在共培养系统中，背根神经节通过AMPK/mTOR通路增强自噬来维持骨髓间充质干细胞的干性

摘要

我们以前的研究发现，植入组织工程骨（TEB）中的感觉神经椎间可能导致更好的骨质发生。为了探讨体外TEB中感觉神经促进骨质发生的机制，在背根神经节（DRG）细胞和骨髓间充质干细胞（BMSC）之间设计了Transwell共培养实验。通过CCK8测定法测定BMSC增殖，并通过茜素红，Alcian蓝和油红染色来评估骨液，软骨和脂肪生成分化。与BMSCS组相比，我们发现BMSCs的增殖和多能分化全部增强。结晶紫染色表明，共培养基BMSCs的克隆成形能力也增强了SOX2，NANOG和OCT4的mRNA水平在共培养组中显着上调。此外，通过AMPK / MTOR途径介导的共培养基，在共培养基团中促进了BMSCs的自噬水平，调节其茎。此外，AMPK抑制剂化合物C可以显着下调番茄菌组中LC3的蛋白质表达和茎秆基因的mRNA水平。最后，我们发现NK1受体拮抗剂，过份，可部分阻断这种效果，这表明物质在效果中发挥了重要作用。我们一起得出结论，DRG可以通过在Transwell共培养系统中通过AMPK / MTOR途径增强自噬来维持BMSCs的茎，这可能有助于在将感觉神经植入TEB后解释更好的骨质发生。

1.介绍

骨组织工程为大骨缺损的治疗提供了一种很有前景的解决方案，但仍有许多问题有待解决[1-3.，如骨髓间充质干细胞成活率低、成骨分化差等。之前，我们发现在组织工程骨(TEB)中植入感觉神经束可以显著改善TEB的成骨[4.那5.，但其背后的机制在很大程度上仍是未知的。

据报道，感觉神经在体内骨代谢和骨再生中起着关键作用[6.-9.］.一些研究发现，感觉神经支配通过抑制骨吸收，有助于维持小梁骨量及其力学特性[8.］.此外，感觉神经在其支配的组织中具有传出功能，这是由周围神经末梢释放的递质介导的，有助于维持小梁骨的完整性[10］.最近，感觉神经源性检测Sema3A被认为是负责SEMA3A骨量丢失^−−/而Sema3A通过调节感觉神经支配间接调节骨重塑，而不是直接作用于成骨细胞[7.］.

体外研究表明神经肽，如P物质和CGRP [11，可影响成骨前细胞。例如，SP以剂量依赖的方式显著增加体外BMSCs的增殖[12］.SP可通过Wnt/诱导BMSCs向成骨细胞分化β-catenin途径促进骨髓间充质干细胞的血管生成能力[13］.此外，有报道称CGRP通过刺激典型Wnt信号和抑制人成骨细胞凋亡而对人成骨细胞发挥合成代谢作用[14］.

综上所述，这些在体内和体外的研究结果表明，感觉神经在骨代谢和再生中起着重要的作用。但在细胞水平上的机制研究较少，有一种神经肽可能不能反映感觉神经对骨细胞的整体影响。因此，感觉神经对骨细胞的整体调控及其分子机制有待进一步研究。

在本研究中，我们使用transwell共培养系统来研究DRG细胞对BMSCs的影响。本研究结果表明，在该共培养体系中，DRG可通过激活AMPK/mTOR信号通路，提高骨髓间充质干细胞的基础自噬水平，从而维持骨髓间充质干细胞的干性。

2。材料和方法

2．1.GFP大鼠骨髓间充质干细胞的分离与鉴定

采用特征明确、稍加修改的方法从2周龄GFP Sprague-Dawley (SD)大鼠获得BMSCs [15］.简单地说，在无菌条件下从2周龄的GFP大鼠获得原代培养的骨髓间充质干细胞。用2%戊巴比妥钠(W./V.）.浸于75%乙醇(V./V.）for 5 min, both the femurs and tibias were isolated and excised with the attached soft tissues, and then epiphyses were cut off with aseptic scissors. Then, the marrow was flushed from the diaphysis with a syringe and collected in a primary culture medium (α-MEM含10%胎牛血清和1%抗生素(青霉素和链霉素)。将收集的含骨髓细胞的培养基用2ml培养在6孔培养板上α-MEM每孔含10%胎牛血清。24小时后，小心地取出非贴壁细胞。细胞生长培养基每2天更换一次，继代培养至80%汇合。第3代BMSCs以2 × 10的浓度接种于6孔培养板中^3.细胞/ml与DRG共培养。第3代骨髓间充质干细胞经流式细胞术和多能分化鉴定。

