潜在影响液来自癌症干细胞和msc在老鼠DEN-Induced肝癌的进展

文摘

相声,由液,在正常干细胞和肿瘤干细胞在肿瘤微环境(二者)到目前为止得到的关注更少。此外,没有出版物文献中解决在活的有机体内液的影响来源于二者和间充质干细胞(msc)长期肝细胞癌(HCC)的进展。中,我们假设液转移肝癌微环境细胞可以诱导或抑制肿瘤的生长和转移依赖于他们的来源。检查这一假设,我们研究了液的影响来自两个不同的干细胞数量,肝二者和骨髓(BM) msc,在老鼠和长期DEN-induced HCC进展相关的潜在机制。CSCs-exosomes诱导肝脏相对重量和血清水平大幅上升的癌症标记物(法新社和GGT)和肝酶(ALT、AST和高山),为肝癌标记GST-P强化免疫染色,增加肿瘤结节的数量和面积比肝癌大鼠注射PBS。CSCs-exosomes也减少细胞凋亡(的差别,对这些基因伯灵顿和p53和upregulationBcl2,增加增殖细胞核抗原)的免疫染色,增加angiogenetic活动(upregulation透露的VEGF),增强转移和侵袭性(upregulation P13K和ERK蛋白及其下游的目标MMP9的差别,对这些TIMP1)和诱导上皮间充质转变(增加血清和肝的TGF水平β1信使rna和蛋白质)。也值得注意的是,CSCs-exosomes高架HCC exosomal microRNA (miR) 21日exosomal长非编码RNA Tuc339(信号),lncHEIH, HCC lncHOTAIR和减少肝脏miR122和HCC大鹏(miR148a, miR16, miR125b)。所有这些细胞,功能和分子改变注入BM-MSCs-exosomes后逆转。然而,二者,MSCs-exosomes未能改变氧化应激升高或抑制抗氧化活动引起的肝细胞癌。总的来说,我们的研究结果显示肿瘤刺激效果(诱导肿瘤的生长、进展、转移)源自二者液和液的抑制作用来自msc。这些结果提供有价值的洞察力对二者的影响,MSCs-exosomes HCC生长和发展在活的有机体内,这可能有助于了解肝癌发展的机制。

1。介绍

肝细胞癌(HCC)是一个主要恶性肿瘤肝细胞和第三全球癌症死亡的最常见原因。尽管明显的肝细胞癌的诊断和治疗策略的进步在过去的几十年里,最大的5年生存率仍在晚期肝癌患者由于高转移和/或手术后的复发率(1]。过去的几十年里显示科学进步在解体肝癌的分子信号通路;然而,特定的HCC的调节机制仍不清楚。最近的研究表明,不同细胞之间的exosomal内容交换人口在肝细胞癌肿瘤微环境不仅可以有一个关键的角色在启动和维护也可能代表一种有效的生物标志物和治疗目标。

液是细胞外的30 - 100 nm直径nanovesicles产生的几乎所有细胞类型(2]。类似于其他液,liver-derived液发挥重要作用在细胞间通信通过保证水平转移的核酸(即。信使RNA,微RNA (miR),长非编码RNA分子(lncRNA),循环DNA)和蛋白质之间的货物不同的细胞在肝脏(看过的3])。细胞相互作用受这些液扮演着关键的角色在肝脏内稳态4]。事实上,liver-derived液诱导肝细胞和cholangiocyte扩散受伤后5,6),可以激活星状细胞(7),和传播肝代谢酶(8]。相比之下,HCC exosomal货物和肿瘤微环境之间的相互作用参与肿瘤恶化,转移,化疗耐药性主要通过诱导免疫抑制和血管生成9,10]。大多数的这些exosomal货物(即。,miR18a, miR21, miR221, lncVLDLR, and lncTUC339) are enriched in HCC, with only few miRs (i.e., miR718) exhibiting a notable downregulation in HCC [11,12]。lncVLDLR介导抗化疗药物在肝细胞(13,14),而lncTUC339和lncHEIH与肝癌的发病和进展(12,15]。

