间充质间质细胞支持子宫内膜异位间质细胞体外

摘要

子宫内膜异位症是一种以子宫内膜细胞异位生长为特征的炎症性疾病。间充质间质细胞(MSC)具有免疫抑制特性，已被认为是一种治疗炎症性疾病的方法。因此，本文的目的是研究异体间充质干细胞对子宫内膜异位症来源的细胞的影响在体外作为一种潜在的治疗子宫内膜异位症的药物。异体脂肪组织间充质干细胞(Ad-MSC)和子宫内膜间充质细胞(ESC)_endo.)和子宫内膜异位症性卵巢囊肿(ESC_囊肿）来自分离子宫内膜异位症的女性。AD-MSC对ESC的影响_endo.和ESC_囊肿被调查了在体外增殖，凋亡，粘附，管形成，迁移和侵袭测定。与未处理的对照相比，Ad-MSC显着增加了ESC的增殖。此外，AD-MSC显着降低了凋亡和ESC的增加。AD-MSC对ESC的粘附显着增加_endo.而不是Esc._囊肿在纤连蛋白。来自Ad-MSC和ESC的共培养物的条件介质显着增加了Matrigel上的人脐静脉内皮细胞的管形成。AD-MSC可能会显着增加ESC的迁移_囊肿并且没有增加两种细胞类型的入侵。这些数据表明，异体Ad-MSC不应该被认为是一种潜在的子宫内膜异位症治疗方法，因为它们可能通过维持和增加异位子宫内膜组织的生长来支持病理。

1.介绍

子宫内膜异位症会影响大约10％的生殖年龄的妇女，标有异常生长的子宫内膜细胞，并且表现出增加局部炎症，导致慢性骨盆疼痛和不孕症[1］．尽管医疗和手术治疗减少炎症并除去异位病变，复发或治疗抵抗非常常见[2］．因此，迫切需要对子宫内膜异位症的新疗法。

尽管有活跃的研究，子宫内膜异位症的发病机理仍然很目不是不清楚的。最常见的理论是，子宫内膜异位症在月经期间从月经碎片的回流进入盆腔，然后植入导致子宫内膜异位症[3.］．虽然几乎所有女性都表现出逆行月经，但只有大约10％的发展内膜异位症[4.］．必须通过在疾病发展中发挥作用的其他因素来解释这一难题[3.那4.］．例如，子宫内膜异位症女性的子宫内膜对细胞凋亡表现出抗性，随后细胞增殖、迁移、粘附和盆腔间皮内层的侵袭增加，诱导血管生成导致子宫内膜异位症的能力增强[5.］．

间充质基质细胞的免疫抑制性质，也称为间充质干细胞（MSC），使其对炎症和自身免疫疾病的潜在治疗，例如移植物与宿主疾病（GVHD），多发性硬化症（MS）和CroHN病[6.］．有人认为，MSC的免疫抑制特性是由于它们能够感知微环境中炎症水平的变化并做出相应的反应[7.］．因此，MSC可能是一种潜在的治疗子宫内膜异位症炎症成分的方法。更具体地说，此前已有报道称，来自脂肪组织的异基因间充质干细胞(Ad-MSC)具有免疫抑制特性，有可能治疗GvHD和MS等炎症性疾病[8.那9.］．以前，已发现自体MSC通过子宫内膜异位症的病理改变[10.］．此外，我们发现来自异位的MSC（ESC_囊肿）子宫内膜是从eutopic（Esc）的MSC功能和功能差异的_endo.）患有子宫内膜异位症的女性的子宫内膜，表明自体MSC可以通过病理改变[11.］．因此，在本研究中，我们旨在探讨同种异体Ad-MSC对子宫内膜异位症衍生细胞的影响在体外作为发展内膜异位症潜在治疗的长期目标的第一步．AD-MSC对ESC的影响_囊肿和ESC_endo.通过增殖、凋亡、粘附、管形成(在体外血管生成)，迁移和侵袭试验，这些参数在子宫内膜异位症中被扰乱。发现同种异体Ad-MSC可促进ESC_囊肿扩散，生存和移民和支持ESC_囊肿促进人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的管形成，但不影响ESC的粘附或侵袭_囊肿在体外．这些数据表明，异体Ad-MSC不应该被认为是一种潜在的子宫内膜异位症治疗方法，因为它们可能通过维持和增加异位子宫内膜组织的生长来支持病理。此外，由于美国证实的子宫内膜异位症的异位病变存在，因此[11.] 和别的 [12.[这表明MSC可能参与子宫内膜异位症的发病机制。