2.2。流式细胞仪

将第3代的骨髓间充质干细胞胰酶化、离心、悬浮在冷PBS中，并计算细胞数量。然后，在室温下用2%的BSA阻断骨髓间充质干细胞30分钟。同时用PBS将抗体稀释到推荐浓度。然后将细胞密度调整为1 × 10^6.每个管。然后，用PerCP抗大鼠CD90抗体(202512,BioLegend)、PE抗大鼠CD11b/ C抗体(201807,BioLegend)、PE抗大鼠CD34抗体(ab187284, Abcam)和PE- cy7抗大鼠CD45抗体(202214,BioLegend)在4°C下孵育40分钟。以同型相同抗体作为对照，用流式细胞仪(cytomics FC 500, Beckman Coulter)分析培养的细胞。

２.３.DRG的制备及BMSCs与DRG细胞的共培养

取出生1日龄SD大鼠，在前人研究基础上分离DRG [16］.椎体柱从胸部暴露并从腰部区域打开。然后，将DRG从腰椎脊髓中解剖并用冰冷的PBS洗涤。仔细取下结缔组织。drg被汇集在α- 在冰上培养到进一步的过程。用剪刀机械地切割收集的DRG 2分钟，然后在37℃下孵育30分钟，0.1％（V./V.)胰蛋白酶。然后，细胞通过100进行过滤μM细胞过滤器并在180处离心5分钟。将收获的DRG细胞种植在Transwell细胞插入件（批次3450，康宁，USA）中，该细胞插入物（康宁，美国）已经被放入6孔培养板，以1×10的浓度^4.细胞每口井。然后在transwell insert中加入1 ml的细胞生长培养基，即平板6个孔中都有3 ml的细胞生长培养基。无DRG细胞培养的骨髓间充质干细胞作为对照组。它们在37°C的5% CO中培养₂大气层。使用Transwell细胞插入允许DRG细胞和BMSCs共享相同的细胞生长培养基，但没有直接接触。

２.４.骨髓间充质干细胞成骨分化和茜素红染色

成骨分化培养基(RASMX-90021)购自Cyagen Biosciences Inc.，按照产品的用户手册进行操作。简单地说，共培养8天后，分离骨髓间充质干细胞，以2 × 10的密度播种在新的12孔培养板上^4.细胞/。成骨培养基由DMEM、10%胎牛血清、50 mg/ml抗坏血酸-2磷酸盐、100 nM地塞米松和10 mM组成β-甘油磷酸在100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素存在下。当细胞融合约为60-70%时，仔细地从每孔中吸取生长培养基，并加入2 ml成骨分化培养基。成骨诱导培养基每3天更换一次。14 d后，用4%多聚甲醛固定细胞，茜素红S (Cyagen Biosciences Inc.)染色3 ~ 5 min，显微镜下观察细胞。

2.5。BMSC软骨细胞分化和阿辛蓝染色

对于软骨分化，0.5ml含有2.5×10的BMSC^5.cells is needed to form one chondrogenic pellet in 15 ml polypropylene culture tubes with the differentiation induction medium (RASMX-90041, Cyagen Biosciences, USA). The caps of the tubes were loosened in order to allow gas exchange, and cells were incubated at 37°C in a humidified atmosphere of 5% CO₂．这些颗粒在24小时内没有受到干扰。每管2-3天更换一次成软骨诱导培养基(为避免在抽吸培养基时抽吸微丸，附无菌1-200μL吸管尖端至吸液吸管末端)。每管中加入0.5 ml新鲜制备的完全软骨形成培养基。为了确保颗粒能够自由漂浮，将试管底部轻弹几次。培养20天后收获软骨源性颗粒。颗粒经福尔马林固定，冷冻切片8μ为Alcian蓝染色分析获得M厚度。

