我们先前的研究发现,感觉神经束植入组织工程骨(TEB)可能导致更好的骨生成。探讨感觉神经促进骨生成的机制在TEB体外,一个transwell coculture实验设计之间的背根神经节(DRG)细胞和骨髓间充质干细胞(bmsc)。BMSC增殖是由CCK8化验,骨的,细粒,和去评估茜素红、阿尔新蓝,油红染色。我们发现bmsc的增殖和多功能分化都是增强coculture组相比bmsc组。结晶紫染色显示clone-forming coculture组的综合能力也增强和mRNA水平Sox2, Nanog, Oct4显著调节coculture组。此外,自噬水平的bmsc,调节其具备干细胞,被提拔coculture组,由AMPK / mTOR通路。此外,AMPK抑制剂化合物C可以显著下调LC3的蛋白表达和具备干细胞基因的mRNA水平coculture组。最后,我们发现NK1受体拮抗剂,aprepitant,可以一定程度上阻止这种效应,这表明,P物质发挥了重要作用的效果。一起,我们得出结论,DRG可以保持bmsc的具备干细胞通过增强自噬通过AMPK / mTOR通路在transwell coculture系统,这可能有助于解释更好的骨植入后感觉神经TEB。
骨组织工程提供了一种很有前途的解决大型骨缺损的治疗,但仍有许多问题需要解决(
感觉神经已经被报道在体内骨骼的新陈代谢和再生扮演关键角色(
体外研究表明,神经肽,如P物质和CGRP怎样
总的来说,这些发现体内和体外建议感觉神经在骨的新陈代谢和再生起到了至关重要的作用。然而,在细胞水平上的机制研究很少,和一种神经肽可能不能反映整体效果的感觉神经在骨细胞。因此,总体感觉神经的调节骨细胞,其内在的分子机制需要进一步的研究。
在这项研究中,我们使用一个transwell coculture系统对DRG细胞对bmsc的影响进行调查。我们的研究结果表明DRG可以帮助保持bmsc的具备干细胞通过改善基底自噬水平通过激活AMPK /在这个coculture mTOR信号系统。
bmsc从枚GFP Sprague-Dawley两星期(SD)老鼠收获使用良好的协议与轻微的修改(
bmsc从通道3使胰蛋白酶化,离心机,悬浮在寒冷的PBS,和细胞数量计算。然后,bmsc与2% BSA被封锁在室温下30分钟。与此同时,抗体与PBS稀释至推荐的浓度。之后,细胞密度调整1×10
刚产后SD大鼠被牺牲,和隔离DRG是基于前面的研究(
成骨分化培养基(rasmx - 90021)从Cyagen生物科学公司,购买和接受了手术治疗产品的用户手册。短暂,coculture 8天后,bmsc分离和播种密度的新12-well培养板2×10
chondrogenic分化,0.5毫升bmsc包含2.5×10
脂肪形成的分化,分化诱导介质(rasmd - 90031, 1
如前所述(执行细胞增殖试验
CFU试验进行了测量bmsc有或没有DRG细胞的自我更新能力。短暂、bmsc与DRG coculture后8天,被播种在50个细胞的数量60毫米板和培养10天,然后用结晶紫染色法染色方案。殖民地含有超过50个细胞在显微镜下计数。单一bmsc被认为控制所有的实验。所有实验进行三次。
所有程序都是根据产品的指令执行,指的是证据确凿的方法在之前的一项研究[
免疫印迹分析进行了如前所述[
细胞固定化与4%多聚甲醛和permeabilized 1% triton x - 100 10分钟,其次是阻止2%牛血清白蛋白30分钟。主要的抗体,兔多克隆抗体(LC3A / B, 50
AMPK抑制剂、复合维他命C,购买微孔(美国默克,Billerica的),和复合C的剂量是20
所有数据都表示为意味着±标准差和分析通过SPSS软件(版本13.0)。学生的团体之间的差异比较
bmsc似乎梭状形态与绿色荧光的古典形式(图
在这里,我们分析的影响与DRG coculturing BMSC multipotential分化和增殖。我们发现coculturing DRG显著提升BMSC扩散和提高其成骨的脂肪形成的,chondrogenic分化。老鼠GFP-BMSCs coculture组显示类似成纤维细胞的形态与对照组(图 Coculturing DRG推广扩散和增强multipotential bmsc的分化。(a)形态和密度的GFP bmsc天3,5,8。(b)增殖曲线后的bmsc coculture CCK8诊断相关的试验。(c)成骨、脂肪形成的和chondrogenic bmsc的分化有显著提升与DRG coculture后8天。
具备干细胞研究的影响与DRG coculturing bmsc, CFU化验,发现bmsc的自我更新能力,。bmsc在第8天使用和培养了10天。与BMSC组相比,更多的殖民地形成和殖民地地区大得多的DRG + BMSC集团( Coculturing DRG提升自我更新能力和bmsc的干细胞相关基因表达。(a) CFU bmsc的化验和bmsc +诊断相关组。紫色的点是指细胞殖民地。(b)干细胞相关基因表达在coculture 3, 5, 8天。