2。材料和方法

2.1。人体组织样本

本研究的纳入标准是患有子宫内膜异位症的患者的女性，该子宫内膜异位症在接受腹腔镜手术前3至六个月没有经历荷尔蒙治疗，以确认诊断和治疗。收集三种类型的组织：（i）子宫内膜膜卵巢囊肿（异位子宫内膜）和（II）子宫内膜（副腔内剂），其既来自患有子宫内膜异位症的妇女，他们都接受了外科患者卵巢囊肿，（III）脂肪组织来自健康女性在期间接受选修剖面部分。子宫内膜炎卵巢囊肿和子宫内膜从31至42岁的女性中收集（36.3±5.8岁（平均值±SD）， )进行腹腔镜手术以确认或治疗子宫内膜异位症。所有的妇女病理证实有子宫内膜异位症。只有一名女性接受了激素治疗。此外，两例活检为增生期，一例未知，一例为闭经。脂肪组织收集于年龄34 - 39岁的女性(36.5±3.54岁(平均±SD)， )．知识的口头和书面同意是从每个参与者获得的，并从斯德哥尔摩区域道德审查委员会获得道德批准（2013/1094-31 / 2,2017 / 1017-32）。

２.２.异位和异位子宫内膜间质细胞的分离

人类子宫内膜异位卵巢囊肿组织被消化和单个细胞悬液使用1毫克/毫升胶原酶I型(σ,密苏里州,美国)稀释在汉克的平衡盐溶液(生活技术,佩斯利,英国)异位组织(90分钟和30分钟的子宫内膜组织)在37°C用颤抖的每10分钟。组织消化液经过两次至100次的过滤μ.m细胞过滤器(Corning, New York, United States)，最终基质细胞通过40μ.M细胞过滤器（康宁），具有未消化的组织和上皮细胞在每个步骤中除去。通过以500×g离心10分钟，用磷酸盐缓冲的盐水（PBS）（PBS）（Life Technologies）洗涤细胞悬浮液。最后，将细胞沉淀重悬于含有Dulbecco改性基本培养基低葡萄糖（DMEM-LG）（Life Technologies）+ 10％MSC认证的胎牛血清（FCS）（Life Technologies）+ 1％抗生素和抗肿瘤（Life技术）。在1％eosin（Merck Kgaa，Darmstadt，德国）中计数活细胞，并在4000个细胞/厘米处培养²在37°C, 5% CO的组织培养瓶中₂．两天后，将生长培养基发生变化，然后每三到四天进行一次。当细胞达到70-90％的汇合时，它们使用0.05％胰蛋白酶/ EDTA（寿命技术）进行胰蛋白酶，并如上所述培养。在通过2，在完全生长培养基中，在10％二甲基亚砜（DMSO）（Sigma）中冷冻保存基质细胞。流式细胞术显示它们对于基质标记物为阳性，例如CD73，CD90和CD105（未示出的数据）。确保我们正在使用纯净的细胞，ESC_endo.和ESC_囊肿在段落中使用了三到六个，因为早期的通道可能被其他细胞类型污染。