2.6。脂肪发生分化和油红染色

对于成脂分化，分化诱导培养基(RASMD-90031, 1μM敏捷,1μ根据用户的手册制备G / ml胰岛素和0.5mM 3-异丁基-1-甲基吡啶）和分化基础培养基（谷氨酰胺，胰岛素）。在实验的第8天，BMSCs被重新预测为2×10^4.细胞/ cm.²在6孔组织培养板中，每孔中等体积为2mL。在达到100％汇合或后结合时，每孔加入2ml诱导培养基。三天后，将介质改为维护介质。24小时后，将培养基更换回诱导培养基。重复循环4次后，将维护介质连续使用4至7天。细胞分化后，将细胞冲洗并用4％多聚甲醛固定。加入1mL油红O（Cyagen Biosciences Inc.）加入工作溶液（用蒸馏水稀释至3：2，用滤纸过滤30分钟。然后，在显微镜下观察细胞。

2.7。细胞增殖实验

如前所述进行细胞增殖试验[17］.简而言之，将细胞接种在6孔板上（10^4.细胞/well)，在有或没有DRG的情况下进行培养，以确定指定的时间长度。在第1、2、4、6、8和10天，应用细胞计数试剂盒-8 (Dojindo)并孵育2小时，然后用酶标仪(Synergy H1, BioTek, USA)测量活细胞产生的福玛赞染料在450 nm下的吸光度。所有实验都进行了三次。

2.8。集落形成单位（CFU）测定

采用CFU法检测有无DRG细胞的骨髓间充质干细胞自我更新能力。简单地说，BMSCs与DRG共培养8天后，在60 mm板上播种50个细胞，培养10天，然后用结晶紫染色液染色。显微镜下计数含50个以上细胞的菌落。所有实验均以单培养骨髓间充质干细胞为对照。所有实验都进行了三次。

2.9。实时定量聚合酶链反应

所有的程序都是根据产品说明书进行的，并参考了之前研究中记录良好的方法[15］.简言之，将来自骨髓基质细胞总RNA，根据制造商的方案，使用OMEGA总RNA试剂盒I（批号R6834-01，OMEGA生物TEK，USA）提取。Concentration and purity of the RNA were determined by measuring the absorbance in TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, and 1 mM EDTA) at 260 and 280 nm. Then, cDNA was synthesized from the total RNA using a Takara PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time) kit (Lot RR036, Takara, Japan) following the supplier’s instructions. The levels of mRNA of Sox2, Nanog, and Oct4 in BMSCs were determined by quantitative real-time RT-PCR using the Takara SYBR Green I kit according to the user manual (Bio-Rad, CFX96, Real-Time System, USA). The sequences of the primers are as follows: for Sox2, forward primer 5-GTCAGCGCCCTGCAGTACAA-3反向引物5-GCGAGTAGGACATGCTGTAGGTG-3 ;10月4日，正向引物5-GACAACCATCTGCCGCTTC-3反向引物5-TCCTCCACCCACTTCTCCA-3 ;纳诺格，前引物5-TGGACACTGGCTGAATCCTTC-3反向引物5-CGCTGATTAGGCTCCAACCAT-3 ;和GADPH（作为内部对照），正向引物5-ACAGGGCTATCAGGGAGCA-3反向引物5-ggagcgagatccctccaaat-3 ．

2.10。Western印迹分析

Western blotting分析如前所述[18］.Briefly, BMSCs in the 6-well plate were washed in cold-buffered PBS and lysed in RIPA buffer with 1 mm PMSF on ice. Cell lysates were centrifuged (12000 rpm, 10 min) at 4°C, and the protein supernatant was transferred into new tubes. The concentration of the protein samples was determined with the BCA Protein Assay Kit (PC0020, Solarbio, Beijing, China). A 20 μg总蛋白样品用12% SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜上。用含Tween 20和5% BSA的tris缓冲盐水在室温下封闭细胞膜2小时。一抗(LC3A/B, 50μ克/ 50 μl, AF5402，抗lc3a /B抗体，1:1000,Affinity，美国;AMPK, ab32047, 1: 2500, Abcam，美国;p-AMPK, ab133448, 1: 5000, Abcam，美国;P-AKT, ab81283, 1: 7000, Abcam，美国;AKT, ab8805, 1: 500, Abcam，美国;mTOR, ab2732, 1: 2000, Abcam，美国;P-mTOR, ab137133, 1: 5000, Abcam，美国;和β-actin, 66009-1-lg, 1: 20000, Proteintech Group, USA)与膜在4°C下孵育过夜。用辣根过氧化物酶偶联抗兔二抗(HRP)(山羊抗兔IgG, Abcam, ab6721，美国)孵育膜，并用增强化学发光法(Beyotime，上海，中国)使用Amersham Imager 600(美国通用电气公司)检测蛋白。β-Actin被用作内部控制以使装载材料标准化。

