条件培养基的影响来源于间充质干细胞Cocultured与肝细胞受损的肝细胞和大鼠急性肝衰竭

文摘

间充质干细胞(msc)和肝细胞是两个有吸引力的来源细胞治疗急性肝功能衰竭(ALF)。肝细胞的cotransplantation msc可以提高治疗治疗阿尔夫的性能。然而,潜在的治疗条件培养液(CM)与肝细胞来源于msc cocultured (MSC-H-CM)仍不清楚。本研究的目的是调查MSC-H-CM对受损肝细胞的影响在体外和D-galactosamine-induced阿尔夫在活的有机体内。D-Galactosamine-treated L02细胞培养在MSC-H-CM表现出更高的细胞生存和总比在MSC-CM L02细胞培养,蛋白质合成厘米来源于肝细胞(H-CM) MSC-CM + H-CM,或与nonconditioned介质(不合格品)。乳酸脱氢酶和天冬氨酸转氨酶水平低的受损L02细胞培养上清液MSC-H-CM L02细胞培养的比其他类型的厘米。凋亡细胞的比例最低MSC-H-CM治疗后观察。CM时注入大鼠的尾静脉与阿尔夫,MSC-H-CM当时最成功的预防肝损伤的生物标记物的释放和促进肝脏结构的恢复。最伟大的存活率在第一次治疗后7天观察MSC-H-CM-treated老鼠。我们的研究结果显示,MSC-H-CM可能是小说的交付策略整合的治疗潜力肝细胞和msc治疗阿尔夫。

1。介绍

肝移植是唯一的长期有效的治疗急性肝功能衰竭(ALF),但它是移植器官短缺的限制(1]。再生医学的进步,选择肝移植变得明显possibilities-be通过肝细胞移植,干细胞疗法,或组织工程移植物2- - - - - -4]。肝脏是特别适合这些细胞疗法由于其与生俱来的强烈的再生和自我修复的能力5]。因此,细胞疗法已经被提议作为一种很有前景的桥接方式病人肝移植或本地肝脏恢复通过内生再生(2]。

肝细胞和间充质干细胞(msc)是两个有吸引力的来源的细胞治疗阿尔夫。先前的研究已经表明,肝细胞移植可以弥补肝功能异常,扮演着一个重要的角色在细胞治疗阿尔夫(6]。然而,肝细胞移植是受到移植物抗宿主反应和移植肝细胞的短缺。此外,移植的肝细胞也不可避免地暴露在阿尔夫的炎症条件,可以抑制他们的生存能力和功能3]。移植msc来自不同的组织可以有效地拯救阿尔夫通过抑制肝脏破坏,支持居民肝细胞功能,增强肝脏再生,通过旁分泌分泌物和调节炎症和免疫反应(7),但msc不能提供及时支持肝脏功能。因此,整合他们的治疗潜力的肝细胞和msc治疗阿尔夫可能是一种很有前途的方法优势的基础上及时支持肝脏功能,免疫抑制,肝细胞功能,支持居民和增强肝脏再生(8]。

最近,我们的研究表明,肝细胞与msc cotransplanted表现出性能优越的移植治疗阿尔夫与肝细胞或独自msc (9]。msc不仅能减少肝细胞的免疫排斥的主机也提高生存能力和肝细胞的功能。Cotransplanted肝细胞肝的功能可以提供及时的支持。系统性注入条件培养液(CM)源自MSC (MSC-CM)已经被证明能够表现出相似的治疗潜力的MSC治疗治疗阿尔夫(10,11]。然而,CM的影响来自msc cocultured与肝细胞肝细胞(MSC-H-CM)阿尔夫和居民没有被探索。

在目前的研究中,我们评估的影响在D-galactosamine-treated MSC-H-CM L02细胞在体外。此外,在活的有机体内治疗的潜力MSC-H-CM分析通过政府老鼠D-galactosamine-induced阿尔夫,比MSC-CM厘米来源于肝细胞(H-CM),或MSC-CM + H-CM。我们的研究试图探索MSC-H-CM交付的新策略,集治疗潜力的肝细胞和msc治疗阿尔夫。

2。材料和方法

2.1。动物

男性Sprague-Dawley老鼠重250 - 300克用于阿尔夫实验。msc和肝细胞从女性Sprague-Dawley分离大鼠体重60 g - 80 g。动物是由军队医科大学实验动物中心提供。所有程序遵循的道德准则和制度动物保健和使用委员会批准军队医科大学。