间充质干细胞(msc),多功能细胞能够自我更新和发展为多个血统,能与肿瘤细胞迁移和交互。骨骨髓来源msc (BM-MSCs)抗肿瘤活性,引起白介素- 2 (IL)和干扰素(IFN) b (16]。然而,MSC-based疗法协会的问题有很多,比如需要一个一致的细胞,异位组织形成,栓子形成肺毛细血管,immunorejection [17]。此外,许多研究表明,msc促进肿瘤的生长,通过改善肿瘤血管化或创建一个肿瘤干细胞利基(18]。尽管msc调节肿瘤细胞的机制仍不清楚,液来自msc及肿瘤细胞之间的相互作用是主要的球员在这个效应(19]。治疗癌症的液源自msc更优于治疗由msc自己因为液更小,因此可以通过血液供障碍,比细胞和他们不太复杂,因此可以很容易地通过细胞实验(20.]。一些研究报道,管理MSC-derived液可以减轻急性肝损伤和肝纤维化的副作用(21,22]。然而,到目前为止,只有很少有研究调查这种对肝癌的影响。在体外,BM-MSC-derived液诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞HepG2细胞(23]。在活的有机体内内,注入BM-MSC-derived液HepG2-induced SCID小鼠皮下肿瘤抑制肿瘤恶化[23]。此外,静脉注射脂肪MSC - (AD-MSC)导出液在HCC的原位模型(由鼠N1S1-cell接种诱导)抑制肿瘤恶化通过upregulation当地和系统性的NK细胞(24]。miR122液来自AD-MSC增加肝癌细胞的化学敏感性在体外和在活的有机体内(10]。此外,共同BM-MSCs和tumor-derived液在IFN-g导致肝癌细胞增殖减少由于细胞周期阻滞于G0 / G1期(25]。

的肝癌干细胞样细胞的微环境包含一个小的子集,癌症干细胞(二者)在肝细胞癌发病起着重要的作用,维护,和转移(26]。这些二者可能起源于干细胞恶性转化正常住宅(nsc)在肝脏27]。因此,二者之间的exosomal基因改变和nsc之前可能发生之间的肝细胞癌组织和正常肝组织(28]。液源自二者是药物抗性和肿瘤转移的重要介质。在液来自CD90 lncRNA段H19⁺二者诱导血管生成,因此限制了功效的抗血管新生治疗肝细胞癌(29日]。CSC-derived液也可以重组AD-MSCs成myofibroblast-like细胞,随后维持肿瘤生长和血管生成(30.]。这诱导msc出示自己的液,维持肿瘤生长和改变的功能是非细胞肿瘤微环境,提高他们protumor函数(审核(31日])。有趣的是,是非细胞还可以通过分泌抑制转化细胞的增殖液含有抗增殖大鹏展翅,lncRNAs到肿瘤微环境(9]。然而,侵略性癌细胞通常克服这种抑制作用,导致肿瘤恶化。

大量研究表明,液肿瘤微环境中发挥关键作用在癌症生长和进展通过改变和/或调节局部细胞微环境(11,13,14,32]。然而,大多数这些研究进行癌症细胞系(在体外)或短期肝癌动物模型,癌细胞接种引起的,它不能显示的治疗影响MSC-derived液长期肝癌模型。此外,尽管CSC-derived液囊对肝癌进展的影响,我们所知,很少有可用出版物文献中解决在活的有机体内这些液对肝癌的进展。这里,我们评估的潜在影响液源自BM-MSCs和肝二者发展diethylnitrosamine——(DEN)诱导大鼠肝癌和涉及潜在的机制,关注exosomal大鹏和lncRNAs。

2。材料和方法

2.1。隔离二者从肝癌肝脏

过程遵循以前公布的协议(33]。短暂,收集肿瘤结节DEN-induced肝癌大鼠的肝脏被洗净,剁碎成1毫米³件,然后在DMEM培养基培养,补充的边后卫和1%青霉素和链霉素(Lonza、瑞士)。曾经的原发肿瘤细胞形成单层(大约3周后),细胞收获与trypsin-EDTA (Lonza)和recultured 37°C和7%的公司₂在定义干细胞无血清培养基(DMEM / F12培养基,含2毫米/ l谷酰胺,4 U / l胰岛素样生长因子1 (IGF1) B-27补充,15 ng / ml碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)和20 ng / ml表皮生长因子(EGF) (Sigma-Aldrich))。绝大多数(90%到70)的细胞附着,一些漂浮细胞形成球体。这些领域在DMEM / F12培养基培养,细胞补充的边后卫,成为连接和成长为一个单细胞层1星期。用PBS的边后卫被免职,并定义干细胞生长介质后来补充说。