2.11。免疫荧光

用4%多聚甲醛固定细胞，用1% triton X-100渗透10分钟，然后用2%牛血清白蛋白封闭30分钟。然后制备一抗，兔多克隆抗体(LC3A/B, 50μ克/ 50 μl, AF5402, anti-LC3A/B antibody, 1 : 100, Affinity, USA), was used for incubation overnight at 4°C. Then, cells were incubated with a secondary antibody Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit (ab150075, 1 : 200, Abcam, USA) away from light for 1 hour. After that, cells were mounted with DAPI (1 : 1000, 32670-5MG-F, Sigma, USA) for 5 minutes. Immunofluorescent images were captured and analyzed with a confocal microscope (Olympus, FV10-ASW3.1, JPN).

2.12。药物治疗

的AMPK抑制剂，化合物C的方法，来自Millipore（Merck公司，比尔里卡，MA，USA）购得，和化合物C的剂量为20 μμ[19那20.］.将化合物C加入到系统中，在共培养后24小时加入8天。Apripitant的NK1受体拮抗剂是由Sigma-Aldrich（SML2215-5MG，中国上海）购买的。子剂量为50 μμ[21那22］.共培养8 d后，用阿瑞吡坦治疗DRG和BMSCs 48h。然后收集骨髓间充质干细胞进行以下分析。

2.13。统计分析

所有数据以均数±标准差表示，采用SPSS软件(13.0版)进行分析。各组之间的差异由Student进行比较以及,值小于0.05被认为有统计学意义。

结果

3.1。GFP大鼠BMSCs的表征

BMSCs似乎具有梭形形态与绿色荧光，古典形式（图1（a））.BMSCs的多电位分化通过茜素红染色来验证（图1（b）），油红O染色（图1（c））和alcian蓝染色（图1（d）），这表明在该研究中使用的BMSCs可以分化为成骨细胞，脂肪细胞和诱导条件下的软骨细胞。流式细胞术分析表明，在该实验中使用P3细胞具有CD90（99.8％）和不存在CD34（2.5％），细胞CD11b / C（1.5％），和CD45（2.3％）（图的大量表达1（e）中）.在该研究中，BMSCs具有多种潜力的分化，BMSCs的纯度非常高，因此P3 BMSC可用于以下实验。

3.2。与DRG共培养促进扩散和增强骨髓基质干细胞多向分化

在此，我们分析了与DRG共培养对骨髓间充质干细胞增殖和多能分化的影响。我们发现，与DRG共培养显著促进骨髓间充质干细胞增殖，并提高其成骨、成脂和成软骨分化。共培养组大鼠GFP-BMSCs的成纤维细胞形态与对照组相似(图)2（a））.然而，在不同的时间点(第3天、第5天和第8天)，共培养组的骨髓间充质干细胞密度大于对照组(图)2（a））.为了评估两组的增殖，CCK-8分析进行，直到第10天，和BMSC增殖曲线表明，BMSC与DRG共培养在每个时间点增殖更显著，尤其是在第6天第8天，与对照BMSC组相比（数字2（b））.因此我们选择共培养第8天的骨髓间充质干细胞，分析DRG对骨髓间充质干细胞多重分化的影响。茜素红、油红O和阿利新蓝染色结果显示，与骨髓间充质干细胞组相比，DRG +骨髓间充质干细胞组的骨髓间充质干细胞成骨、成脂和成软骨分化均增强(图)2（c））.这些研究结果表明，与DRG的共蜂节不仅可以增强增殖，而且促进BMSC的多种分化，这暗示了与DRG的共蜂酸可能对BMSCs的茎秆有影响。

3.3。与DRG共培养促进自我更新能力和骨髓基质干细胞相关基因的表达

为探讨与DRG共培养对骨髓间充质干细胞茎干性的影响，采用CFU法检测骨髓间充质干细胞的自我更新能力。第8天使用骨髓间充质干细胞，培养10天。与bmmsc组相比，DRG + bmmsc组形成了更多的菌落，菌落面积也大得多( ,图3（a））.为了验证DRG对BMSC干性的影响，我们检测到的干细胞相关的基因，NANOG，OCT4，和Sox2的表达，和所有的人共培养后显著上调为3，5，8天，尤其是在天5和图8（ ,图3（b）)，与骨髓间充质干细胞增殖结果一致。这些结果表明，与DRG共培养可以维持BMSCs的茎干性。