２.３.脂肪组织中异体Ad-MSC的分离

人体脂肪组织取自健康孕妇的选择性剖腹产手术。组织按上述方法消化，但需60分钟。组织消化液于500 ×g 4°C离心10分钟。离心后，小心地除去上层脂肪和中层血液，所得到的细胞颗粒如上所述重新悬浮在完全生长培养基中。基质细胞按上述方法培养和低温保存。流式细胞术检测这些Ad-MSC的CD73、CD90、CD105、HLA I和II类、CD14、CD45和CD31;菌落形成单位成纤维细胞的菌落形成;和向成骨和成脂间充质系分化的实验发现是MSC [13.］．为了确保我们正在使用纯细胞群体，AD-MSC在段落中使用三到六个，因为早期通道可能被其他细胞类型污染。

2.4。细胞共养设置

针对ESC的效果调查了AD-MSC_endo.和ECS_囊肿使用细胞增殖，细胞凋亡，粘附，迁移和侵袭测定。基于优化实验，AD-MSC与ESC的比率_endo.和ESC_囊肿选择进行transwell和直接细胞共培养实验(数据未显示);所使用的细胞数量被优化为在插入的最佳容量内(一个插入可以容纳1.12 × 10^5.电池)和底部孔(一个孔可以容纳3.8 × 10^5.根据康宁。研究中使用的不同细胞共培养系统如图所示1；每个细胞共培养系统模拟MSC可能造成的影响体内，因此，它们都是具有代表性的，因此对提供MSC潜在影响的整体图景至关重要。

在伊红排除试验中，采用非引物Ad-MSC和干扰素γ (IFN-)引物Ad-MSCγ.）（100 u / ml，sigma）或ifn-γ.（100u / ml）+肿瘤坏死因子α（tnf-α.）（10 ng / ml，Peprotech，伦敦，英国）及其调理培养基。可以使用促炎细胞因子如IFN -γ.和肿瘤坏死因子-α.，使它们更加免疫抑制和分泌更多的免疫抑制因子，这意味着它们可能对具有炎症基础的疾病（如子宫内膜异位症）更具治疗有效[14.那15.］．因此，我们检查了灌注AD-MSC变得更加免疫抑制，这将产生与未经预先的MSC不同的效果。对于羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE），MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑鎓溴化物），凋亡，粘附，管形成，迁移和侵袭测定，只有未提升的广告 -使用MSC。这是因为Primed Ad-MSC对ESC的增殖没有影响_endo.和ESC_囊肿与未提升的AD-MSC相比。

使用以下细胞共培养设置，对每个测定的微小修改。当Ad-MSC为约70％汇合时，除去生长培养基，用PBS和生长培养基洗涤细胞两次，或用IFN-生长培养基γ.，或含有IFN-的生长培养基γ. + TNF-α.添加。三天后，收集条件培养基，收获的Ad-MSC，并以20Gy照射以抑制其增殖。将条件培养基以500×g离心10分钟以除去细胞碎片，等分，并在-80℃下冷冻。退出_endo.和ESC_囊肿收获并在6000个细胞/厘米处加入12孔板²．将等量辐照的Ad-MSC添加到transwell插入物中，剂量为0.4μ.m孔径(康宁)，用ESC置于井中_endo.或者_囊肿用于直接细胞共培育。还使用来自AD-MSC的条件培养基，并且未经治疗的ESC_endo.或者_囊肿用作对照。在细胞培养3天后，增殖，凋亡，粘附，迁移或ESC的入侵_endo.和ESC_囊肿量化如下所述。

