旁分泌Proangiogenic人类骨骨髓来源间充质干细胞的功能不受慢性肾脏疾病的影响

文摘

背景。细胞疗法正在开发以满足治疗的需要治疗慢性肾脏疾病(CKD)。骨髓(BM)派生间充质基质细胞(msc)增强组织修复和诱导neoangiogenesis通过旁分泌作用分泌蛋白质和细胞外囊泡(EVs)。同种异体BM msc管理不太理想的患者可能需要肾移植,但自体msc的效力应该确认,因为之前的迹象表明CKD-induced障碍存在。在CKD BM msc已经建立的免疫调节能力,还不知道CKD影响伤口愈合和血管生成的潜力MSC-derived厘米和电动汽车。方法。msc是从BM培养从肾移植受者( )或肾脏捐赠者( )。通过3 BM msc和BM MSC-conditioned介质(CM)被用于实验。电动汽车被微分超速离心法分离从CM。BM MSC分化能力、扩散和senescence-associatedβ牛乳糖活动评估。在体外promigratory proangiogenic能力评估了BM MSC-derived厘米和电动汽车的使用在体外刮伤试验和人工基底膜血管生成试验。结果。健康和CKD BM msc表现出相似的分化能力,扩散,senescence-associatedβ牛乳糖活动。刮伤移民健康和CKD msc(之间没有明显不同 )。健康和CKD BM MSC-derived厘米诱导类似的小管形成( )。也没有差旁分泌再生功能的电动汽车(刮伤: ;tubulogenesis: )。结论。我们的研究结果表明,msc具有内在生产能力proangiogenic旁分泌因子,包括电动汽车在内的关于慢性肾病不受捐赠者的健康状况的影响。这表明,自体MSC-based在慢性肾病治疗是一个可行的选项。

1。背景

慢性肾脏疾病(CKD)影响~ 10%的世界人口,导致高发病率和死亡率[1]。内皮损伤在慢性肾病的发展中扮演着重要角色2,3]。连接建立后,CKD遵循渐进的炎症和纤维化,最终导致终末期肾功能衰竭,需要肾脏替代治疗。从临床的角度来看,肾移植仍然是最好的治疗终末期肾功能衰竭,但缺乏并且长期移植失败仍然是30至50%十年(具有重要的意义4]。治疗减缓或逆转慢性肾病进展因此迫切需要。

骨髓(BM)派生间充质基质细胞(msc)的antifibrotic, proangiogenic,和免疫调节特性,这使得BM MSC-based治疗CKD一个可行的选择5]。BM msc分泌旁分泌因子,生长因子和细胞因子等,增强局部血管生成和组织修复6,7]。BM MSC-secreted细胞外囊泡(EVs)也起着关键作用的proangiogenic msc的属性(8]。事实上,BM MSC-based再生医学的方法正在开发治疗CKD,旨在阻止纤维化的进展血管再生,刺激肾脏再生,或增强肾移植后免疫调节。这些治疗方法包括细胞或细胞(分泌的产品管理9- - - - - -11]。BM msc是一种有效的治疗慢性肾病的临床前动物模型(12]。以下有前景的结果,临床应用的BM msc正在调查I和II期研究(13]。

对于许多应用程序,管理同种异体BM msc是一个可行的选择,由于他们的免疫调节特性,抑制排斥反应(14]。然而,BM msc可能不是完全immunoprivileged [14,15]。自体疗法因此应该考虑这些patients-provided disease-induced功能障碍不存在。临床前研究表明显著减少血管再生的影响BM单核细胞的捐助者与心血管疾病(CVD),包括慢性肾病(16]。在culture-expanded msc、心血管疾病的影响是不太清楚,矛盾的报告根据心血管疾病(模型)和小信息CKD [17]。MSC免疫调节特性似乎保存在BM MSC,尽管目前未知是否CKD负面影响的旁分泌再生潜力BM MSC及BM MSC-derived EV (17- - - - - -19]。

验证维护BM MSC旁分泌proangiogenic函数是这样的重要一步CKD MSC-based再生医学的发展策略。在这里,我们调查BM-derived MSC及电动汽车的再生潜力来自BM MSC CKD患者和健康对照组。