3.4。与DRG增强BMSC自噬

由于被越来越多的证据表明，自噬起到了干性维持干细胞的关键作用。为了验证自噬是否参与的共培养组中干性维护的BMSCs的过程中，我们发现在一天的自噬标记LC3II和LC3I通过Western印迹和免疫荧光蛋白表达的BMSCs 8.共培养组相比显示更强的LC3荧光强度骨髓干细胞在对照组中（图4（a））.可溶性LC3I与脂质结合的LC3II转换是自噬体形成的一个指标，所以LC3II / LC3I比是指自体吞噬的活化水平。Western印迹结果显示，有共培养组和LC3II在更LC3II蛋白表达/ LC3I比较对照组图共培养组中主要更大（4（b））.这些结果表明，在与DRG的共培育过程中，在BMSC中激活了自噬。

3．5．共培养组AMPK/mTOR信号通路被激活

为了鉴定BMSCs在共培养基团中的自噬激活机制，我们接下来研究了在共培养后的蛋白质印迹涉及自噬激活的两种常规信号通路，包括AMPK / MTOR和AKT / MTOR信号传导途径。MTOR的活化可以抑制自噬，AMPK的磷酸化抑制MTOR的活化，因此AMPK的活化将促进自噬水平。结果表明，与对照组相比，将P-AMPK的P-AMPK蛋白表达显着上调，而P-AKT的表达在两组之间保持不变（图5.）.这些结果表明，共培养组骨髓间充质干细胞的自噬激活可能是通过AMPK/mTOR信号介导的，而不是通过AKT/mTOR信号介导的。

3.6。化合物c治疗下调自噬和茎在共培养组细胞相关基因

为了进一步确认AMPK / MTOR信号传导介导BMSC茎的自噬和维持，我们将BMSC与化合物C，AMPK特异性抑制剂中的BMSC治疗，共培养组。在用化合物C处理8天后，与没有化合物C的共培养基相比，LC3II和LC3I的蛋白表达显着降低（ ,数据6(一)和6 (b)）.这说明在共培养体系中，AMPK/mTOR信号介导了骨髓间充质干细胞的自噬。此外，茎干性基因Sox2、Oct4和Nanog的mRNA水平主要下调，但仍高于对照组( ,图6 (c)）.这些数据表明，在共培养组中，AMPK/mTOR信号介导的自噬在骨髓间充质干细胞干细胞性维持中发挥了积极作用，但并非全部，共培养+化合物C组干细胞相关基因的表达仍高于对照组。

为了确定影响DRG来源的细胞对BMSCs的影响的因素，将DRG和BMSCs共培养8天，然后用NK1受体拮抗剂阿瑞吡坦处理48小时，浓度为50μμ。然后，检测到BMSCs，并在三组中，在三组，BMSCs + DRG，BMSCs + DRG + Agl和BMSC中进行自噬相关的蛋白质LC3I和LC3II和茎秆基因表达。我们发现，在共培养系统中加入了自噬相关蛋白的表达和LC3II / I的比例降低（图7(一)和7 (b))，但自噬蛋白表达及LC3II/I比值仍高于对照组(图)7(一)和7 (b)）.与自噬水平相似，与共培养组相比，阿瑞吡坦处理后茎干性基因也下调，但仍高于对照组(图)7 (c)）.这些结果表明，阿瑞吡坦可部分阻断DRG源性细胞对骨髓基质干细胞的效果，这表明P物质可能会在DRG源性细胞对骨髓基质干细胞的共培养系统的影响发挥了重要作用。

4.讨论

许多体内和体外的研究已经探索了感觉神经在骨生理学中的不同作用[6.-10］.然而，感觉神经在细胞水平上对骨细胞的直接作用及其分子机制尚不清楚。为了研究感觉神经对骨髓间充质干细胞细胞生物学行为的整体影响，考虑到在体内骨中DRG与骨髓间充质干细胞之间没有直接接触，我们设计了一种DRG与骨髓间充质干细胞的transwell共培养系统。我们发现，DRG可以促进骨髓间充质干细胞的增殖和自我更新能力。此外，共培养组骨髓间充质干细胞的多向分化更为显著。由于自我更新能力和多重分化潜能是干细胞的两个主要特征[23，我们假设与DRG共培养可能有助于保持BMSCs的茎干性。接下来，我们发现干细胞相关基因Sox2、Nanog和Oct4在共培养组中上调，进一步证实了DRG在该共培养体系中维持骨髓间充质干细胞干细胞性的作用。