2.2。隔离从骨髓msc

骨骨髓来源msc是孤立的,根据以前公布的协议(34),雄性白鼠长骨头的冲洗使用无菌PBS。刷新细胞在DMEM包含10%的边后卫和1% penicillin-streptomycin-amphotericin B, 70毫米滤网过滤(BD,猎鹰),然后在3000离心机7分钟。细胞培养获得5%股份有限公司₂孵化器在37°C,不依从细胞被洗中频繁变化(3 h那么一半介质变化每8 h前3天内,每周更新的媒介)。当细胞达到80 - 90%的融合(约2 - 3周后),贴壁细胞(疑似msc)收集trypsin-EDTA 0.25%在室温下2分钟。孤立的msc通道3后使用。

2.3。识别孤立二者和msc

孤立的具备干细胞肝二者和BM-MSCs证实了rt - pcr基因特定的干细胞,Nanog和Oct-3/4。使用下面的老鼠引物:Nanog5、前进-GCCCTGATTCTTCTAGCAAT-3 ,和反向,5-AGAACACAGTCCGCATCTT-3(放大120个基点片段),Oct-3/4前5-CATCTGCCGCTTCGAG-3 ,和反向,5-CTCAATGCTAGTCCGCTTTC-3(放大165个基点的片段)。进一步证实二者孤立的识别和msc是由流式细胞仪(美国应用生物系统公司调)使用特定干细胞标记(五个正面标记:anti-CD24, cd44, -CD133, -EpCam, -CD90,和两个负面标记:anti-CD34和-CD45),根据制造商的指令(Becton, Dickinson)。

2.4。外来体隔离和表征

msc及二者在DMEM培养没有的边后卫(补充0.5%的牛血清白蛋白);以后这个媒介将收集并称为条件培养液(CM)。CM收集游离后48 h和离心机,享年3000岁10分钟去除细胞碎片。包含液的上层清液过滤0.42μ过滤和离心分离机在1200030分钟在4°C清除残骸和凋亡。从上层清液液分离超速离心法在100000的两倍(最适条件l - 90 k;贝克曼库尔特)90分钟/每4°C,用PBS(一个区间35),由布拉德福德exosomal蛋白质含量测定的方法。隔离液通过透射电子显微镜(jem - 2100,乔尔Inc .)在80千伏。液颗粒状,戊二醛固定在2.5%甲次砷酸盐缓冲在20°C 1 h,和沾2%醋酸双氧铀。的具体结构蛋白液(CD63(1: 500),研究(1500);圣克鲁斯)验证了免疫印迹。

2.5。动物和实验设计

健康男性白化大鼠( 年龄相仿的)(~ 4周)和体重(~ 130通用)被安置在一个温度控制(°C) 25日- 27日和光控房间(12 h光/暗周期)与免费食品(标准饮食)和水。老鼠适应开始前14天的实验程序。所述所有实验程序遵循的指导方针机构Kafrelsheikh动物保健和使用委员会Zagazig,阿卜杜拉国王大学和执行按照美国国立卫生研究院的指导方针。

雄性老鼠和匹配的重量和年龄是随机分为4组( ):正常控制(也),DEN-induced肝癌由美国公共广播公司(PBS)注射,HCC-administrated CSC-derived液(CSC-Ex)和肝癌治疗MSC-derived液(MSC-Ex)组。正常组大鼠(也)PBS管理在整个实验过程持续时间(22周)。剩下的60个老鼠都被赋予了一项单一的腹腔内注射的200毫克/公斤的巢穴(Sigma-Aldrich) 1毫升的PBS。两周后,2-acetylaminofluorene (2-AAF;150毫克/公斤,Sigma-Aldrich)口服DEN-induced肝2周,促进发展的焦点。在14周,肝左、右叶的直接注入了200μl PBS (PBS组),或者250μg MSC-derived液(MSC-Ex组)或250年μ200年g CSC-derived液(CSC-Ex组)μl PBS (22]。在后者的两个组,两个辅助静脉注射250μg各自液有16周和18周的实验。

22周的试验中,老鼠被光下颈椎脱位乙醚麻醉,肝脏是重(绝对肝脏重量),然后是肝脏相对重量计算的比例绝对肝脏重量/体重。

2.6。评价血清生化参数

收集血液样本血清中牺牲的时候管(真空采血管)和离心机在3000年5分钟获得血清。肝损伤的血清生物标志物(天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)),肝癌生物标记(α胎蛋白(法新社)γ谷氨酰转移酶(GGT)),并使用商用工具白蛋白测定。TGF的血清水平β1使用老鼠TGF估计β1酶联免疫试剂盒(ab119558)后,制造商的协议(Abcam)。