2.5。细胞增殖测定

用三种不同的方法测量细胞增殖，以确认数据:人工伊红排除法、CFSE法和MTT法。在伊红排除试验中，使用1%伊红计数总细胞数。

对于CFSE测定，ESC_endo.和ESC_囊肿用1染色μ.M CFSE (Life Technologies)， 37°C, 5% CO, 10分钟₂如前所述[16.，然后加入12孔的培养皿中。细胞用5 mL完全培养基在37°C和5% CO下孵育10分钟₂淬灭反应并除去剩余的自由染料。将细胞洗涤三次，重悬于完全生长培养基中，并在37℃下保持10分钟，5％CO₂允许CFSE污渍进行醋酸水解。在第0天，CFSE染色的ESC_endo.和ESC_囊肿用于在BD FacScalibur（Becton-Dickinson，New Jersey，United States）的电压设置电压，以确保细胞位于CFSE直方图的最远右侧。在细胞培养3天后，ESC_endo.和ESC_囊肿在BD FACSCalibur上采集并分析。如前面所述，使用FlowJo软件(Tree Star version 10.1r5 Inc, Ashland, usa)使用中值荧光强度(MFI)分析数据，较低的MFI代表较高的细胞增殖和CFSE染料的稀释[17.］．对于直接细胞共培养，门控仅在CFSE阳性ESC上_endo.和ESC_囊肿．结果显示相对于未处理的对照（仅限ESC）。

对于MTT测定，在细胞培养3天后，除去生长培养基，以500×g离心10分钟，以除去细胞碎片，等分，并在-80℃下冷冻，以便在管形成测定中使用（见下文）。然后，Esc._endo.和ESC_囊肿用0.5mg / ml MTT试剂（Life Technologies）染色4小时，在37°C下有5％CO₂．然后，去除MTT试剂，将MTT晶体溶于二甲基亚砜(DMSO)中，并在5% CO的条件下保持37℃₂10分钟。然后，使用无限F200 Pro Tecan分光光度计（Tecan，Mannedorf，瑞士）在540nm下测量吸光度，DMSO用作空白。单独培养的照射Ad-MSC的吸光度从直接细胞共培养孔的吸光度减去，以解释ESC的吸光度_endo.和ESC_囊肿只要。

2.6。吞咽v测定凋亡分析

如前所述，使用附睾v测定分析细胞凋亡[18.), ESC的_endo.和ESC_囊肿，如上所述用CFSE染色，然后将它们加入到12孔板之前并用辐照的Ad-MSC培养。在细胞培养3天后，ESC_endo.和ESC_囊肿被收获并重新悬浮在100 μ.L annexin V结合缓冲液(10 mM的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(Life technologies) + 140 mM的氯化钠(Sigma) + 2.5 mM的氯化钙(Sigma))。然后，用annexin V PE抗体(BioLegend, California, usa)和7-AAD (BD Biosciences, Stockholm, Sweden)在室温(RT)黑暗中染色15分钟。然后,400年μ.L annexin V结合缓冲液加入并在BD LSR Fortessa（Becton-Dickinson）上分析CFSE阳性细胞。对于直接细胞共培养，门控仅在CFSE阳性ESC上_endo.和ESC_囊肿．使用FlowJo软件对数据进行分析。

2.7。细胞粘附试验

组织培养处理后的48孔板(Corning)用10μ.g/mL人纤连蛋白(BD Biosciences)，细胞粘附试验如前所述[19.］．剩余的位点在室温下用0.1％牛血清白蛋白（Sigma）封闭2小时，用PBS洗涤一次。将48孔板干燥并用Parabilm包裹并在4℃下储存直至用于电池粘附测定。

如上所述3天的细胞培养后，ESC_endo.和ESC_囊肿被收割和计数。将纤连蛋白涂覆的平板置于室温下至少10分钟。退出_endo.和ESC_囊肿重新悬浮在无血清DMDM-LG培养基中，并在21000个细胞/厘米上播种²．在37℃下进行2小时的细胞粘附，5％CO₂，将培养基轻轻除去，用含有2mM氯化钙和2mM氯化镁的PBS洗涤孔。使用如上所述的MTT测定量定量剩余的粘附细胞。