2。材料和方法

2.1。研究参与者

本研究经当地机构审查委员会批准的乌得勒支大学医学中心(METC 12号- 127)和符合《赫尔辛基宣言》。书面和口头知情同意是由包含之前所有的参与者。肾移植和肾脏捐赠者参与活体供项目和18岁以上的人有资格参与。排除标准为CKD患者(肾移植)干细胞移植过去,和一般感染肾移植是活跃的排除标准:B和C型肝炎,肺结核、人类免疫缺陷病毒;预期寿命的< 2年;和恶性肿瘤治疗治疗。排除标准为健康对照组(肾脏捐赠者)干细胞移植在过去和现在的肾脏疾病。一周骨髓采集之前,所有CKD患者开始口服免疫抑制方案准备肾移植,由霉酚酸酯(MMF) 750毫克每天两次和强的松7.5毫克,每日一次。

2.2。BM愿望

BM愿望发生在麻醉诱导肾脏捐献或移植过程。BM愿望是由髂骨依照标准操作程序联电乌特勒支的血液科。T-Lok骨髓活检装置(氩医疗设备,弗里斯科,TX)使用。20毫升的吸气骨髓收集heparin-coated真空管。

2.3。材料和试剂

所有试剂都是来自ThermoFisher除非另有说明。

2.4。MSC隔离和扩张

BM跨国公司是通过梯度密度离心使用Ficoll-Paque (Sigma-Aldrich Zwijndrecht, NL)。 BM跨国公司是在一个6-well镀板2毫升αmem + 10% FCS (Gibco), 0.1 ng / mL碱性纤维母细胞生长因子,100μ青霉素、链霉素M抗坏血酸,1%。24小时后,介质改变,随后介质变化三次一个星期。当细胞达到80%融合,细胞受移植者25厘米²,然后75厘米²,然后 。在第三段,细胞被冻结α包含10% DMSO溶液和20% FCS mem。先生的被用来确保冻结速度控制。所有实验通过3 + 1细胞(洗和粘在一夜之间)。实验开始后48 h解冻和播种的冻存细胞。

2.5。流仪分析msc

10000年对于每一个标记,msc彩色像前面描述的那样20.]。细胞分离使用TrypLE表达(Gibco)重组胰蛋白酶。使用磷酸盐+ 2% FCS TrypLE是无效的。细胞培养30分钟在4°C在黑暗中与人类货代阻塞试剂(Miltenyi研究,莱顿,NLD)和以下抗体:CD45-PE (# 560975 BD Pharmigen布雷达,NLD), CD14 (# R0864, Dako Heverlee,贝尔),CD19 (130-091-328, Miltenyi) CD34 (BD # 555821), CD73 (BD # 550257), CD90 (# B113673 Biolegend,下降,DE), CD105-Fitc (FAB 10971 f,研发,明尼阿波利斯,美国),和CD140b (BD # 558821)。随后,细胞与PBS + 2% FCS洗。细胞荧光测量在FACSCanto二流式细胞分析仪(美国新泽西州,正欲富兰克林湖)。SYTOX蓝色(分子探针/表达载体,尤金,或者美国)被用于排除死亡细胞。

2.6。EV隔离和蔗糖梯度分析

电动汽车是13从条件培养基分离MSC(6控制,7 CKD)。EV隔离,BM msc在EV-free培养介质(准备使用FCS离心机进行至少1小时200000× ,紧随其后的是0.2μ过滤灭菌)。每个参与者,msc增长到80%在8 x T175烧瓶内融合。CM集合开始洗后细胞。厘米是24小时收集一段时间。EVs然后从CM通过微分超速离心法分离(如前所述)(21]。

蔗糖梯度分析,250年resuspended液μL 2.5蔗糖,20毫米Tris-HCl (Tris-hydrochloride), pH值7.4,飘到一个线性蔗糖梯度(2.0 - -0.25 M蔗糖,20毫米Tris-HCl, pH值7.4)190000×16小时 。梯度分数(250μ通过免疫印迹L)收集和分析。