2.7。评价肝脏脂质过氧化和抗氧化生物标志物

肝组织均质使用冷PBS,紧随其后的是离心,享年5000岁15分钟在4°C。上层清液是用来测量浓度的脂质过氧化作用生物标志物MDA和抗氧化酶SOD的活性,猫,GPX使用商业套装(Biodiagnostics有限公司埃及开罗,草毒死实验室有限公司Crumlin,英国),如前所述36]。

2.8。组织病理学染色

肝组织样本neutral-buffered 10%福尔马林溶液中固定在乙醇脱水,二甲苯清除,在石蜡组织块形成阻碍。后者是分段(4 - 5μ米),和幻灯片通过苏木精和伊红染色())或用于免疫染色。肿瘤分级分为四个等级:低(一级)、中度(二级)、高级(三级),和非常高的(IV)级Edmondson-Steiner(学位)标准(37]。

2.9。免疫组织化学

一夜之间,肝脏幻灯片被孵化在4°C多克隆兔anti-rat谷胱甘肽S-transferase胎盘形成(GST-P)抗体(1:500稀释、医疗和生物实验室有限公司有限公司、日本)和增殖细胞核抗原(PCNA)抗体(Dako 1: 500年,美国)。结合抗体被3可视化,3-diaminobenzidine (DAB)衬底工具包(向量实验室、美国),和核使用迈耶的苏木精复染色。数量和区域(毫米²)每肝脏部分(cm GST-P-positive疫源地进行了分析²)如前所述38),而PCNA-positive细胞(棕色核)量化使用ImageJ软件1.44版。

2.10。通过实时PCR分子分析

从肝组织总RNA分离(新鲜或冷冻)使用RNeasy迷你包(试剂盒,# 74104),如前所述39]。反转录的互补脱氧核糖核酸合成RNA按照制造商的指示使用Quantiscript逆转录酶(试剂盒,# 205310)。特定的引物伯灵顿,p53,Bcl2,TGFβ1,NFκB,VEGF,MMP9,TIMP1基因设计引物3网络工具的基础上发表了老鼠序列(表1)。lncTuc339、lncHEIH lncHOTAIR取自RiboBio(广州)。实时定量PCR (qPCR)进行使用QuantiTect SYBR绿色qPCR主加入StepOnePlus实时PCR系统(美国应用生物系统公司)和反应周期如前所述40]。临界阈值的数量(Ct)的目标基因与数量(Ct)规范化的内部控制(β肌动蛋白)如前所述41]。表达水平相对于正常控制样本。

2.11。量化的大鹏展翅

大鹏总额与肝组织使用三试剂LS和mirVana RNA隔离设备(Sigma-Aldrich)根据制造商的过程。6卷μl孤立大鹏反向转录使用TaqMan microrna逆转录工具包(应用生物系统公司),根据制造商的协议。miR21的表达谱,miR122、miR148a miR16, miR125b衡量qPCR使用TaqMan microRNA化验(应用生物系统公司)。相对样本米尔表达式是使用miR484调整的,作为一个内部参考(422),方程^−∆∆Ct。

2.12。西方墨点法

肝脏组织细胞溶解在里帕缓冲区,和布拉德福德的蛋白浓度测定方法。等量的蛋白质被加载和10% sds - page凝胶分离。蛋白质被转移到0.45μ聚偏二氟乙烯膜(微孔)。孵化后一夜之间主要的抗体在4°C,膜被孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭山羊anti-rabbit抗体(1:5000;圣克鲁斯)在室温下1 h。开发特定的蛋白质乐队使用tetramethylbenzidine(三甲,σ)。蛋白质的微密度分析乐队使用ImageJ软件进行。每个乐队的密度被规范化β肌动蛋白。源和稀释TGF因素主要抗体β(1:150;Bioworld)、磷脂酰肌醇3-kinase (PI3K, 1: 100年,Abcam)和ERK(1: 100年,圣克鲁斯)。

2.13。统计分析

单向方差分析使用GraphPad棱镜5 (GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)被用来确定组之间的差异。意味着与图基进行了比较的诚实的显著差异(图基HSD)测试。数据了 意味着(SEM),误差和意义被宣布 。