2.2。隔离、文化和Coculture msc和肝细胞

骨骨髓来源msc分离、培养和表面特征标记表达和adipocytic和成骨分化能力如前所述9]。3 - 4通道后,这些细胞用于实验。肝细胞分离得到Sprague-Dawley老鼠使用两步胶原酶灌注过程如前所述[6]。Six-well盘子被用于coculture系统,在新鲜分离肝细胞(1×10⁶/)与msc cocultured (0.2×10⁶/)在3到4通道在杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM;美国Gibco,卡尔斯巴德,CA)补充antibiotic-antimycotic溶液和10%胎牛血清(Gibco) 37°C的95%调湿空气和5%的公司₂。包含1.2×10板⁶肝细胞或msc /也在相同条件下培养作为控制。

2.3。厘米的生产

一代的厘米,上述细胞培养24小时,清洗彻底,培养2毫升2%胎牛血清的DMEM补充和2更易与l谷酰胺(Gibco)。CM收集24小时后和使用超滤浓缩25倍单位3 kDa截止(微孔,贝德福德,妈,美国)。集中CM立即被低温贮藏在−80°C到使用。MSC-CM、H-CM MSC-H-CM来自msc、肝细胞,分别和coculture msc和肝细胞。控制介质(non-CM或不合格品)由一个类似介质没有调节人类msc和肝细胞。

2.4。Immunophenotyping通过流式细胞术分析

msc被流式细胞术分析,使用下面的抗体:CD29-PE, CD45-FITC, CD34-FITC从eBioscience(所有)。附着bmsc分离用0.25%胰蛋白酶(Gibco),用磷酸盐(PBS)的三倍,在1200×g离心5分钟,resuspended PBS。包含5×10整除⁵细胞孵化20分钟在4°C与前面描述的主要抗体。这些细胞被清洗和孵化与相应的二次抗体额外20分钟在4°C。最后,这些细胞被固定在10%福尔马林和分析使用血细胞计数器。在每种情况下,10000事件是通过流式细胞术使用CellQuest获得和分析软件。

2.5。在CM中细胞因子的测量

大鼠细胞因子抗体阵列(G系列2;RayBiotech)被用于在MSC-CM 34细胞因子的定性评估,H-CM, MSC-H-CM根据制造商的指示。简单地说,阻塞数组后30分钟,100年μl CM的孵化一夜之间在4°C数组支持贴上34个不同的细胞因子。与缓冲区,洗涤后的鸡尾酒biotin-labeled抗体了,和数组在室温下孕育了一个额外的1到2个小时。二次抗体与链霉亲和素标记,数组与标记辅助孵化抗体室温1小时。信号检测使用GenePix数组扫描仪(轴突仪器公司),和数据分析了RayBio分析工具和归一化平均信号强度为每个数组的积极控制。细胞因子在CM中量化使用商用ELISA试剂盒(表达载体)白介素(IL) 6、IL - 10,单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1),矩阵metalloproteinase-8 (MMP-8),组织抑制剂metalloproteinase-1 (TIMP-1)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)和血管内皮生长因子(VEGF)根据制造商的指示。这些实验进行细胞从六个捐助者。

2.6。D-Galactosamine-Induced L02细胞损伤模型

L02细胞(上海生物科学研究所、中科院)暂停在胎牛血清的DMEM补充(10%)、谷氨酰胺(2毫米),青霉素(100国际单位/毫升),链霉素(10毫克/毫升)和镀96孔板的密度1×10⁴细胞每口井。建立单层膜后,介质被删除,取而代之的是新的介质包含5、10、20或40毫米D-galactosamine(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。L02细胞培养在5%的股份有限公司₂调湿孵化器在37°C。奥林巴斯相差显微镜观察细胞形态。细胞增殖是methylthiazolyl-tetrazolium溴(MTT)方法检测到的第二天,和D-galactosamine LD50,造成细胞损伤,测定。

2.7。恢复受损L02细胞培养在不同的CMs

L02细胞分为两组:正常L02细胞组和受损的L02细胞组。L02细胞受损后准备,他们孵化24小时新鲜DMEM MSC-CM为20%,H-CM, MSC-H-CM, MSC-CM + H-CM(1: 5),或不合格品(25倍集中)。细胞生存能力被MTT试验评估。细胞损伤评估了LDH和AST泄漏。LDH和AST泄漏介质是量化为每个酶使用诊断工具。细胞功能是由总蛋白测定。

