALP mRNA level of day 14 of osteogenic cultures with 0.7 nM insulin ( ）were significantly higher than that with 0.07 nM insulin ( ; ）和未处理的对照（1; ）。There was no significant difference in the ALP mRNA level of 0.07 nM insulin and control osteogenic cultures. The Osteonectin mRNA level in day 14 of osteogenic cultures with 0.7 nM insulin ( ）was significantly higher than that with 0.07 nM insulin ( ; ）和未处理的对照（1; ）。The Osteonectin mRNA level in day 14 of osteogenic cultures with 0.07 nM insulin was significantly higher ( ）比未经处理的对照。

3.2.3。碱性磷酸酶（ALP）活性

在成骨细胞培养碱性磷酸酶的生物活性均符合转录成果上述报道。一个大号P bioactivity (mmol/L p-nitrophenol) of day 14 of osteogenic culture with 0.7 nM insulin ( ）was significantly higher than that with 0.07 nM insulin ( ; ）和未处理的对照（ ; ）。There was no significant difference in ALP bioactivity of 0.07 nM insulin and control osteogenic culture.

3.3。胰岛素差异上调IGF-I受体的TPC成骨分化过程中的mRNA（图3）

TPC的成骨分化（不补充胰岛素）不诱导IGF-I受体或胰岛素受体mRNA的上调。In day 14 of osteogenic cultures, both 0.07 and 0.7 nM insulin groups had significantly increased ( ; ; ; ）IGF-I受体mRNA水平。相比之下，补充胰岛素来TPC成骨文化没有上调胰岛素受体mRNA水平。

3.4。鬼臼苦素的效果（PPP）上的TPC的胰岛素介导的成骨分化（图4）

3.4.1。茜素红染色(图图4（a））

小号imilar osteogenic cultures of TPCs with 0.07 and 0.7 nM insulin were also maintained in the presence of 100 nM PPP, a specific inhibitor of IGF-I receptor. Addition of PPP to control osteogenic cultures did not prevent cell aggregation and secretion of mineralized matrix. However, addition of PPP to osteogenic cultures containing insulin prevented aggregation and deposition of mineralized matrix. There was minimal Alizarin Red stain uptake in day 14 of osteogenic cultures treated with PPP and 0.07 and 0.7 nM insulin.

3.4.2。成骨基因表达

Given that, 0 and 0.07 nM insulin groups were not consistently different from each other, and the effect of PPP was assessed in the 0.7 nM insulin group. In day 14 of osteogenic cultures treated with PPP and 0.7 nM insulin, mRNA levels of Runx2, ALP, and Osteocalcin were significantly reduced compared to the 0.7 nM insulin group. The mRNA levels of all 3 osteogenic markers in day 14 of osteogenic cultures treated with PPP and 0.7 nM insulin and osteogenic control group were not significantly different from each other.

3.4.3。高山生物活性

Consistent with transcriptional results, ALP bioactivity in day 14 of osteogenic cultures treated with PPP and 0.7 nM insulin was significantly reduced compared to insulin alone and was similar to osteogenic control.

4。讨论

鉴于胰岛素/ IGF-I的间充质干细胞的作用（MSC）成骨[22，23，28-三十]，我们推测胰岛素促进增殖和TPC的体外成骨分化。我们的研究结果表明，胰岛素后单层培养3天后显著上升TPC增殖。其次，胰岛素显著增加相比，控制成骨培养物的TPC的体外成骨能力，以剂量依赖的方式。这些结果支持了我们的假设。有趣的是，增加鬼臼苦素，选择性IGF-1受体抑制剂，胰岛素处理的培养物减轻的TPC的增强成骨细胞分化的能力，并返回到基线水平作为控制成骨培养物。

