研究入选标准是女性生育年龄的女性患有子宫内膜异位症没有接受激素治疗三到六个月前接受腹腔镜手术证实的诊断和治疗。三种类型的组织收集:(i)异位卵巢囊肿(异位子宫内膜)和(2)子宫内膜(内膜),这都是来自女性的子宫内膜异位症异位卵巢囊肿切除手术,和(3)脂肪组织在健康女性择期剖腹产。异位卵巢囊肿和子宫内膜收集从31日至42岁女性(36.3±5.8年(平均±标准差), n = 4 进行腹腔镜手术的)确认或治疗子宫内膜异位。所有女性被组织学证实子宫内膜异位病理学家。只有一个女人接受激素治疗。此外,两个活检的增殖阶段,一个是未知的,和一个有闭经。脂肪组织是来自34岁到39岁女性(36.5±3.54年(平均±标准差), n = 2 )。通知从每个参与者获得了口头和书面同意,和伦理批准了在斯德哥尔摩地区伦理审查委员会(2013/1094-31/2 2017/1017-32)。

人类子宫内膜异位卵巢囊肿组织被消化和单个细胞悬液使用1毫克/毫升胶原酶I型(σ,密苏里州,美国)稀释在汉克的平衡盐溶液(生活技术,佩斯利,英国)异位组织(90分钟和30分钟的子宫内膜组织)在37°C用颤抖的每10分钟。组织消化被过滤到100年的两倍 μm细胞过滤器(康宁,纽约,美国),最终,基质细胞是透过一个40 μm细胞过滤器(康宁),未消化的组织和上皮细胞被删除的每个步骤。细胞悬液是洗两次磷酸盐(PBS)(生命技术)在500×g离心10分钟。最后,细胞颗粒resuspended完全生长介质包含杜尔贝科修改基本介质低葡萄糖(DMEM-LG)(技术)+ 10% MSC认证胎牛血清(FCS)(技术)+ 1%的抗生素和抗真菌的(技术)。可行的细胞数在1%伊红(默克公司,达姆施塔特,德国)和培养在4000个细胞/厘米²在组织培养瓶37°C公司为5%₂。两天之后,生长介质改变,此后每三到四天。confluency当细胞达到70 - 90%,他们用0.05%胰蛋白酶/ trypsinised EDTA(技术)和培养如上所述。在通道2,基质细胞冻存10%二甲亚砜(DMSO)(σ)完成生长介质。流式细胞术显示,基质阳性标记,如CD73 CD90、CD105(数据没有显示)。以确保我们使用纯的细胞,ESC_endo和ESC_囊肿在段落使用三到六,早些时候段落可能感染其他细胞类型。

人类脂肪组织获得健康的孕妇择期剖腹产。组织消化如上所述,但60分钟。组织消化离心机在500 g×10分钟在4°C。离心后,脂肪的表层和中间层的血液很仔细,由此产生的细胞颗粒resuspended完全生长介质如上所述。基质细胞的培养和冻存如上所述。这些Ad-MSC CD73以流式细胞术,CD90、CD105, HLA I和II类,CD14、CD45、CD31;在群集型units-fibroblasts殖民地的形成;和分化化验到成骨的脂肪形成的间叶细胞谱系和被发现是MSC ( 13]。以确保我们使用纯的细胞,Ad-MSC是用于段落三到六,早些时候段落可能感染其他细胞类型。

对ESC Ad-MSC追究他们的影响_endo和ECS_囊肿利用细胞增殖、凋亡、粘附、迁移和入侵检测。基于优化实验1:1的比例Ad-MSC ESC_endo和ESC_囊肿被选为transwell和直接细胞coculture实验(数据未显示);细胞的数量内的优化是使用的最佳能力插入(insert可以容纳1.12×10⁵细胞)和底部井(井可以容纳3.8×10⁵根据康宁细胞)。的不同细胞coculture系统用于研究如图 1;每个细胞coculture系统模拟MSC潜在可能造成的影响 在活的有机体内,因此,他们都是代表,因此有必要提供一个整体的MSC的潜在影响。