如据报道，干细胞的茎秆维持与自噬关系密切相关[24-27］.自噬是一种细胞组分的自我降解的过程，其中双膜自噬粒子螯合细胞器或细胞溶溶胶部分和熔丝与冬叶族物质或血管源的熔丝，用于通过驻留水解酶进行分解[28］.许多研究对自噬维持干性的机制进行了研究。他们得出结论，自噬通过清除活跃、健康的线粒体来抑制干细胞代谢，从而帮助维持干细胞状态[25]清除有毒细胞垃圾[26]并防止反应性氧物种（ROS）积累[27］.在自体吞噬过程中，LC3据报道，自噬体的公知的标记物，和LC3II的比率/ LC3I反射自噬的水平[26］.在我们的研究中，为了证实自噬在共培养体系中是否在维持骨髓间充质干细胞干性中发挥作用，我们检测了LC3的表达，并分析了LC3 /LC3I的比值。我们的结果证明共培养组的基础自噬水平高于对照组，但我们仍不能得出较高的自噬水平导致本研究中BMSCs的维持。

证据坐骑揭示自噬的信号调节[29那30.]，其中AMPK/mTOR和AKT/mTOR是研究最多的两种途径[31-34］.因此，我们在共培养第8天检测AMPK、AKT和mTOR的蛋白表达，发现与对照组相比，共培养组中p-AMPK表达上调，mTOR表达下调，而AKT表达不变。因此，AMPK/mTOR信号通路介导了增强的自噬。此外，AMPK抑制剂化合物C [35那36，共培养组自噬及干细胞相关基因下调，说明自噬维持了AMPK/mTOR通路介导的共培养组骨髓间充质干细胞的干性。此外，化合物C组干细胞干性基因虽然低于DRG共培养组，但仍高于bmmsc单培养组，这可能提示共培养组除了增强自噬外，还存在其他维持干细胞干性的机制。

为了进一步确定DRG在BMSC上作用的因素，考虑了两个主要的感官神经肽，SP和CGRP。然而，根据一些研究，CGRP受体不仅存在于BMSCs中，而且存在于DRG和Schwann细胞中，并且CGRP可以在施万细胞和DRG的功能中发挥重要作用37-39］.因此，在共培养体系中，如果加入CGRP受体抑制剂，不仅会阻断骨髓间充质干细胞的CGRP受体，还会阻断雪旺细胞和DRG神经元的CGRP受体，这将彻底改变原有体系，使结果难以分析。由于我们没有发现SP对DRG和雪旺细胞有任何影响，我们使用了NK1受体拮抗剂阿瑞吡坦[21那22]，探讨SP在共培养体系中的作用。

在一些研究中，共培养系统被用于研究神经元与其他细胞之间的通信[16那40-43］.有报道称，在直接接触条件下，DRG可促进骨髓间充质干细胞分化成骨细胞增殖和成骨基因表达[40］.和感觉神经元能够调节MC3T3-E1细胞通过谷氨酸和P物质的胞吐作用，并证实该肽能神经元参与了这一过程[43］.最近，Silva等人[41]设计了一个只有DRG神经元的神经突到达骨髓间充质干细胞的微流控装置，研究感觉神经元对骨髓间充质干细胞的直接影响。他们发现，DRG神经元通过激活Wnt/增强了MSCs的成骨分化ββ-连环蛋白信号传导途径，其证明通过成骨基因和细胞质中的积累和易位的上调成核β-catenin在骨髓间充质干细胞中表达，但在我们的研究中发现，DRG在共培养体系中具有维持骨髓间充质干细胞干性的能力。它似乎与我们的结果不同。然而，在他们的研究中，骨髓间充质干细胞是在地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸，它可以在没有其他因素的情况下自行诱导成骨分化[44那45]，而我们并没有在我们的研究中添加成骨诱导剂。此外，还有在单 - 和共培养组之间的成骨细胞的标记基因没有成骨诱导培养基没有区别，这意味着的DRG神经元本身的效果不足以在体外诱导的成骨细胞。他们的结论是DRG只能增强成骨诱导培养基中存在的成骨细胞分化，但不能启动。这一发现与我们的结果一致。在我们的研究，促进骨生成的机理与DRG共培养Transwell小帮助维持骨髓基质干细胞的干性;然后，成骨诱导培养基将显示在成骨细胞分化更显著的效果。