2.7。免疫印迹的msc和电动汽车

疣状EV-derived蛋白质是由西方墨点法(如前所述)(22,23]。外来体样本稀释1:1的外来体样品缓冲(5% SDS, 9 M尿素,10毫米EDTA, 120毫米Tris-HCl, pH值6.8,2.5% beta-mercaptoethanol)和加热(95°C, 5分钟)。细胞样本,从文化表面细胞刮,resuspended在裂解缓冲(1% SDS和0.1% Triton x - 100在PBS蛋白酶抑制剂(完整的迷你,EDTA免费,罗氏)),在冰上和孵化了30分钟。基因组DNA是通过27 G针剪的4倍。随后,膜被孵化的以下抗体:rabbit-anti-GAPDH(美国细胞信号,波士顿,MA), rabbit-anti-Flottilin-1(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),goat-anti-Lamin A / C(圣克鲁斯生物技术),mouse-anti-ATP5A (Abcam,剑桥,英国),或rabbit-anti-Tom20(圣克鲁斯生物技术)。

二级抗体,1:2000稀释affinity-purified猪anti-rabbit rabbit-anti-mouse或驴抗体结合辣根过氧化物酶(Dako、斯特鲁普、丹麦)。抗原抗体反应是可视化增强化学发光根据制造商的指导方针(化学发光过氧化物酶底物,σ)和成像使用GelDoc XR +系统(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。

2.8。Nanosight纳米粒子跟踪分析

泡大小决定使用Nanosight NS500 (Marvern,伍斯特,英国)以下捕捉设置:相机水平:13日,滑块快门:1232年,滑块获得:219 5的检测,autoblur模式分析。

2.9。脂肪形成的分化

40000细胞孵化抑制脂肪形成的分化培养基为14天(介质变化三次一个星期)。脂肪形成的分化是由LipidTOX评估绿色染色(1:200)固定后PFA的4%。荧光测量使用荧光谱仪(Fluoroskan Thermofisher)。使用PrestoBlue值纠正细胞生存能力评估。微观确认的脂肪滴,细胞被沾染了赫斯特33342(1:1000)和成像倒置显微镜(奥林巴斯、Zoeterwoude NLD)。

2.10。成骨分化

40000细胞(孵化了干细胞成骨分化培养基为14天。成骨分化是评估通过测量使用对硝基苯磷酸盐(pNPP)碱性磷酸酶活性。细胞细胞溶解三羟甲基氨基甲烷/ SDS缓冲液和转换pNPP基质作为碱性磷酸酶的代理活动测量通过测量吸收在405 nm荧光谱仪(Fluoroskan Thermofisher)。使用PrestoBlue值纠正细胞生存能力评估。显微镜确认骨形成,细胞与茜素红染色,如前所述[24]。msc被固定为4% ( )多聚甲醛在室温下15分钟。细胞被染色和40毫米茜素红染色20分钟的解决方案。与PBS细胞被洗4次,用倒置显微镜拍摄照片(奥林巴斯、Zoeterwoude NLD)。

2.11。Chondrogenic分化

100000细胞被洗干Pro Chrondrogenic分化培养基和颗粒状的底部15毫升锥形离心管的50015分钟。细胞被孵化与茎Pro Chrondrogenic分化培养基为28天(介质变化三次一个星期)。粘多糖含量测定与BlyScan工具包(英国Carrickfergus NBiocolor)。

2.12。扩散

测量扩散,xCElligence RTCA DP平台使用(究其生物科学,圣地亚哥,CA)。500个细胞(一式四份)镀E16天板。增长曲线建立了使用电阻抗。使用PrestoBlue可行性分析结果进行验证。

2.13。收集的条件培养基

80000细胞/捐赠者被播种6-well板,和细胞坚持24小时。用无血清细胞被洗αmem和新鲜血清αmem是补充道。24小时后,条件培养液(CM)中收集的血清αmem 24小时。厘米是离心机,享年2000岁10分钟前冷冻和储存在-80°C。