3所示。结果

3.1。养殖二者和msc的识别

BM-MSCs形态表现为他们的粘性和梭状回(呈)形状(数字1(一)和1 (b))。附着最早观察到细胞在培养瓶2周后镀的HCC外植体茎cell-selective媒体(图1 (c))。这些干细胞样肿瘤细胞克隆扩张(图是强劲增长特征1 (d)),和一个层细胞形成后1周(图1 (e))。采用无血清培养后细胞媒体,一些漂浮细胞形成特征组成的球体的干细胞(图5 - 10细胞1 (f))。孤立的二者具备干细胞和BM-MSCs证实了两种干细胞基因的rt - pcr检测Nanog(120个基点)Oct-3/4(165个基点,图1 (g))。培养细胞的身份被流式细胞术进一步证实了。肝脏二者积极表达表面标记CD24, CD44, CD133 CD45 EpCam和消极的表达,而BM-MSCs积极CD90和CD44表达消极表示CD45和CD34(图1 (h))。

3.2。描述和标签CSC和MSC-Derived液囊

透射电子显微镜检查显示存在nanovesicles平均直径范围从30到100纳米的样品来自BM-MSC孤立(图2(一个))和CSC(图2 (b)由超速离心法)媒体。免疫印迹结果证实exosomal特定标记CD63的表达和研究这些液(图2 (c))。

3.3。液对死亡率的影响,相对肝脏重量

在整个实验过程中,死亡率为10% (2/20),5% (1/20),25% (5/20),PBS MSC-Ex,分别和CSC-Ex团体。此外,管理局CSC-derived液(CSC-Ex组)DEN-induced肝癌大鼠的肝脏导致肝脏相对重量显著增加(5.52±0.1%, , )相比,在PBS-injected肝癌大鼠(PBS组,4.73±0.12%, 与正常组, )和正常组(2.95±0.10%, )。相比之下,注入MSC-derived液(MSC-Ex组)导致肝脏相对重量明显降低(3.48±0.12%, , )与PBS组相比,但这相对体重仍高于正常组。

3.4。液对生化的影响参数

血清水平的癌症标记物(法新社和GGT), TGFβ1,肝酶(ALT、AST和高山)明显高于CSC-Ex组,其次是PBS组与正常组。这些升高MSC-Ex组水平相对较低,但仍略高于正常组(图3)。重要的是,血清白蛋白MSC-Ex组明显高于CSC-Ex和PBS组。

另一方面,PBS组表现出低水平的三种抗氧化剂酶(SOD、GPX和猫)和脂质过氧化反应标记肝组织MDA水平高于正常组。有趣的是,管理液源自二者和msc没有显著改变这些参数(图的水平4)。

3.5。组织病理学和免疫染色液引起的变化

与正常的组织学观察正常组(图5(一个)),PBS组大鼠的肝脏显示改变肝脏病灶(AHF)包含大,六角,有液泡的细胞(图5 (b))。肝脏CSC-Ex集团展出大量增殖的椭圆形细胞周围AHF(箭头,图5 (c))。相比之下,MSC-Ex几乎没有AHF组和椭圆形细胞与细胞凋亡显著增加(箭头,图5 (d))。根据Edmondson-Steiner成绩,多数肿瘤CSC-Ex和PBS组高(三级)和(IV)级成绩很高,分别,而MSC-Ex组所有的肿瘤都低(年级我老鼠10/15)和温和的(II级,大鼠5/15)。

此外,免疫组织化学检查表明,肝癌的平均数量和区域标记谷胱甘肽S-transferase胎盘形成(GST-P)积极的焦点也在CSC-Ex PBS组显著高于控制(图6)。再次,GST-P-positive焦点数量和面积在MSC-Ex组相比显著降低CSC-Ex和PBS组。同样,疣状与核扩散标记PCNA指数显著降低,主要在改变焦点,在MSC-Ex相比CSC-Ex(最高)和PBS组(图6)。

3.6。分子液引起的肝癌微环境的变化

检查潜在的分子机制诱导液源自二者和msc在肝细胞癌基因表达的变化凋亡标记(伯灵顿和p53),凋亡标记(Bcl2),EMT-related基因(TGFβ1),炎症相关的基因(NFκB),angiogenesis-related基因(VEGF),metastasis-related基因(MMP9和TIMP1)在大鼠肝脏中发现的所有组织和获得的数据显示在图7。CSC-Ex组其次是PBS组显示最显著增加,最高Bcl2, TGFβ1,NFκB,VEGF,MMP9信使rna水平和最低的p53,伯灵顿,TIMP1信使rna水平。相比之下,MSC-Ex展出的mRNA水平显著下降Bcl2,TGFβ1,NFκB,VEGF,MMP9并在mRNA水平的显著增加p53,伯灵顿,TIMP1相比,与其他三组。