2.8。膜联蛋白V-FITC化验

L02细胞的凋亡是使用膜联蛋白进行流式细胞仪分析V-propidium碘染色。培养正常或损坏L02细胞分离,离心机,悬浮在PBS和沾膜联蛋白V-FITC和propidium碘(BD Pharmingen、钙、美国)。凋亡细胞的膜联蛋白V-positive / propidium iodide-negative人口。分析由FACSCalibur血细胞计数器(美国BD)使用CellQuest软件。

2.9。阿尔夫感应和治疗

阿尔夫被D-galactosamine的腹腔内注射诱导。我们选择了一个剂量的0.8 g D-galactosamine /公斤体重诱导阿尔夫达到中级水平的死亡率;基于我们之前的研究(9),这个剂量确保小组vehicle-treated动物存活足够长的时间将进行比较分析。24小时后,我们收集了四只动物每组的组织,执行与每组10动物生存分析:(1)H-CM组:注射H-CM;(2)MSC-CM组:注射MSC-CM;(3)MSC-H-CM组:注射MSC-H-CM;(4)MSC-CM + H-CM组:注射MSC-CM + H-CM (1: 5);(5)不合格品组:注射两种。每个老鼠注射0.8毫升的相应的CM每天三次连续三天。在治疗期间,行为变化被观察和记录,记录治疗方法对存活的影响。收集血液样本在0和72小时后治疗的尾巴剪断肝酶水平的分析。血清收集和储存在−20°C分析AST, ALT,和总胆红素水平使用生化分析仪(日立、日本)。 After 7 days of treatment, the entire livers were removed from sacrificed rats and fixed and prepared for hematoxylin-eosin staining.

2.10。统计分析

统计分析使用GraphPad Prism 7.01(美国GraphPad,圣地亚哥,CA)。并给出了数据平均值±标准偏差。分析了动物生存log-rank测试,值显示。所有其他学生的数据进行了分析以及, 显示统计学意义。Bonferroni调整用于多重比较。

3所示。结果

3.1。肝细胞的特点Cocultured msc

纺锤状细胞(图1(一)MSC-specific标记CD29)是积极的,但对CD34、CD45(图-1 (b))。在体外脂肪形成的和成骨细胞分化也证明(数据没有显示)。24小时后的单一,大部分肝细胞表现出紧凑,圆的形态,和一些细胞扩展形状明显核和多面轮廓(图1 (c))。在肝细胞cocultured msc,有大量的多面体细胞破坏和信息边界,不同的原子核,双核,这是典型的肝细胞形态学特征(图1 (d))。这些观察表明,cocultured比单作的肝细胞肝细胞有更大的可行性。

3.2。细胞因子的不同的CMs

研究已经证明,MSC-CM可以逆转小鼠阿尔夫。细胞因子资料起着关键的作用在不同类型的CMs的治疗效果。一系列rat-specific抗体被用来研究细胞因子的表达H-CM, MSC-CM, MSC-H-CM和不合格品(图2(一个))。细胞因子抗体阵列显示H-CM、MSC-CM和MSC-H-CM丰富等细胞因子VEGF水平,TIMP-1, MCP-1, LIX (CXCL5),细胞因子诱导的中性粒细胞chemoattractant-1 (CINC-1) CINC-2α和CINC-3(图2 (b))。有明显差异的il - 6和il - 10中蛋白质含量类型的CM(图2 (c))。ELISA结果显示MSC-H-CM il - 6水平增加了11.3倍和48.1倍,3.2倍和39.4倍的增加il - 10水平相比H-CM MSC-CM,分别(图2 (d))。

3.3。MSC-H-CM促进受损L02细胞的恢复在体外

调查每个CM受损肝细胞的影响在体外,MTT试验被用于调查的可行性L02细胞培养在不同类型的CM。正常L02细胞培养在MSC-H-CM表现出更高的细胞比MSC-CM L02细胞培养的可行性,H-CM MSC-CM + H-CM,或不合格品( )。显著减少细胞生存能力的受损L02细胞培养观察每种类型的CM与正常相比L02细胞培养在相应的厘米( )。然而,更大的细胞生存能力受损L02细胞培养中发现比培养MSC-H-CM MSC-CM, H-CM MSC-CM + H-CM,或不合格品( ),这表明MSC-H-CM拥有最大的能力提高受伤的肝细胞(图的可行性3(一个))。