据报道，体外培养损伤了骨髓间充质干细胞的干性[46那47，导致自我更新能力和多系分化能力受损，不利于其作为骨组织工程的种子细胞。此外，本研究发现骨髓间充质干细胞维持干性的机制是其基础自噬水平的提高。这提示适度增强自噬可能有利于体外培养干细胞，清除受损的细胞成分，保持细胞内稳态[48那49］.此外，自噬的强度可以通过某些药物，如雷帕霉素[来调节50那51Bafilomycin A1 [52那53］.由于BMSCs被广泛应用于骨组织工程中的种子细胞[54通过调节骨髓间充质干细胞的自噬强度，在不损害其自我更新和多能分化能力的前提下，为骨髓间充质干细胞在体外大量扩增提供了新的策略。

值得注意的是，在我们的实验中，虽然DRG外植体已经被粉碎消化，但DRG细胞同时含有感觉神经元和雪旺细胞。这两种成分类似于在体内的感觉神经，感觉神经突被雪旺细胞包裹[55］.因此，本实验观察到的干性增强现象应考虑感觉神经元和雪旺细胞的综合作用。另一项研究发现雪旺细胞分泌胞外囊泡促进和维持人牙髓细胞(human dental dental pulp cells, hDPCs)的增殖和多能性，并通过蛋白组学和Western blot分析，检测到Oct4和TGF的丰富富集β这解释了hDPCs中干细胞相关基因的上调和增殖的加速[17］.作为hDPCs表现在很多方面与骨髓基质干细胞共同的特征，这个结果可能部分阐明骨髓基质干细胞的干性增强含雪旺氏细胞在我们的研究共培养系统。同时，这也可以解释为什么骨髓基质干细胞的干性增强甚至共培养组化合物C阻断自噬后依然存在。

在我们的研究中，我们使用了Transwell Coculture系统来探讨DRG对BMSC的影响，这些系统在TEB中模仿植入的感觉神经和BMSC。我们发现DRG可以帮助维持BMSCs在体外的茎，其中来自DRG神经元的分泌物质P的过程起着重要作用。基于这一发现，可以假设植入组织工程骨的感觉神经增强了BMSC的自噬，并有助于保持其茎，这将保持BMSC的自我更新和多重分化能力。因此，BMSCs将更准备好促进和分化成其他种类的细胞，例如成骨细胞，软骨细胞，血管内皮细胞，甚至施旺细胞，在诱导条件下[56-58］.这些细胞都是骨修复和再生的关键。此外，骨髓间充质干细胞具有强大的旁分泌功能，包括生长因子和神经营养因子[59-61.］.保持茎干对保持这种能力很重要。此外，本研究为骨的神经元调控提供了一个新的视角，但除P物质外，DRG中哪些因素对骨髓间充质干细胞起作用，以及它们如何对骨髓间充质干细胞起作用，还需要进一步研究。

5.结论

DRG有助于维持BMSCS在Transwell共培养系统中的茎，并且通过AMPK / MTOR信号传导增强BSMC的自噬水平来实现该功能，这可以解释感觉神经促进骨质发生的机制，而物质P扮演物质在过程中的重要作用。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

信息披露

张淑石张，君钦李，惠杰江都是联合作者。

的利益冲突

提交人声明没有关于本文的出版物的利益冲突。

作者的贡献

杨柳，裴国贤，王春梅，张帅帅设计实验。张帅帅，李俊琴，高毅，蒋慧杰进行了CCK8和分化诱导实验。张帅帅，程鹏珍，曹天青，王吉萌进行RT-PCR和Western blot实验。宋悦、刘斌、吴浩进行骨髓间充质干细胞原代培养实验。张帅帅收集了数据。杨柳、张帅帅、李俊勤对数据进行分析并生成数据。张帅帅、杨柳、裴国贤撰写并修订了手稿。

致谢

本研究由国家自然科学基金重点项目(81430049和81772377)资助。

补充材料

图S1:单独使用化合物C并没有改变骨髓间充质干细胞的自噬水平和干性基因。(a) LC3I、LC3II蛋白表达。(b)两组间LC3II/LC3I分析。(c)两组间干细胞相关基因表达情况。（补充材料）

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