被越来越多的证据表明,自噬中起关键作用的具备干细胞维护干细胞。验证自噬是否具备干细胞参与的过程维护的bmsc coculture集团,我们发现自噬标记的蛋白表达LC3II和LC3I通过免疫印迹和免疫荧光在第八天。bmsc coculture组显示强LC3荧光强度比对照组的bmsc(图 Coculturing DRG增强bmsc自噬。(一)LC3 coculture 8天后免疫荧光图像。(b)的免疫印迹分析LC3II和LC3I LC3II / LC3I coculture 8天后比率分析。国防部:平均光密度。
为了确定自噬的机制激活的bmsc coculture集团,我们下了两个经典信号通路参与了自噬的激活,包括AMPK / mTOR和AKT / mTOR信号通路,通过免疫印迹coculture后8天。mTOR的激活可以抑制自噬,磷酸化的AMPK抑制mTOR的激活,激活AMPK会促进自噬的水平。结果表明,蛋白质的表达p-AMPK coculture组显著调节相比,在对照组,两组之间虽然P-AKT保持不变的表情(图 AMPK信号通路,而不是一种蛋白激酶信号通路被激活后在bmsc coculture 8天。
进一步确认是否AMPK / mTOR信号介导的自噬和维护BMSC具备干细胞,我们对待BMSC复合C,一个AMPK-specific抑制剂,coculture组。与复合C治疗后8天,LC3II的蛋白表达和LC3I与coculture组相比明显减少没有复合C ( 复合C治疗coculture组中表达下调自噬和干细胞相关基因。(a)在治疗后免疫印迹分析LC3II和LC3I c化合物(b)分析LC3II / LC3I三组。(c)干细胞相关基因表达与复合治疗后c。 确定因素在bmsc DRG-derived细胞的影响,DRG、bmsc cocultured 8天,然后是处理aprepitant, NK1受体拮抗剂,48 h 50的浓度 aprepitant对自噬的影响和具备干细胞基因coculture系统。(一)免疫印迹分析LC3I和LC3II aprepitant治疗后。(b)分析LC3II / LC3I三组。(c)具备干细胞基因表达与aprepitant治疗后。
多项研究表明,体内和体外,探讨了不同角色的感觉神经在骨生理学
据报道,具备干细胞维持干细胞与自噬(有密切关系
坐骑的证据显示信号调节自噬的
为了进一步确定的因素按作用于bmsc,两大感觉神经肽SP和CGRP怎样考虑。然而,根据一些研究CGRP怎样受体不仅存在于bmsc也在DRG、雪旺细胞、和CGRP怎样可以发挥重要作用在雪旺细胞的功能和按
在几项研究中,coculture系统已被用于研究神经元之间的通信和其他细胞(
据报道,在离体培养bmsc的具备干细胞受损
应该注意,DRG细胞感觉神经元和雪旺细胞包含在我们的实验中,尽管DRG外植体被分解和消化。这两个组件是类似于感觉神经在体内,在那里感觉缠绕的雪旺细胞(神经突
在我们的研究中,我们使用一个transwell coculture系统探索的影响DRG bmsc,模仿植入感觉神经和bmsc TEB。我们发现DRG可以帮助保持bmsc的具备干细胞体外,在从DRG神经元分泌P物质的过程中发挥了重要作用。基于这一发现,它可能是假设的感觉神经植入组织工程骨的自噬增强bmsc,帮助保持其具备干细胞,从而保持自我更新和multilineage bmsc的分化能力。因此,bmsc更准备增殖并分化成其他类型的细胞,如成骨细胞、软骨细胞、血管内皮细胞、雪旺细胞,诱导条件下(
DRG中有助于维护bmsc的具备干细胞transwell coculture系统,和这个函数是通过增强的自噬水平BSMCs通过AMPK / mTOR信号,这也许可以解释感觉神经促进骨生成的机制,和P物质在这个过程中起着重要的作用。
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
江Shuaishuai张、李黄俊钦Huijie共同第一作者。
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
刘洋,Guoxian裴,王纯美少女,Shuaishuai张设计实验。Shuaishuai张黄俊钦,易高,和江Huijie CCK8和分化诱导实验。专业Shuaishuai张Pengzhen Cheng曹,冀萌当初王执行rt - pcr和免疫印迹实验。刘曰歌,本,吴皓执行主BMSC文化实验。张Shuaishuai收集数据。刘洋,Shuaishuai张,黄俊钦李生成的数据和数据分析。Shuaishuai张,刘洋和Guoxian裴写道,修订后的手稿。
本研究在经济上支持的中国国家自然科学基金重点项目(81430049和81430049)。
图S1:复合C单独并没有改变bmsc的自噬水平或具备干细胞基因。(一)蛋白表达LC3I LC3II。(b)分析LC3II / LC3I两组之间。(c)干细胞相关基因表达在两组之间。