我们的实验侧重于评估持续高胰岛素血症或胰岛素敏感性受损对TPCs的影响。本研究中使用的胰岛素浓度是从高胰岛素血症/胰岛素抵抗患者的血浆胰岛素浓度推断出来的[31，32]。胰岛素已经显示出对几种细胞类型促增殖作用，包括间充质干细胞/祖细胞[33-38]。胰岛素和IGF-I的配体和它们的各自的受体占有率在真核细胞中它们的信令特性[标注的相似22]。胰岛素通过结合到胰岛素和/或IGF-I受体和Akt和/后续活化或ERK途径[细胞增殖增加33，34，37]。类似地，IGF-I的抑制细胞周期阻滞在经由Akt途径的TPC，并因此增加了细胞增殖[39-42]。虽然我们尚未研究胰岛素对TPCs促增殖作用的机制，但可能存在类似的机制。另一方面，Lin等人研究表明，高糖可降低体外TPC增殖，诱导细胞凋亡[21]。由同一组随后的研究表明，从大鼠分离实验的糖尿病的TPC不得不与对照相比的TPC减少的体外增殖的速率。在两项研究中，单独的高血糖在糖尿病病理生理刺激上的TPC的特性进行了评价。在这些研究结果，评估高胰岛素和TPC存活率高葡萄糖的组合效应的光/增殖是必要的。

胰岛素起着骨骼骨的形成和维护[关键作用43]。胰岛素刺激内源性IGF-I通过结合到IGF-I受体，也是一个关键因素为成骨细胞分化和骨发育[信令44，45]。在这项研究中，胰岛素增强通过上调Runx2的，成骨细胞分化的主转录调节的mRNA的表达，以剂量依赖性方式TPC成骨能力。Runx2的上调是必要的临界基质蛋白如胶原蛋白I型，骨钙蛋白，骨桥蛋白和随后的表达。通过Akt和/或ERK途径[发生活化通过IGF-I介导的成骨分化和矿化在其他MSC类型配体证实22，23，34，46]。鉴于胰岛素和IGF-I激活相似的细胞内信号通路，胰岛素可能会提高的TPC经由Akt和/或ERK途径的活化成骨能力。

我们的数据表明，补充胰岛素（在本研究中使用的浓度）TPC成骨过程中差异上调IGF-I受体mRNA表达而不在胰岛素受体mRNA表达的显着变化。为此，PPP加入到防止胰岛素治疗TPC成骨培养物中增加的成骨分化（成骨mRNA水平，矿化基质分泌分摊茜素红染色，和碱性磷酸酶活性）的TPC的。由于PPP没有用的TPC的基础骨干扰的能力，在tenogenesis牺牲利于骨化条件之间复杂的相互作用是可能的。最近的一项研究由江等人。表明，IGF-I强化骨髓来源的MSC [诱导BMP9成骨分化47]。接受骨形态发生蛋白（BMP）信令失调的作用（上调BMP受体-1A，BMP受体2，的Smad1，Smad5的和的mRNA）在肌腱病变骨化和经受的TPC在体外和体内成骨[12，48，49]，在胰岛素治疗的TPC评估BMP信号是必要的。

这些体外结果的临床重要性需要进一步调查，因为胰岛素敏感性/高胰岛素血症障碍是与糖尿病患者的高血糖症的组合经常存在。关于TPC扩散，我们的研究，等等，证明了高胰岛素血症是亲增殖，而高血糖降低的增殖。与此相反，的TPC的总成骨能力DM（高胰岛素和高葡萄糖）的两个病理生理的刺激下增加，并且可以支持TPC-介导的病理骨化。接受肌腱ECM和肌腱动态平衡和生物活性TPC机械负载的关键作用，这些成果将需要在体内得到证实。单独或与高血糖组合受损的胰岛素敏感性表示underlies退化过程在心血管组织，具体而言，干扰ECM组件导致钙化糖尿病患者的重要触发。虽然这导致对炎症/愈合的条件下异常表型TPC的机制不同广泛，这些实验代表在确定高胰岛素血症对TPC活性和表型的影响的第一步。

5.结论

总之，增加的胰岛素增殖和体外屈肌腱来源的祖细胞的成骨能力。鬼臼苦素，选择性IGF-I受体，减轻的另外增加的TPC的成骨能力，表明IGF-I信号传导在的TPC的胰岛素介导的成骨细胞分化中起重要作用。这些结果表明，高胰岛素血症可能改变TPC表型，随后影响修复肌腱组织的质量。需要进一步的研究，以确定参与糖尿病肌腱细胞和生物过程。

数据可用性

所有用于支持本研究结果的数据均包含在本文中。

泄露

本文是提出一部分作为骨科研究学会2019年会上，德克萨斯州奥斯汀（2月2日至5日）的海报。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

作者要感谢在Durgam SS描述工作的机构。2016“体外表征和马的体内评估肌腱来源的祖细胞的细胞”论文提交给伊利诺伊大学的部分要求，哲学博士。

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