给一个更深的洞察潜在的分子机制,我们检查的变化表达一些大鹏和lncRNAs肝癌微环境中。CSC-Ex组表现出显著的肝脏的upregulation exosomal miR21, lncTuc339, lncHEIH,和HCC lncHOTAIR在HCC miR122差别明显对这些miR148a, miR16, miR125b比PBS组(图8)。相比之下,肝脏MSC-Ex组明显下降的表达exosomal miR21, lncTuc339, lncHEIH,和HCC lncHOTAIR HCC miR122显著增加,miR148a, miR16, miR125b比PBS和CSC组。

在蛋白质水平,免疫印迹结果显示显著增加TGF的表达βP13K, ERK在CSC和PBS组肝脏,CSC的最高表达,而正常组(图9)。然而,政府MSCS-derived液导致显著减少这些蛋白的表达。

4所示。讨论

液发挥重要作用在癌症启动、进展、转移调节分子信号通路在肿瘤微环境。最近,exosome-based疗法已经进化为HCC进展潜在的抑制剂在体外(肝癌细胞株)和在活的有机体内(肝细胞在肝脏或皮下异种移植行)以最少的并发症(23,24];然而,这些充满敌意的肝组织内液的疗效仍然是一个严重的问题。肝细胞癌液可以诱导或抑制肿瘤的生长和转移取决于他们的来源。集体事实上,我们的研究结果显示肿瘤刺激效应CSCs-exosomes和MSCs-exosomes DEN-induced HCC在老鼠的抑制作用。

最重要的一个问题,使肿瘤的治疗无效的存在二者携带高转移性、复发性和chemoresistant属性(43]。因此,至关重要的目标,这些细胞或液,更有效地根除肿瘤。我们所知的这可能是第一个研究调查潜在CSCs-exosomes对HCC进展和转移的影响在活的有机体内。意料当中,我们的研究结果显示,CSCs-exosomes诱导肿瘤的生长、进展、转移。他们诱导肝脏相对重量和血清水平大幅上升的癌症标记物(法新社和GGT)和肝酶(ALT、AST和高山),以及密集的肝癌标记GST-P疣状,并增加数量和面积的肿瘤AHF相比肝癌大鼠注射PBS。值得注意的是,血清白蛋白CSC-Ex组显著低于PBS组。这可能表明白蛋白水平和HCC进展之间的负相关。同意这一观点,研究血清白蛋白升高不仅是相关的肝细胞癌患者的复发率较低的但也可以抑制肿瘤细胞增殖44]。

进一步确定机制负责CSCs-exosomes在肿瘤恶化的影响,我们发现一些基因的表达被认为是重要的肿瘤生长(伯灵顿,p53,Bcl2)、转移和血管生成(TGFβ1,NFκB,MMP9,TIMP1,VEGF由qPCR)。我们也评估TGF的表达β、P13K和ERK蛋白免疫印迹,量化的疣状核增殖细胞核抗原,免疫组织化学标记,并测量了TGF的血清水平β通过ELISA。我们的研究结果证实,CSCs-exosomes的表达增加Bcl2,TGFβ1,NFκB,MMP9,VEGF基因;TGF的表达β1、P13K和ERK蛋白;PCNA的疣状;和TGF的血清水平β1,但是减少伯灵顿,p53,TIMP1mRNA水平相比,肝癌大鼠的肝脏肝细胞性肝癌大鼠注射PBS。这些结果表明,CSCs-exosomes有明显的诱导增殖能力,转移和血管生成,导致显著的肿瘤的生长和发展。,先前的研究显示来自CD90液的能力⁺二者通过类似的分子机制导致肝癌血管生成(29日]。CSC-derived液也可以重组AD-MSCs成myofibroblast-like细胞,随后维持肿瘤生长和血管生成(30.]。此外,HCC-derived的吸收液诱发不动的正常肝细胞的迁移和入侵能力通过激活PI3K / AKT和增殖蛋白激酶(MAPK)信号通路及其下游目标MMP2和MMP9 [45]。

有趣的是,从二者或液msc对活动没有显著影响抗氧化酶(SOD、GPX和猫)和脂质过氧化水平标记在肝癌肝脏MDA与PBS组相比,表现出降低酶的活动和MDA水平较高。这表明氧化应激和抗氧化途径不得参与刺激或者抑制二者的影响——或者MSCs-exosomes,分别在HCC进展。与我们的结果相比,Dutta et al。46)发现液源自乳腺癌细胞系可以诱导氧化应激损伤主要收件人人类乳腺上皮细胞。这些相互矛盾的结果可能归因于癌症类型和目标细胞的变化进行了分析。Dutta et al。46液)刺激正常乳腺上皮细胞肿瘤。这种治疗增强氧化应激反应在正常细胞。相反,我们专注于肝细胞已经改变,来自大鼠肝细胞在肝脏的大疫源地。这些细胞已经修改和容易表现出高水平的氧化应激与正常细胞相比(PBS组与正常组)。