2.14。小管形成分析

小管形成能力是衡量使用HMEC-1细胞(16通道)。10厘米是分层的μl凝固生长因子减少人工基底膜(BD、Vianen NL) IBIDI血管生成μ幻灯片(慕尼黑,德)。10000 HMEC-1细胞在无血清resuspendedαmem和播种到厘米。试验进行了一式三份。16小时后,显微照片拍摄在4 x放大。小管网络手动跟踪在Adobe Photoshop,随后分析了使用AngioAnalyzer ImageJ插件,提供junction-to-tubule长度比率作为衡量网络成熟。值作为相对于每个实验积极控制和规范化。

2.15。内皮刮伤试验

HMEC-1细胞被播种在24-well板和成长直到融合。创建使用p100吸管提示。PBS的细胞被洗一次去除分离细胞。条件培养基或控制中应用。照片在特别标记的位置在6小时后接受基线。一式四份的进行分析。抓三角洲宽度像素在Adobe Photoshop手动测量,计算和%迁移划痕宽度除以 的宽度 。值作为相对于每个实验积极控制和规范化。

2.16。衰老

40000个细胞被播种12-well板。Senescence-associatedβ如前所述(牛乳糖活动评估25]。短暂,隔夜孵化后,细胞培养1小时和100 nM bafilomycin A1(σ)引起溶酶体碱化。随后,5-dodecanoylaminofluorescein di -β-D-galactopyranoside (C12FDG英杰公司)添加到最后一个30的浓度μM,细胞被孵化一个额外的小时。细胞使胰蛋白酶化和PBS洗。细胞荧光中值FITC通道使用流式细胞仪量化。SYTOX^®蓝色(表达载体)添加立即测量坏死细胞识别之前,被排除在分析之外。

2.17。统计分析

在IBM SPSS统计分析进行24版本以及棱镜Graphpad 6.01版。值作为相对于健康对照组,允许比较CKD和控制msc。比较连续变量是通过学生的正态分布数据的测试或Mann-Whitney测试为非正态的分布式数据。比率生成使用事业方法(26]。如果有必要,为非正态的分布参数,使用引导手段和SD生成。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。隔离和表征msc

从骨髓msc得到32研究参与者(17 15肾脏健康的肾脏捐赠者和接受者)参与活体供肾移植程序乌得勒支大学医学中心。骨髓是吸气的麻醉诱导后髂嵴捐赠或移植过程。表1列出了参与者的特征。msc成功扩大从所有BM跨国公司文化。msc CD73显示,CD90、CD105和CD140b,不显示CD14、CD19、CD34、CD45(补充图S1)。扩张的时间是相似的样本(数据未显示)。

3.2。Trilineage分化潜能

所有MSC行显示向脂肪细胞分化的潜能,骨细胞和软骨细胞。健康和CKD msc没有关于trilineage分化差异(图1)。脂肪分化,随着评估LipidTOX绿色染色,显示没有区别CKD和健康的msc(图1 (b)比CKD:健康的1.06,95%置信区间CI: 0.87 - -1.28, )。成骨分化决定与碱性磷酸酶(美联社)活动也没有差别(图1 (d)比CKD:健康的0.76,95%置信区间CI: 0.37 - -1.55, ),虽然有一个趋势美联社CKD组的活动更少。粘多糖含量软骨细胞颗粒群体之间的相似(图1 (e),比CKD:健康:1.09,95%置信区间CI: 0.73 - -1.62, )。双向方差分析并没有显示性之间的关联和分化能力。他汀类药物之间的分化能力也没有不同用户和他汀类药物使用者(补充图S2)。

3.3。扩散

扩散是实时评估使用xCELLigence平台(图2(一个))。没有细胞指标的健康和CKD msc的区别也没有推断人口倍增时间(图的差异2 (b)比CKD:健康的0.79,95%置信区间CI: 0.54 - -1.15, )。线性回归并没有显示年龄和人口倍增时间(参与者之间的关系 )也没有与参与者之间的关系性( )。

