文摘
新生儿与关键的先天性心脏病是重要的晚年患心力衰竭的风险。因为儿童终末期心脏病治疗方法有限,再生治疗这些患者的显著效益。新生儿心脏手术期间,一部分胸腺删除和丢弃。这个废弃的胸腺的组织是一个很好的来源msc,我们以前是proangiogenic,促进心脏功能在一个心脏组织的体外模型。本研究的目的是进一步评估新生儿胸腺的心脏再生和保护特性(nt) msc。我们发现ntMSCs表达和分泌proangiogenic和心脏再生成形素声波刺猬(嘘)体外超过patient-matched bone-derived msc。我们还发现,瀑样ntMSCs刺激嘘的文化表达。然后我们确定ntMSCs cytoprotective新生大鼠心肌细胞暴露于H2O2。最后,在大鼠左冠状动脉结扎模型,我们发现scaffoldless细胞表由ntMSCs左冠状动脉结扎后立即应用于LV心外膜LV功能改善,增加血管密度,减少疤痕的大小,和减少梗死后心肌细胞死亡四个星期。我们得出这样的结论:ntMSCs心脏再生能力,值得进一步考虑的细胞疗法先天性心脏病心力衰竭患者。
1。介绍
损失的脉管系统显示为心力衰竭的重要病理生理机制与复杂先天性心脏病(CHD) [1,2]。pressure-overload-induced心室衰竭、心肌毛细血管密度导致缺血和恰逢收缩功能损失(3]。减少冠状动脉流引起的形态异常(如异常冠状动脉肺动脉,冠状动脉狭窄,和冠状动脉瘘)或从手术并发症(冠状动脉阻塞后动脉开关过程)也可以导致冠心病心力衰竭患儿(4]。心脏移植是标准治疗终末期心力衰竭,严重限制了儿童缺乏捐献器官,移植有限的生活,重要的免疫抑制药物的副作用。因此,再生医学和细胞疗法值得重要的考虑作为潜在的治疗这些孩子有限的和令人不满意的治疗方法5,6]。
在新生儿和婴儿心内直视手术复杂冠心病通常需要的部分切除胸腺获得潜在的心脏和大血管。我们曾表明,新生儿胸腺间充质干细胞(ntMSCs) proangiogenic和可以改善收缩功能在培养皿中“心”模式(7,8]。我们发现这可能是因为旁分泌机制,改善ntMSCs没有分化成心肌细胞(7]。
声波刺猬(嘘)是一种分泌的因素已经被证明可以促进心肌再生和新血管形成在组织缺血的设置9- - - - - -11]。ntMSCs产生嘘是未知的能力。基于这些发现,我们假设ntMSCs可能提供保护心肌缺血的设置和再生的影响。评估这一假设,我们做了实验,确定如果ntMSCs能表达嘘,cytoprotective心肌细胞体外,体内,促进心肌再生。
2。材料和方法
2.1。细胞隔离和文化
所有研究进行下一个密歇根大学的机构审查委员会批准的协议。隔离、详细的描述,和文化的新生儿胸腺(nt) MSC和骨(nb) MSC线用于这项研究一直在前面描述的(8,12]。短暂,在知情同意是父母给的,丢弃的胸腺和胸骨骨组织婴儿心脏手术是机械绞成碎片在无菌条件下< 3毫米。组织碎片被安置在100毫米文化菜肴和淹没在MSC媒体(杜尔贝科的修改鹰介质,high-glucose浓度,GLUTAMAX我,10%热灭活胎牛血清,100 U /毫升青霉素,和100年μg / mL链霉素,所有从Gibco,卡尔斯巴德,CA)。组织碎片被移除之前培养10 - 14天。msc移居组织外植体被允许前实现80%的融合使胰蛋白酶/ EDTA (Gibco)。培养的人脐静脉内皮细胞(通过传代形成细胞在EGM-2(瑞士巴塞尔Lonza,)与生长因子在标准条件下,除非另有规定。除非特别说明,所有实验进行细胞通道3 - 9。
2.2。悬滴文化
HUVEC, nbMSC ntMSC细胞培养分离使用胰蛋白酶/ EDTA,离心机,resuspended EGM-2媒体包含0.275%甲基纤维素(σ)。细胞悬架被播种在nonadhesive培养皿的盖子(20μ每下降L)包含800个细胞/挂掉。对HUVEC + MSC组合,从每个细胞类型400个细胞被用来使悬滴。挂滴在一夜之间被孵化在37°C和5%的公司2允许球体形成。
2.3。基因表达分析
差异基因表达在不同的细胞类型和文化条件与qPCR测定。从细胞总RNA提取,挂滴,或细胞表使用RNeasy迷你包(试剂盒,瓦伦西亚,CA)。反转录进行了使用高容量cDNA逆转录工具包和随机引物(应用生物系统公司,英杰公司)。定量实时聚合酶链反应进行StepOne +实时PCR系统(应用生物系统公司)与反应混合物(10μL)包含cDNA、正向和反向引物(见下文),和1 x iTaq普遍SYBR绿色Supermix (Bio-Rad实验室、大力神、CA)。每个基因的表达是归一化的表达β肌动蛋白。意味着循环阈值(Ct)值计算的平均每个基因,一式三份和基因表达的褶皱变化计算基于2-ΔΔCT方法。引物在表列出用于这项研究1。