动员住宅msc为msc肿瘤可能表明一个重要的角色在肿瘤。研究人员使用了一些肿瘤模型外生msc和他们的调查管理导出液对肿瘤恶化的影响。有趣的是,一些研究揭示矛盾的结果,一些研究人员发现msc / MSCs-exosomes诱导肿瘤发展和其他报告肿瘤抑制效果。我们的结果同意布鲁诺et al。23)和Ko et al。24)报道,MSCs-exosomes诱导肿瘤回归在注入本地HepG2 cell-induced裸小鼠皮下肿瘤或静脉注射在大鼠N1S1 cell-induced肝肿瘤,分别。相比之下,朱et al。47)发现MSCs-exosomes诱导皮下肿瘤的生长,形成的肝癌细胞系异种移植,在裸小鼠。造成这种差距的原因尚不清楚,但这可能是归因于外来体注入的时间之前或之后肿瘤形成(48]。在目前的研究和实验的布鲁诺et al。23)和Ko et al。24),液肿瘤启动后的管理,而朱et al。47与液]coinjected肿瘤细胞;然而,这需要进一步调查。类似的矛盾被报道的msc诱导肿瘤恶化coadministrated时肿瘤细胞(49),但当注入诱导肿瘤回归建立肿瘤(50,51]。因此,msc的存在很可能在肿瘤的微环境或液所需的初始阶段可以增强血管生成,肿瘤发病或创建肿瘤干细胞利基(47,49]。然而,当他们在建立注射肿瘤,抑制血管生成,诱导细胞凋亡,导致肿瘤回归(23,50,51]。在支持中,我们还发现了一个更高的凋亡率(所示增加凋亡基因的表达,伯灵顿和p53,减少凋亡基因的表达,Bcl2,弱核增殖细胞核抗原标志)和组织化学染色angiogenetic活动(显示的差别,对这些基因的减少VEGF基因)注入BM-MSC-derived液囊后建立了肝癌。激活的看门人由MSCs-exosomes可提高肿瘤抑制基因p53功能,基本抑制肿瘤形成的机制。的另一个可能的解释有争议的结果MSCs-exosomes肿瘤增长可能这些液的异质性,作为他们的捐助者(msc)来自不同来源所以产生液也可能携带不同的分子可能促进或抑制肿瘤发展。此外,不同的肿瘤类型,在活的有机体内肿瘤模型和外来体管理的方式和时间的变化也可能影响液对肿瘤恶化的影响(48]。

液调节细胞间通信通过转让货物的蛋白质,mrna,大鹏展翅,lncRNAs [52参与细胞之间的基因交换()53]。提供有价值的洞察液的潜在的分子机制,我们检测到的表达一些大鹏和lncRNAs肝癌微环境中。管理CSCs-exosomes增加肝细胞癌的表达exosomal miR21和减少肝脏miR122和肝细胞癌的表达大鹏(miR148a、miR16 miR125b)比肝癌肝注入PBS。这个表达谱大鹏MSC-Ex组正好相反。其中大鹏展翅,miR122肝脏特异性米尔构成70%的肝脏大鹏(54)与肝细胞癌相关差别及其对这些发展在人类和啮齿动物(55,56]。然而,miR21肝脏特异性抗增殖米尔,是肝癌细胞中过表达57和促进他们的扩散和转移58]。因此,miR21抑制凋亡在二者59]。此外,miR122-loaded MSC液增加了肝癌细胞的化学敏感性在体外和在活的有机体内(10),表明MSCs-exosome的潜在作用,通过他们的抗肿瘤大鹏展翅,在肝癌治疗。在一致性,我们还发现miR122表达的增加以及增加了肝癌肝MSCs-exosomes注射后的细胞凋亡。anti-HCC效应miR122 IGF1由肝细胞产生阻碍,以确保自己的扩散(32]。因此,在目前的研究中,二者可能诱发肝癌进展的miR122差别通过对这些肿瘤微环境,但这需要实验使用mimic122和anti-miR122证实这个假说。同样,anti-HCC miR148a和miR125b对上皮间充质转变起到抑制作用(EMT),针对TGF CSC-like表型β1,这是一个有力的刺激,EMT在肿瘤微环境和诱发肝干细胞在肝细胞癌二者的变换(60]。协议,动物注射CSCs-exosomes表现出一个水平的下降这两个大鹏展翅(miR148a和miR125b)和TGF血清水平的增加β1、肝TGF的表情β1信使rna和蛋白质。miR148a也是proapoptotic microrna的压制Bcl2(61年]。这也许可以解释CSCs-Ex集团降低肝癌细胞凋亡miR148a最低和最高Bcl2信使rna水平。相比之下,MSCs-exosomes的镇压作用在HCC可能由高miR148a和低Bcl2 mRNA和TGFβ1信使rna和蛋白质含量。此外,高纯度的抗血管新生miR16 MSCs-exosomes抑制VEGF表达从而有利于血管生成的抑制乳腺癌细胞受体(看过的62年])。以类似的方式,我们发现upregulation miR16和VEGF接收BM-MSCs基因在肝癌大鼠肝脏。