3.4。衰老

通过测量senescence-associated衰老评估β使用荧光底物(C12FDG)牛乳糖活动。CKD和健康的msc之间有显著差异;β牛乳糖活动在健康msc高于CKD msc(图2 (c),比CKD:健康的0.79,95%置信区间0.64 - -0.99, )。衰老与年龄无关(图2 (e)),但它是不同的生物性别之间(图2 (f),比女性:男性1.38,95%置信区间CI: 1.12 - -1.69, )。平均年龄不是两性不同的( )。双向方差分析表明,生理性别显著影响衰老(图2 (f), )。线性回归分析并没有显示出衰老与分化的程度(补充图S3)。

3.5。旁分泌的影响MSC-Derived条件培养基和电动汽车

3.5.1。条件培养基

无血清条件培养液(CM)收集每个MSC的线,用于功能化验与人类微血管内皮细胞(HMEC-1)评估的旁分泌功能MSC。

3.5.2。刮伤迁移分析

MSC CM HMEC-1迁移的影响,研究了利用刮伤试验,模型内皮细胞迁移,因为它发生在损伤血管腔(图3(一个))。细胞迁移的程度对MSC厘米之外是内皮细胞的旁分泌刺激。健康和CKD诱导MSC厘米类似HMEC-1细胞的迁移。(比CKD:健康1.28,95%置信区间CI: 0.89 - 1.77, )(图3 (b))。刮伤迁移没有与衰老或使用他汀类药物,但刮伤迁徙能力增加女性(比女性:男性1.4,95%置信区间CI: 1.02至1.96, )。双向方差分析显示性之间的关联和旁分泌功能( )(补充图S4)。

3.5.3。小管形成分析

MSC CM诱导血管生成的能力与小管形成评估分析(图3 (c))。没有区别健康和CKD厘米(CKD比例:健康0.89,95%置信区间CI: 0.76 - -1.05, )(图3 (d))。小管形成与生理性别,衰老,或者使用他汀类药物(补充图S4)。

3.6。旁分泌的影响BM MSC-Derived细胞外囊泡

3.6.1。细胞外囊泡

EVs微分超速离心法分离的条件培养基从13 MSC文化源自男性参与者,包括7 CKD患者和6健康control-derived MSC。为msc (EVs显示一个典型的规模和配置文件27),在数量上没有差别或电动车(补充图的大小S5)。没有污染的细胞核和线粒体,可来自死细胞,验证了免疫印迹的线粒体蛋白质ATP5a TOM20,和核膜蛋白核纤层蛋白A / C。与细胞,这种比较明确的浓缩的外来体标记Flotillin-1可以观察到在孤立的囊泡。(图4(一))。蔗糖密度梯度分析和后续的免疫印迹β肌动蛋白和Flotillin-1证明了孤立EVs密度为1.10 g / mL(图4 (c))。这些囊泡的公称尺寸,验证了Nanosight纳米粒子跟踪分析,是159纳米(图4 (b))。

操作。刮伤迁移和小管形成试验

专门调查的再生能力是否MSC-derived液(或小EV)是影响疾病状态,刮伤的孤立的囊泡的刺激功能迁移和基底膜基质血管生成分析评估。CKD和健康MSC-derived EVs诱导内皮迁移的刮伤迁移试验。没有统计学差异(图5(一个)比CKD:健康的0.86,95%置信区间CI: 0.34 - -1.42, )。基底膜基质血管生成分析显示类似tubule-length-to-junction比率对健康和CKD MSC-derived EVs(图5 (b)),比CKD:健康的1.33,95%置信区间CI: 0.52 - -2.27, )。电动汽车和CM血管生成潜力(没有联系 )。

4所示。讨论

我们表明,CKD并不影响的内在能力BM msc生产proangiogenic旁分泌因子,包括电动汽车。我们证明,厘米,EVs来源于CKD患者BM msc显示相似在体外血管生成潜力和诱导内皮倾向刮伤迁移。此外,我们发现CKD不会导致衰老,也没有改变分化能力的提高和msc的增长率。

有一个持续的辩论MSC-based疗法是否应该执行与自体或同种异体细胞。在许多情况下,同种异体msc是首选,因为他们可以“现成的”,因此可以用于急性心肌梗死等条件。最后,许多疾病已经被证明能够影响干细胞利基,减少潜在的有效性patient-derived祖细胞(28]。msc已被证明比其他细胞类型不受此影响考虑细胞疗法,但疾病功能障碍是否携带在细胞产品似乎取决于疾病(17]。