2.8。管形成分析

试管形成试验如前所述进行[20.］．Huvec恳请Nina博士（Karolinska Institutet）提供。他们被隔离（ )，如前所述[21]并在含有人内皮无血清基础（Fisher Scientific，瑞典Fishercipic，瑞典）+ 10％FCS（Life Technologies）+ 1％青霉素和链霉素（生命技术）。它们被用于两到五个段落的实验。对于管形成测定，将所有移液管和板在-20℃下加工。matrigel（康宁）在4℃下在冰上解冻过夜，等分为50 μ.在96孔板中每孔L，并保持在37°C和5% CO₂为matrigel到凝胶的1小时。如上所述，收获HUVEC并与曙红计数，然后20×10^3.重悬在50%完整的HUVEC培养基中+ 50%从MTT试验收集的条件培养基中(见上文)，并轻轻添加到基质上。细胞保持在37°C, 5% CO₂17-18小时后，使用奥林巴斯CKX41倒置显微镜(奥林巴斯，东京，日本)对它们进行观察，并在4倍放大的条件下拍摄图像，在96孔板中捕获整个孔。如前所述，使用ImageJ (Version 1.48, National Institutes of Health, Bethesda, United States)上的血管生成分析仪插件对每口井形成的导管数量进行量化[22］．

2.9。细胞迁移测定

transwell细胞迁移试验如前所述进行[23］．如上所述3天的细胞培养后，ESC_endo.和ESC_囊肿被收割和计数。退出_endo.和ESC_囊肿在25 × 10^3.每个Transwell插入（8 μ.m孔径，康宁)在24孔板无血清dmemg - lg生长培养基中，并允许在37°C、5% CO的dmemg - lg生长培养基中向10% FCS迁移₂．阴性对照为未处理的ESC_endo.和ESC_囊肿．20小时后，使用湿棉拭子除去插入物顶部的非侵略性细胞，用PBS洗涤的插入物，并用冰冷甲醇固定的细胞5分钟。再次用PBS洗涤插入物，然后用1％曙红染色1小时。最后，将插入物洗涤，在MilliQ水中洗涤，并在10倍放大率下捕获迁移细胞的每个插入物的5个随机场。使用imagej分析迁移的小区数并计算。

2.10。细胞入侵检测

transwell细胞侵袭试验如前所述进行[23］．如上所述3天的细胞培养后，ESC_endo.和ESC_囊肿被收割和计数。同一天，transwell插入(8μ.孔径在孔径中，康宁）拟合24孔板涂有0.1mg / ml matrigel 2小时。退出_endo.和ESC_囊肿在25 × 10^3.每插入无血清DMEM-LG生长培养基，置于24孔板中，并在37℃下在DMEM-LG生长培养基中迁移到10％FCS中，在37℃下均为5％CO₂．阴性对照为未处理的ESC_endo.或者_囊肿．20小时后，如上所述染色并定量侵袭细胞，用于迁移测定。

2.11。统计分析

所有统计分析均使用GraphPad 6棱镜进行。当数据是正态分布时，用Student的数据进行分析T.- 最低，并且当它通常不分布时，使用Mann-Whitney测试分析了中位数。所有值显示为平均值±标准偏差（SD）。对于研究，N指生物复制的数量。结果被认为具有统计学意义，如果 ．

结果

3.1。AD-MSC增加基质细胞的增殖

为了研究Ad-MSC对基质细胞增殖的影响，可直接或在Transwell系统中与Esc一起与Ad-MSC的影响（用IFN引用或未预付）γ.或ifn-γ. + TNF-α.)。采用人工细胞计数、CFSE和MTT法检测细胞增殖。