lncRNAs收购CSC表型中扮演着重要的角色,因此他们的目标可能是肝癌的新治疗策略。事实上,最近的研究报告说,有针对性的抑制lncDANCR减少皮下肿瘤发展和肝内肿瘤小鼠模型63年]。在协议中,我们还发现,肝内注射CSCs-exosomes导致显著增加exosomal lncTuc339, lncHEIH, HCC lncHOTAIR。再一次,这三个的表达lncRNAs MSC-Ex组的肝脏表达下调。与我们的结果一致性,最近的一项研究[15]显示最高的刺激效应表示lncRNA肝癌细胞衍生液,TUC339,肝癌细胞增殖和转移潜能细胞粘附在ECM下降。同样,lncHOTAIR促进肿瘤正常肝干细胞到二者的转换,导致进步的转移和增强肿瘤发生的潜在的EMT(主要是通过感应64年]。lncRNA-HEIH表达式在血清和液也与丙肝肝细胞癌患者的显著增加,表明这个信号在HCC进展的积极作用12]。虽然针对大鹏和lncRNAs可能是一个有前途的针对肝癌治疗的新方法,和其他癌症,许多难题有待解决前临床试验。针对大鹏和lncRNAs不仅可以杀死通过抑制肝癌细胞也杀死正常细胞的基本信号通路由这些大鹏和lncRNAs。因此,准确理解大鹏展翅的属性和lncRNAs肝癌微环境会帮助这些RNA分子的选择性针对肝癌的治疗将是一个有前途的方法。

尽管他们恢复肝脏内稳态的能力通过肝细胞的修复和再生及其成功的使用作为一个潜在的治疗方法不同在体外和在活的有机体内肝癌模型,MSC-exosome-mediated治疗面临一些障碍。实际限制大规模MSC-exosome生产和为他们隔绝MSC媒体没有修改他们的货物是最常见的障碍之一。外来体非均质性(类似于异质性的来源,msc)是另一个障碍可能会导致不同的行为在他们的受体细胞。因此,在应用exosome-mediated治疗患者中,有效的方法,使MSC-derived液囊需要发达的同质性。一般来说,使用MSCs-exosomes小心肝癌治疗应该执行在肿瘤发展,因为他们的作用尚未完全阐明。识别潜在的机制参与MSC-derived液囊的调制是关键在肿瘤发展来确定其实际作用和指导人员的发展有效的治疗通过精确的修改。

5。结论

获得的数据表明,二者,MSCs-exosomes显著诱导和抑制,肿瘤分别开发和进展在活的有机体内。我们所知,这是第一个研究报告的影响CSCs-exosomes和MSCs-exosomes鼠长期穴引起的肝癌模型。exosome-mediated二者之间的交互/ msc和肿瘤细胞可能调节信号通路与细胞凋亡有关,肿瘤细胞转移和血管生成。虽然我们的研究结果提供有价值的洞察二者的影响,MSCs-exosomes肿瘤的生长和发展在活的有机体内需要进一步的调查,阐明肿瘤微环境中的不同液如何反应,以及如何可以可靠地有针对性的肝癌患者。

缩写

广告:	脂肪
BM:	骨髓
二者:	癌症干细胞
窝:	Diethylnitrosamine
例:	外来体
肝细胞癌:	肝细胞癌
lncRNA:	长非编码RNA
米尔:	微RNA
msc:	间充质干细胞。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

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