2.4。嘘ELISA
嘘水平条件媒体从单层或悬滴文化测量使用酶联免疫试剂盒(RayBiotech,共同协助,GA)根据制造商的指示。条件媒体层被孵化生成5×105细胞在烧瓶与血清DMEM的5天。条件所产生的媒体从悬滴使用离心收集文化上层清液从挂滴。当比较的媒体从单层膜和悬滴,相同数量的细胞和上层清液的体积。两个独立的实验研究和条件媒体采用免疫酶联试验样本一式三份。
2.5。H2O2氧化压力分析
新生大鼠心肌细胞(CMs)是孤立如前所述7]。CMs被培养在24孔板(5×104CMs /) 24小时使用标准MSC媒体和文化条件。然后,H2O2被添加到实现最终的浓度50μm。在一个组,5×104ntMSCs被播种到多孔细胞培养插入然后插入包含CMs处理H井2O2。在另一组,5×104ntMSCs被添加到包含CMs治疗H2O2允许直接接触。4小时后,细胞凋亡分析收获通过流式细胞术和TUNEL染色。
细胞凋亡检测使用荧光染料共轭反膜联蛋白V抗体(BD生物科学,圣何塞,CA)。抗体与细胞孵化为60分钟在室温下三个洗紧随其后。染色细胞进行分析使用MoFlo®Astrios™流式细胞分析仪(贝克曼库尔特公司)使用适当的isotype-matched和清白的控制。TUNEL染色进行使用原位检测细胞死亡工具包(Sigma-Aldrich Corp .)、圣路易斯、钼)根据制造商的协议。简单,细胞被固定刚做好的4%在PBS PFA 1小时在室温下,然后permeabilized Triton X 100 0.1% 0.1%柠檬酸钠2分钟在冰上。TUNEL反应混合物添加在37°C,在黑暗中孵化湿润孵化器1小时。TUNEL阳性细胞量化在5随机选择大功率领域。
2.6。Scaffoldless ntMSC细胞板的一代
Scaffoldless ntMSC细胞表是由培养4×106ntMSCs thermoresponsive聚合物涂层35毫米文化菜(Nunc™菜肴与UpCell™表面,热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)标准培养条件下48小时。细胞表升空文化表面和收获了暴露的菜到室温后用10分钟。
2.7。大鼠冠状动脉结扎模型
照顾动物是按照机构的指导方针。男性RNU裸大鼠( ,200 - 250克,查尔斯河,威明顿,MA)接受左冠状动脉结扎后气管插管,机械通气,左胸。ntMSC细胞表放置在心外膜表面的左心室(LV) 8个随机选择的动物。3天、28天的评分,所有动物进行了镇静超声心动图(VisualSonics Vevo 770年,富士胶片VisualSonics Inc .,多伦多,加拿大)来确定射血分数和分数从胸骨旁的短轴缩短视图(13]。后超声心动图、动物安乐死,心中收割后管理钾丰富的解决方案,以确保舒张被捕。心脏组织被福尔马林固定,石蜡包埋,切片在5μm厚度,沾)根据常规组织学和马森的三色的协议。使用图像J软件梗塞大小进行了分析。免疫组织化学研究核心部分是deparaffinized和水化。抗原检索后,幻灯片被区别对待进一步根据染色的目的。vWF染色的部分被孵化0.3%过氧化氢为30分钟阻断内源性过氧化物酶活性。然后,部分与兔多克隆vWF孵化主要抗体(anti-von血友病因子的抗体,ab6994 Abcam)一夜之间在4°C。三个洗与PBS,部分是孵化与生物素化的山羊anti-rabbit免疫球蛋白G和streptavidin-biotin复杂,分别。然后,他们孵化diaminobenzidine (DAB) 3分钟在室温下,用苏木精复染色,清理,安装和检查。免疫荧光染色的标本被封锁10%山羊血清,然后一夜之间主要抗体(鼠标单克隆抗-α辅肌动蛋白,克隆EA-53 Sigma-Aldrich)孵化在4°C。二次抗体山羊anti-rabbit Alexa萤石488(表达载体,尤金或)。部分被用DAPI染色。TUNEL染色进行使用原位检测细胞死亡工具包(Sigma-Aldrich Corp .)、圣路易斯、钼)根据制造商的指示,如上所述。
2.8。统计分析