然而,也潜在的局限性同种异体的治疗,主要是有关alloimmunity和拒绝的发展。有越来越多的证据表明,msc将引起移植免疫反应一段时间后,最终拒绝了(29日]。这是否影响他们的临床效用取决于应用程序。临床研究表明,单一的同种异体msc是安全的,政府可能有效的缺血性心脏病(30.]。临床前研究表明,在慢性肾病,重复注射往往需要改善疾病进展(31日,32),这可能会增加敏感的可能性不理想的患者可能需要肾移植。为这些病人自体msc可能更为可取,提供疾病有限功能障碍为我们演示了在目前的研究中。

在目前的研究中,我们主要集中在获得理学硕士学位申请早在CKD的疾病过程,重点是旁分泌血管生成功能。对于许多再生医学应用,说明这个问题是非常重要的,因为分泌的旁分泌proangiogenic因素是一个重要的机制,msc施加的影响(7,33- - - - - -35]。有初步迹象表明,旁分泌功能可能不是保存在慢性肾病。祖细胞在实验CKD显示一个改变旁分泌,包括减少血管内皮生长因子(VEGF)的表达,减少迁移趋化现象的刺激(16,36]。此外,在体外研究表明,尿毒症的环境负面影响祖细胞的功能(37,38]。虽然细胞功能障碍可能是通过解决体外文化,在许多心血管疾病,MSC障碍仍然存在(17]。研究msc CKD患者产生了相互矛盾的结果;Yamanaka)和他的同事们研究发现,脂肪组织——(-)派生MSC显示减少proangiogenic MSC移植后影响在活的有机体内(39),对比Reinders及其同事的研究显示,慢性肾病和健康的msc来源于和BM产生类似数量的细胞因子的proangiogenic msc的属性在体外(18,19]。重要的是,没有功能测试BM MSC旁分泌能力。我们发现CKD并不影响BM MSC厘米的旁分泌功能有关的刺激血管生成和迁移是一个重要的附加当前身体患病个体的MSC函数的知识。这些结果也强调了个人间差异MSC函数不一定是依赖疾病状态,类似于我们的发现在危重肢体缺血。性能在小管形成分析不同个体间独立存在的疾病(20.]。鉴于“健康”msc未必显示足够的旁分泌效应的潜力,捐赠者筛查可能是必要的。

电动汽车由msc分泌对msc的旁分泌作用至关重要(40,41]。在临床前研究中,MSC-derived EVs的确有助于康复肾损伤和预防慢性和急性肾损伤(42- - - - - -44]。在一个小安慰剂对照临床研究中,电动汽车管理从脐cord-derived msc CKD患者良好的对肾功能的影响(13]。这是迄今为止未知的CKD是否会影响MSC-secreted电动汽车的功能特性,但它是可能的,因为压力条件或疾病可以改变EVs由细胞分泌的内容,可能影响靶细胞(21,45,46]。然而,在这里,我们表明,CKD MSC-derived EVs显示类似的效果在内皮细胞的迁移和小管形成健康的MSC,这表明在CKD患者中,BM MSC EVs的旁分泌proangiogenic潜力得以保留。

CKD与增加细胞衰老有关,在肾脏级别,但也通过uremia-induced系统毒性(47,48]。在动物实验中,增加衰老中检测出CKD BM msc (49]。相比之下,这是以前报道,人类健康和CKD msc没有细胞化学的差异β牛乳糖染色,衰老的标志39]。我们的研究也没有显示CKD之间不同的衰老和健康的msc、评估与流仪C12FDG SA -更加敏感β加活动分析,修正后生理性别。在我们的研究中,msc的女性患者显示senescence-associated率更高β牛乳糖活动;和msc的女性患者还表现出更高的刮伤迁徙的能力。然而,这并不影响扩散,这是女性和男性之间的相似。我们观察到没有任何衰老之间的关系,研究参数,尤其是年龄。