手动细胞计数表明，来自AD-MSC的未预期和底漆的条件培养基显着增加了增殖（ ）对于Esc._endo.和ESC_囊肿与未经处理的对照组相比(图2（a）)．此外，CFSE和MTT测定还表明，来自未经预期的Ad-MSC的条件培养基显着增加了增殖（ ）对于Esc._endo.和ESC_囊肿与未经处理的对照组相比(图2（b）和2（c）)．但是，在Transwell系统中，对ESC的增殖没有影响_endo.和ESC_囊肿使用手动单元计数，CFSE或MTT测定（图2)．通过CFSE测定来测量，直接细胞共培养物显着降低增殖（ ）对于Esc._endo.但对ESC无影响_囊肿（数字2（b）)．相反，使用MTT测定，直接细胞共培养系统显着（ ）减少了ESC的扩散_囊肿但对ESC无影响_endo.（数字2（c）)．用proinflamatory细胞因子IFN引发Ad-MSCγ.和肿瘤坏死因子-α.与未预期的Ad-MSC相比，细胞增殖没有差异，因此，在其余的研究中停止了灌注。在一起，结果表明，来自Ad-MSC的调节培养基增加了Esc的增殖，Transwell系统对ESC的增殖没有影响。直接细胞共培养的效果更加模糊。

3.2。AD-MSC增加了基质细胞的存活

探讨Ad-MSC对ESC细胞存活和凋亡的影响_endo.和ESC_囊肿，使用使用流式细胞术的膜蛋白V测定法。Transwell系统，调节培养基和直接细胞共培养显着（ ）减少凋亡，增加了esc的生存_endo.和ESC_囊肿与未经处理的对照组相比(图3.)．

3.3。AD-MSC没有增加ESC附着力_囊肿

研究Ad-MSC对ESC粘附的影响_endo.和ESC_囊肿，采用纤维连接蛋白粘附试验。transwell系统显著提高了粘结力( ）对于Esc._endo.但对ESC无影响_囊肿与未经处理的对照组相比(图4(一))．相比之下，调节介质系统显着降低了粘附性（ ）对于Esc._囊肿但对ESC无影响_endo.与未经处理的对照组相比(图4（b）)．因此，可以得出结论，ESC的粘附性_囊肿Ad-MSC治疗后无增加。此外，虽然条件培养基降低了ESC的粘附性_囊肿，Transwell系统保持了ESC的粘附性_囊肿，这并不支持我们的假设，即Ad-MSC可能对子宫内膜异位症有用。

3.4。AD-MSC增加管形成

为了评价Ad-MSC对HUVEC成管的影响，从Ad-MSC/ESC中收集条件培养基的效果_endo.和ad-msc / esc_囊肿研究了HUVEC管形成的共养。来自所有三种系统的条件培养基诱导了重要的（ ）与ESC的未经处理的对照相比，管形成增加_endo.和ESC_囊肿，分别（图5（a）)．这表明来自AD-MSC和ESC的共培养物的调节培养基可以支持HUVEC的管形成在体外．

3.5。AD-MSC可以促进ESC的迁移_囊肿

为了调查ESC的迁徙活动，他们被允许通过8迁移到10％的FCS μ.M孔过滤器在用条件介质或具有AD-MSC的Transwell系统处理后。Transwell系统增加了Esc_囊肿迁移明显( ）但对ESC没有影响_endo.与未经处理的对照组相比(图6（a）， 一世）。此外，条件介质系统减少了eSC的迁移_endo.和ESC_囊肿显著( ）与未经处理的对照（图6（a）， ii). Ad-MSC对ESC的影响结果_囊肿迁移是冲突的;但是，可以得出结论，ad-msc可以促进ESC的迁移_囊肿．

3.6。AD-MSC没有增加ESC的入侵_endo.和ESC_囊肿

确定ESC的侵入能力_endo.和ESC_囊肿，使用Matrigel Transwell测定分析侵袭。Transwell系统对ESC的侵入能力没有影响_endo.和ESC_囊肿与未经处理的对照组相比(图7(一)与此相反，条件培养基减少了两种ESC的侵袭_endo.和ESC_囊肿显著( ）与未经处理的对照（图7(一)，ii）。因此，可以得出结论，侵犯ESC_endo.和ESC_囊肿Ad-MSC治疗后无增加。此外，虽然条件介质减少了ESC的入侵_endo.和ESC_囊肿， transwell系统维持了两种细胞类型的侵袭，这并不支持Ad-MSC可能对子宫内膜异位症的治疗有用的假设。