曙红排除分析,未灌注的Ad-MSC和干扰素(IFN - Ad-MSC影射 γ)(100 U /毫升,σ)或干扰素- γ(100 U /毫升)+肿瘤坏死因子-α(TNF - α)(10 ng / mL, PeproTech,伦敦,英国)和他们的条件培养基。MSC可以使用促炎细胞因子,如干扰素- γ和肿瘤坏死因子- α,让他们更多的免疫抑制和分泌免疫抑制因素,这意味着他们可能更有效治疗子宫内膜异位等疾病与炎症的基础上( 14, 15]。因此,我们研究了如果启动Ad-MSC更免疫抑制会给未灌注的MSC的效应将是不同的。为carboxyfluorescein succinimidyl酯(CFSE) MTT (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化),细胞凋亡,附着力,管形成,移民,和入侵检测,只有未灌注的Ad-MSC。这是因为影射Ad-MSC没有影响ESC的扩散_endo和ESC_囊肿而空白Ad-MSC的条件。

下面的细胞coculture设置,用细微的修改的化验。Ad-MSC ~ 70%汇合的时,经济增长中被移除,这些细胞被洗两次与PBS和生长介质,或与干扰素-生长介质 γ,或与干扰素-生长介质 γ+肿瘤坏死因子- α是补充道。三天后,条件培养基收集,Ad-MSC收获,辐照在20 Gy抑制其增殖。条件培养基离心机在500 g×10分钟去除细胞碎片,整除,冻结在−80°C。ESC_endo和ESC_囊肿收获和添加到12-well板块在6000细胞/厘米吗²。等量的辐照Ad-MSC加入transwell插入0.4 μ米孔隙大小(康宁)和放置在ESC的井_endo或ESC_囊肿直接细胞coculture。条件培养基从Ad-MSC也使用,未经处理的ESC_endo或ESC_囊肿被用作控制。经过3天的细胞培养、增殖、凋亡、粘附、迁移,或ESC的入侵_endo和ESC_囊肿是量化如下所述。

细胞增殖测定使用三种不同的方法来确认数据:手动曙红排斥、CFSE和MTT检测。曙红排除分析,细胞的总数统计使用1%伊红。

CFSE化验,ESC_endo和ESC_囊肿沾染了1 μM CFSE(生命技术)10分钟37°C公司为5%₂如前所述( 16),之前被添加在12-well盘子上面。5毫升的细胞被孵化完成生长介质10分钟37°C公司为5%₂淬火反应和去除剩余的免费的染料。这些细胞被洗了三次,resuspended完全生长介质,并保持10分钟37°C公司为5%₂允许CFSE染色进行醋酸水解。0天,CFSE-stained ESC_endo和ESC_囊肿用于设置电压在BD FACSCalibur (becton dickinson,新泽西,美国),确保细胞的极右派CFSE直方图。经过3天的细胞培养,ESC_endo和ESC_囊肿BD FACSCalibur被收集和分析。如前所述,数据分析使用平均荧光强度(MFI)软件FlowJo(10.1版本树明星r5 Inc .)、亚什兰,美国),小额信贷机构代表更大的细胞增殖和较低的稀释CFSE染料( 17]。直接细胞coculture门只有CFSE-positive ESC_endo和ESC_囊肿。结果显示相对于未经处理的控制(ESC)。

MTT测定,细胞培养3天之后,经济增长中被离心机在500 g×10分钟去除细胞碎片,整除,冻结在−80°C,供以后使用的管形成试验(见下文)。然后,ESC_endo和ESC_囊肿沾染了0.5毫克/毫升MTT试剂(生命技术)4小时37°C和5%的公司₂。后来,MTT试剂被免职,MTT晶体在二甲基亚砜(DMSO),可溶性和板保持在37°C公司为5%₂10分钟。然后,使用无限的吸光度为540 nm F200 Pro Tecan分光光度计(Tecan、Mannedorf、瑞士),DMSO作为空白。的吸光度辐照Ad-MSC培养就减去直接细胞吸光度的coculture井占ESC的吸光度_endo和ESC_囊肿只有。