我们的研究有一些局限性。还需要进一步的体内研究来证实我们的体外结果。此外,有一个生物sex-mismatch在我们的群体中,这可能影响研究结果。然而,以往的研究没有发现proangiogenic分泌和抗炎细胞因子上的性别差异50,51]。伴随药物的使用也不同CKD患者之间和控制,这可能影响MSC函数。CKD患者使用短期移植前免疫抑制(霉酚酸酯(MMF)和强的松),和他汀类药物使用在CKD组更普遍。在体外除了这些药物抑制MSC增殖(52,53),但我们没有观察到这种效果在CKD msc,这使得它不太可能,CKD的负面影响细胞增殖是模糊。我们的结果了一项研究,评估经济增长和其他细胞特征的BM msc患者移植物抗宿主病(GHVD)与健康对照组,并没有发现差异,尽管广泛使用免疫抑制药物治疗移植物抗宿主病组(54]。子群分析的数据,也没有使用他汀类药物和MSC参数之间的相关性,虽然我们的研究没有足够的力量与统计有效可靠地检测到这种差异。的体外扩张msc在这项研究中使用的协议需要超过三周,细胞接受8 - 10人口倍增。因此不太可能残留药物仍然存在在这里描述的功能实验。为是知之甚少的影响comedication MSC捐助者的MSC再生潜能,这需要进一步的研究。

5。结论

我们已经表明,CKD不影响BM的proangiogenic潜力MSC-derived厘米和电动汽车,这是一个重要一步自体BM MSC和BM MSC-derived EV-based再生策略对CKD患者。

缩写

:	脂肪组织
BM:	骨髓
CKD:	慢性肾脏疾病
CM:	条件培养基
电动汽车:	细胞外囊泡
跨国公司:	单核细胞
MMF:	霉酚酸酯
msc:	间充质基质细胞
VEGF:	血管内皮生长因子。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

MV由荷兰支持科学研究组织(NWO) Vidi批准(批准号016.096.359)。FR是支持荷兰卫生研究与发展组织(ZonMw)转化成人干细胞研究项目资助(批准号116003005)。我们感激地感谢这项研究的参与者。我们感谢血管手术的部门促进这项研究。丹尼斯但MPA;劳拉Michielsen,医学博士;默尔克雷布斯,MSc;二元同步通信,梅瑞尔Janssen感激地承认了技术和/或后勤援助。

补充材料

补充图S1:流仪MSC表面标记的评估。msc CD73显示,CD90、CD105和CD140b,不显示CD14、CD19、CD34、CD45。补充图S2: (A)点阴谋的量化分层在生理性别分化能力。组间没有明显差异(脂肪: ,成骨的: ,chondrogenic: )。双向方差分析并没有显示出性和分化能力之间的关联(脂肪: ,成骨的: ,chondrogenic: )。(B)点情节显示分化能力和他汀类药物使用。组间没有明显差异(脂肪: ,成骨的: ,chondrogenic: )。双向方差分析并没有显示他汀类药物使用和分化能力之间的关联(脂肪: ,成骨的: ,chondrogenic: )。补充图S3:线性回归分析并没有显示出衰老和分化程度之间的联系(脂肪: ,成骨的: ,chondrogenic: )。补充图S4:旁分泌的影响衰老的msc,生理性别,他汀类药物使用。(一)线性回归分析表明,衰老和旁分泌作用没有联系(刮伤迁移: ,小管形成: )。(B)刮伤口关闭增加女性( )。双向方差分析显示性之间的关联和刮伤迁移( )。没有在小管形成两性之间的差异( )也没有性与小管形成( )。(C)他汀类药物使用不与旁分泌作用(刮伤迁移: ,小管形成: )。双向方差分析并没有显示他汀类药物使用和旁分泌作用之间的联系(刮伤迁移: ,小管形成: )。补充图S5: MSC-derived电动汽车的数量和规模CKD患者和健康对照组由Nanosight粒子跟踪分析。(一)电动汽车的数量。电动汽车的数量并不是健康和CKD样本之间的不同( )。(B)电动汽车的大小。EVs没有差别的大小( )。(补充材料)

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