受伤的肝细胞可以释放LDH和AST成培养基。LDH和AST水平更高的上层清液从受损L02细胞比正常L02细胞( )。在上层清液LDH和AST水平受损L02细胞培养在MSC-H-CM低于上层清液从受损L02细胞培养与其他类型的厘米( )(数据3 (b)和3 (c))。此外,总蛋白质合成高损坏或正常L02细胞培养在MSC-CM MSC-H-CM比相应的细胞培养中,H-CM MSC-CM + H-CM,或不合格品( )(图3 (d))。这些结果表明,MSC-H-CM是最有效的促进受损肝细胞的恢复。

3.4。MSC-H-CM抑制受损L02细胞的凋亡在体外

评估厘米对细胞凋亡的影响,L02细胞沾膜联蛋白V-FITC propidium碘。流仪分析表明,凋亡或坏死细胞的比例是最低的L02细胞培养在其中MSC-H-CM培养在每个类型的CM。凋亡L02细胞的数量在MSC-H-CM文化之后,MSC-CM MSC-CM + H-CM,或H-CM相比显著降低不合格品(文化后 )。凋亡的比例在MSC-H-CM受损L02细胞培养是低于H-CM受损L02细胞培养,MSC-CM或MSC-CM + H-CM ( )。最低MSC-H-CM观察凋亡细胞的数量,展示最强的抑制作用MSC-H-CM受损肝细胞的凋亡在体外(图3 (e))。

3.5。MSC-H-CM政府逆转阿尔夫

外周血中的肝酶水平提供一个良好的估计的持续的肝损伤。动物血清收集治疗72小时后第一个厘米。如图4(一)、血清ALT和AST水平D-galactosamine-induced阿尔夫老鼠增加到1100和1600 IU,分别在72小时后不合格品的管理,而老鼠的ALT和AST水平处理其他类型的厘米被减少到低于300 IU。显著降低ALT和AST水平观察老鼠H-CM对待,MSC-CM MSC-H-CM或MSC-CM + H-CM相比NCM-treated老鼠( )。ALT和AST水平最低的老鼠中处理不同类型的CM MSC-H-CM-treated中发现大鼠( )(图4(一))。总胆红素的浓度较低的老鼠接受MSC-H-CM或MSC-CM比对待H-CM, MSC-CM + H-CM,或不合格品( )。没有总胆红素水平观察差异MSC-H-CM-treated老鼠和MSC-CM-treated老鼠(图4 (b))。这些数据表明,MSC-H-CM王亚南的阿尔夫大于其他类型的厘米。

肝脏组织学分析部分显示大量的坏死和肝小叶损伤大鼠肝脏在24小时后D-galactosamine政府(图4 (c))。细胞坏死是抑制大鼠的肝脏处理H-CM(图4 (d)),MSC-CM(图4 (e)),MSC-H-CM(图4 (f)),或MSC-CM + H-CM(图4 (g)厘米)在7天后注入。相比之下,与细胞质液泡化肝细胞死亡和严重变形的组织架构是NCM-treated鼠肝脏(图中观察到4 (h))。此外,MSC-H-CM-treated老鼠的肝脏结构在治疗后7天从异常中恢复过来。

在7天治疗后,80%的老鼠接受MSC-H-CM从阿尔夫中恢复过来,而50.0%,50.0%,和60%的老鼠接受H-CM, MSC-CM + H-CM或MSC-CM,分别从阿尔夫(图中恢复过来5)。观察一个重要的生存受益H-CM, MSC-CM, MSC-H-CM, MSC-CM + H-CM组相比,不合格品组( )。MSC-H-CM组的生存率高于H-CM, MSC-CM + H-CM, MSC-CM组( )。没有显著差异之间的存活率H-CM, MSC-CM + H-CM, MSC-CM组。总的来说,这些数据表明MSC-H-CM是一个最佳的CM逆转阿尔夫,施加一个生存受益。