4。讨论

在这项研究中，我们表明同种异体的AD-MSC可能会促进ESC_囊肿增殖、存活和迁移，可能支持ESC_囊肿增加HUVEC的管形成，但不增加ESC的粘附和侵袭_囊肿在体外．AD-MSC对ESC的影响_囊肿这里显示的表明，它们不应被视为子宫内膜异位症的潜在治疗，因为它们可以通过维持和增加异位子宫内膜组织的生长来支持子宫内膜异位症的病理学。此外，由于美国证实的子宫内膜异位症的异位病变存在，因此[11.] 和别的 [12.[这表明MSC可能参与子宫内膜异位症的发病机制。

李等人．研究了MSC条件培养基对ESC的影响_endo.和ESC_囊肿，并类似于我们的数据，他们发现MSC引起了ESC增殖的显着增加[24］．此外，沃顿果冻分离的MSC诱导ESC显著增加_endo.transwell系统中的增殖[25］．相比之下，徐等人。据报道，脐带-MSC（UC-MSC）显着减少了ESC的增殖_囊肿[26］．这些研究之间的差异可能是因为间充质干细胞的不同组织来源，这一点以前已经描述过[27］．在扩散方面没有其他研究审查MSC对ESC的影响。然而，先前已经显示了MSC通过释放细胞因子来增加其他细胞类型的细胞增殖，并且生长因子[28-30.］．在我们的研究中，条件培养基显著地诱导了两种ESC的增殖_endo.和ESC_囊肿．相比之下，Transwell系统对ESC的增殖没有影响_endo.和ESC_囊肿．在Transwell系统中，ESC和AD-MSC之间存在旁静脉效应;AD-MSC可以通过ESC分泌的因素调节，随后阻碍其对ESC的生长促进作用。旁静脉信号传导是通过分泌到细胞外环境中的旁静脉因子（例如细胞因子，激素和微膜）的局部细胞到细胞通信[31］．这种反馈效应在条件培养基中是不存在的，条件培养基中含有未调制Ad-MSC分泌的因子。这可能解释了本研究中来自transwell和条件培养基系统的不同结果。此外，条件培养基效应不太可能是非特异性的;相反，它很可能是针对Ad-MSC的，因为条件培养基的效果与未处理的对照组不同。直接细胞共培养体系对ESC细胞增殖无影响，或使其增殖明显下降_endo.和ESC_囊肿．细胞增殖减少可能与间充质干细胞直接接触抑制生长有关。如前所述，MSC介导了它们对细胞增殖的最大抑制作用在体外通过直接接触与Transwell系统相比[32］．

在本研究中，AD-MSC显着降低了凋亡，并增加了ESC的存活率_endo.和ESC_囊肿，这是与其他细胞类型的研究保持[33-35］．这些结果表明，AD-MSC可能会降低细胞凋亡，增加ESC的存活_endo.和ESC_囊肿，可能支持子宫内膜异位症。而UC-MSC则可诱导ESC细胞凋亡_囊肿在Transwell系统中，通过涉及Tensin同源基因（PTEN）的机制，子宫内膜组织中的重要内政基因[26］．这种差异对我们的研究可能是由于使用不同的MSC来源[27］．

细胞粘附在子宫内膜异位症的发育中至关重要，以允许子宫内膜组织在逆行月经之后将子宫内膜组织在盆腔中的间皮衬里上。发现通过Transwell系统处理导致ESC粘附的显着增加_endo.，但它对Esc的粘附没有影响_囊肿．条件培养基使ESC粘附性显著降低_囊肿，但它对Esc的粘附没有影响_endo.．这些结果可以根据细胞增殖的结果来理解，因为众所周知，分裂迅速的细胞可能粘附性较差[36］．此外，这一结果可以用transwell和条件介质系统的差异来解释;在transwell系统中有旁分泌效应，这在上述条件培养基中是没有的。据我们所知，文献中没有其他研究探讨MSC对ESC粘附的影响_endo.和ESC_囊肿．