数据被表示为平均数±标准差。subject-matched比较执行时,配对t以及使用。统计多个组之间的差异是决定使用单向方差分析(方差分析)与事后图基的诚实的显著差异测试。被定义为一个意义值< 0.05。
3所示。结果与讨论
我们首先确定如果ntMSCs表达和分泌嘘体外。嘘转录表达是由成对qPCR ntMSCs和新生儿胸骨骨(nb) msc隔绝7例(图1(a))。我们发现ntMSCs表示嘘nbMSCs相比水平显著增加(图1(a))。然后,我们用免疫印迹(图证实了这些发现1(b))和ELISA nbMSCs和ntMSCs(图的条件媒体1(c))。因为我们之前的结果表明,高密度,3 d文化的msc可以调节基因的表达8),我们下一个决定如果球体形成悬滴ntMSCs刺激嘘的文化表达。我们发现悬滴文化显著刺激嘘的转录ntMSCs孤立的从不同的学科(图1(d))。的分泌量嘘也量化ELISA和证实,瀑样ntMSCs文化刺激嘘分泌(图1(e))。总的来说,这些结果表明,ntMSCs表达和分泌嘘,这是由高密度刺激,3 d文化。
我们接下来问ntMSCs能否发挥cytoprotective影响心肌细胞氧化应激的设置,为这种类型的损伤存在于心肌缺血的设置和心脏衰竭14,15]。我们暴露新生大鼠心肌细胞H (CMs)2O2并确定是否存在ntMSCs(分离但共享相同的媒体或直接接触)厘米生存(图的影响1(f))。我们发现H2O2全身的CM死亡被ntMSCs废除由膜联蛋白V表面表达(图1(g)和TUNEL染色,最伟大的发现cytoprotection ntMSCs在直接接触CMs(数字1(h)和1(我))。
根据这些研究结果,然后我们问ntMSCs是否可以缓解严重的心肌缺血大鼠模型的影响的心肌梗死冠状动脉左前降枝通过结扎。因为我们之前(8(图)及以上结果1)表明,高密度,3 d ntMSCs激活嘘的表达和其他文化proangiogenic因素,我们决定交付ntMSCs缺血区域的左心室的形式scaffoldless细胞表(4×106ntMSCs /板)培养thermoresponsive种文化形成的表面(图2(一))16),导致高细胞密度,3 d安排(图2(b))。此外,细胞板创造刺激嘘和其他proangiogenic基因的表达与单层培养的ntMSCs(图2(c))。
左冠状动脉结扎后,我们立即放置ntMSC细胞表到左心室的表面在治疗组( 动物),而对照组没有收到细胞表( 动物)。超声心动图在第三天透露,LV射血分数(EF)和部分缩短(FS)明显沮丧在所有动物(图2(d))。在4周,动物接受第二个心回波图表明,未经处理的控制( )没有显示任何变化在LV功能在研究期间而治疗动物( )表现出显著改善LV射血分数(图2(d))。此外,有增加peri-infarct vWF +治疗组中血管密度(数字2(e)和2(f))和减少疤痕大小(图2(g)和图2(h))。然后我们评估细胞死亡的数量在LV两组用TUNEL染色。我们发现ntMSC细胞片治疗显著降低TUNEL positive-stained CMs的频率,表明cytoprotective效果(数字2(我),2(j))。
我们的研究结果表明,丢弃胸腺组织从新生儿心脏手术获得msc具有再生能力的来源。这些thymus-derived msc能够分泌嘘和保护CMs对体外细胞毒性氧化应激和进一步的工作需要确定有多少这些属性有助于体内的治疗效果。ntMSCs的一个显著特点是它的高表达和分泌的嘘相比bone-derived msc。贾等人迫使bone-derived msc嘘的表达增加治疗效果在脊髓损伤模型(17]。我们的结果表明,Shh-endowed nonmodified ntMSCs也可能有治疗效用在这个模型和临床情况。
同时从多个组织类型展示了msc祝词临床心脏属性设置,临床试验整体令人失望的结果(18,19]。因此,严格而公正的直接比较是需要确定哪些组织来源提供了最大的MSC治疗效力。
4所示。结论
接受心脏手术的关键冠心病的新生儿在重大风险也在以后的生活中形成心脏衰竭,丢弃的胸腺组织是一种实用的和充足的来源心脏再生msc可以扩展和低温贮藏,因此ntMSCs保证进一步评估临床翻译。
数据可用性
qPCR、ELISA、超声心动图、组织学和免疫组织化学数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
资金
这项研究受到了信仰的天使,儿童心脏基金会和美国密歇根大学的心脏手术。