4所示。讨论

细胞疗法已经被提议作为阿尔夫的有形替代肝移植,因为它们是简单和微创手术12]。旁分泌因素来源于msc的有利影响主要负责细胞疗法治疗阿尔夫(13,14]。我们之前的研究表明,msc有效救援阿尔夫通过旁分泌作用而不是肝分化(6]。进一步研究表明,cocultured msc移植,肝细胞提供了更好的恢复肝脏功能和相对较少的hyperacute拒绝在阿尔夫老鼠9]。MSC-CM,包括分泌因素,微泡液,展览效果类似于msc治疗阿尔夫(11,15- - - - - -18]。CM管理可以克服基因组不稳定性、免疫反应、肿瘤发生的潜在的干细胞移植14]。因此,CM的治疗潜力来自不同的细胞在细胞治疗领域正越来越受到关注(19,20.]。然而,治疗潜在的阿尔夫MSC-H-CM尚未报道。在这项研究中,我们表明,MSC-H-CM不仅促进受损肝细胞的恢复在体外也表现出优越的性能在拯救D-galactosamine-induced阿尔夫,这表明MSC-H-CM可以作为小说的工具集成的治疗潜力肝细胞和msc治疗阿尔夫。

阿尔夫通常是与许多受损的肝细胞和大量的肝细胞坏死(21]。因此,恢复受损的肝细胞和抑制细胞死亡应该扮演重要的角色在细胞治疗阿尔夫(22]。H-CM,我们的研究结果表明,在MSC-CM MSC-CM + H-CM MSC-H-CM,两种治疗方法,MSC-H-CM最大能力增强的恢复受损L02细胞并抑制受损L02细胞的凋亡在体外。观察到的有益MSC-H-CM对受损肝细胞的影响表明,这是一个潜在的治疗阿尔夫。

在我们的在活的有机体内研究水平的AST、ALT和总胆红素,肝损伤的三个重要指标,降低MSC-H-CM管理后,MSC-CM, MSC-CM + H-CM或H-CM。改善肝脏功能的大小在MSC-H-CM-treated老鼠高于在大鼠治疗其他类型的厘米,表明CM的细胞疗法的治疗潜力阿尔夫被coculturing msc与肝细胞增强。组织学评价厘米治疗后肝组织提供初始洞察细胞的目标。肝脏结构的惊人的复苏被MSC-H-CM注射后,这表明MSC-H-CM可能促进内源性肝脏再生。这些结果与我们的是一致的在体外数据MSC-H-CM可以抑制受损肝细胞的坏死,可促进内源性肝脏再生。此外,MSC-H-CM显示比MSC-CM潜力,H-CM或MSC-CM + H-CM逆转肝衰竭大鼠模型的D-galactosamine-induced阿尔夫。可以改善的治疗潜力厘米coculturing msc与肝细胞。

CM治疗的好处是由于细胞的旁分泌作用的细胞治疗阿尔夫(23]。不同的组件不同细胞类型的CM治疗阿尔夫(可能有不同的影响19,20.,24]。我们发现高蛋白质含量的VEGF, TIMP-1 MCP-1, LIX, CINC-1 CINC-2α,CINC-3在所有的研究类型的CM。先前的研究已经表明,msc的能力或MSC-CM治疗阿尔夫可以归因于几个细胞因子,包括VEGF、TIMP-1, MCP-1 [17,25- - - - - -27]。然而,il - 6和il - 10的蛋白质水平显著增加相比,MSC-H-CM H-CM或MSC-CM。研究表明,il - 6和il - 10从msc分泌负责小鼠肝脏复苏阿尔夫(23,28]。研究这些细胞阻止il - 10、il - 6分泌证实的治疗潜力表示细胞因子在小鼠阿尔夫模型(23]。因此,这些细胞因子在MSC-H-CM的差异可能会导致更大的治疗效果比观察H-CM或MSC-CM反对阿尔夫,这表明coculture msc的肝细胞可以提高CM逆转阿尔夫的能力。

总之,目前的研究表明,MSC-H-CM,集肝细胞的治疗潜力和msc、性能优越在促进受损肝细胞的恢复在体外和扭转D-galactosamine-induced阿尔夫在活的有机体内。这项工作提供了第一手的证据交付MSC-H-CM可能是一个新颖的战略整合的治疗潜力肝细胞和msc治疗阿尔夫的,从而避免了细胞移植的缺点。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的出版。

作者的贡献

李陈和张杰忻同样对本文亦有贡献。

确认

这项工作是支持的资金从中国的国家自然科学基金(81671836,81671836,81671836,81270524),江苏省自然科学青年基金(BK2015029),和中国江苏省医学重点实验室实验室(ZDXKB2016005)。作者欣然承认所有的成员共享实验室的试剂和建议。

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