管形成分析通常用于量化各种处理对HUVEC在凝胶膜基质上形成管的能力的影响在体外血管生成模型[20.］．Ad-MSC/ESC培养液_endo.和ad-msc / esc_囊肿与未处理对照相比，细胞共培养显著诱导HUVEC的管形成。目前还没有对msc处理的ESC结果进行研究_endo.和ESC_囊肿论HUVEC管形成。我们的结果符合以前的报道，表明MSC能够增加管形成[37-39］．

Transwell系统显着增加了Esc的迁移_囊肿与未经治疗的对照相比，但对ESC没有影响_endo.．此外，transwell系统对两种细胞类型的侵袭均无影响。同时，条件培养基系统显著降低了两种ESC的迁移和侵袭_endo.和ESC_囊肿．迁移和侵袭需要最初的细胞粘附，因此，这些结果与细胞粘附数据一致，可能可以用transwell和条件培养基系统之间的差异来解释[40］．Transwell系统具有在调节介质中不存在的旁静脉效果，如上所述。以前只研究了MSC条件介质对ESC迁移和入侵的影响_endo.和ESC_囊肿[24］．与我们的结果相反，他们发现两种细胞类型的迁移和侵袭都比未处理的对照组显著增加[24］．同样，这种差异可以用MSC的不同来源来解释[27］．他们的研究使用了MSC与子宫内膜异常卵巢囊肿和子宫内膜异位症的子宫内膜分离，我们使用了同种异体AD-MSC [24］．

供体数量有限和供体激素状况不影响数据的一致性在体外细胞实验。观察到有统计学意义的结果，仍然可以得出有意义的结论。此外，其他研究也使用了类似数量的患者[10.那41］．此外，使用从孕妇的脂肪组织中分离的AD-MSC可能不是最佳的;然而，先前已经表明怀孕对孤立的AD-MSC的性质没有不利影响[42］．然而，必须记住，这是一个在体外学习，额外的在体外和体内需要研究来验证目前研究的结果。本研究表明，同种异体ad-MSC不应用作子宫内膜异位症的潜在疗法，因为它们可以通过维持和增加异位子宫内膜组织的生长来支持子宫内膜异位症的病理学。此外，由于MSC存在于子宫内膜异位症中的异位病变中，因此它们可能参与子宫内膜异位症的发病机制。这是最广泛的在体外研究表明，这可能是正确的，并将对进一步了解子宫内膜异位症的发病机制，以MSC为靶点寻找新的治疗方法具有重要意义。

结论

总之，Ad-MSC不应被认为是子宫内膜异位症合并子宫内膜异位症卵巢囊肿的潜在治疗方法，因为它们可能促进ESC的增殖、生存和迁移_囊肿并支持Esc._囊肿促进内皮细胞新生，使病理恶化。然而，需要进一步研究MSC的其他来源，以确定MSC是否确实是一种无效的子宫内膜异位症治疗。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

Fawaz Abomaray、Sebastian Gidlöf和Cecilia Götherström对论文的想法和设计做出了贡献。Fawaz Abomaray对数据采集做出了贡献。Fawaz Abomaray、Sebastian Gidlöf和Cecilia Götherström对数据分析和解释做出了贡献。Fawaz Abomaray进行了实验室分析。法瓦兹·阿波马雷、塞巴斯蒂安·Gidlöf和塞西莉亚·Götherström撰写了这篇论文，并进行了批判性的修改。Fawaz Abomaray、Sebastian Gidlöf、Bartosz Bezubik、Mikael Engman和Cecilia Götherström校对了手稿。所有作者阅读并批准了最终论文。

致谢

作者感谢Karolinska大学医院女子诊所的员工和患者，以获得和捐赠脂肪，子宫内膜和子宫内膜癌卵巢囊肿组织。本研究得到了Abdulla国王国际医学研究中心，斯德哥尔摩委员会和Karolinska Institutet的支持。

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