膜联蛋白V分析是用来分析细胞凋亡,如前所述[ 18),ESC的_endo和ESC_囊肿,沾CFSE如上所述前添加与辐照Ad-MSC 12-well盘子和培养。经过3天的细胞培养,ESC_endo和ESC_囊肿100年收获和resuspended μL膜联蛋白V绑定缓冲(4 - 10毫米(2-hydroxyethyl) 1-piperazineethanesulfonic酸(技术)+ 140 mM的氯化钠(σ)+ 2.5毫米的氯化钙(σ))。然后,这些细胞被染色膜联蛋白V PE抗体(BioLegend,加利福尼亚,美国)和7-AAD (BD生物科学,斯德哥尔摩,瑞典)在室温下15分钟在黑暗中(RT)。然后,400年 μL膜联蛋白V绑定缓冲了和分析了CFSE阳性细胞在BD LSR Fortessa(正)。直接细胞coculture门只有CFSE-positive ESC_endo和ESC_囊肿。使用软件FlowJo数据进行了分析。

组织culture-treated 48-well板块(康宁)和10在一夜之间由涂层 μg / mL人类纤连蛋白(BD生物科学)在4°C,和细胞粘附试验进行了如前所述[ 19]。其余的网站被封锁与0.1%牛血清白蛋白(σ)2小时在RT和PBS洗一次。48-well板块被干,裹着保鲜膜和储存在4°C到用于细胞粘附试验。

细胞培养3天后如上所述,ESC_endo和ESC_囊肿收获和统计。fibronectin-coated板块被带到RT至少10分钟。ESC_endo和ESC_囊肿在无血清resuspended DMDM-LG介质和播种在21000细胞/厘米吗²。2小时后细胞粘附在37°C公司为5%₂介质被轻轻取出,井用PBS包含2毫米氯化钙和氯化镁2毫米。剩下的贴壁细胞量化使用MTT测定如上所述。

管的形成进行了分析(如前所述 20.]。HUVEC成员去尼娜Heldring博士(卡罗林斯卡医学院)。他们是孤立的( n = 2 )如前所述 21)和扩展0.1%明胶-(柯达)涂层表面完全HUVEC生长介质包含人类内皮细胞无血清基础培养基(费舍尔科学、Goteborg、瑞典)+ 10% FCS(技术)+ 1%青霉素和链霉素(技术)。他们被用于实验在章节2 - 5。管的形成分析,吸管技巧和盘子都prechilled−20°C。基底膜基质(康宁)解冻一夜之间在4°C冰,在50整除 μL / 96 -孔板,并将其保持在37°C公司为5%₂1小时为了人工基底膜凝胶。HUVEC收获和计算与伊红如上所述,然后20×10³在50%完成resuspended HUVEC生长培养基+ 50%从MTT试验收集的条件培养基(见上图),轻轻在基底膜基质。这些细胞被保持在37°C公司为5%₂17 - 18小时,然后他们可视化使用奥林巴斯CKX41倒置显微镜(奥林巴斯、东京、日本),在4 x和图像被放大捕获整个96 -孔板。管形成的数量每口井使用血管生成量化分析仪插件在ImageJ(版本1.48,美国国立卫生研究院的贝塞斯达,美国)如前所述[ 22]。

transwell细胞迁移试验进行了如前所述[ 23]。细胞培养3天后如上所述,ESC_endo和ESC_囊肿收获和统计。ESC_endo和ESC_囊肿被添加在25×10吗³每transwell插入(8 μ米孔径,康宁)血清DMEM-LG生长介质在24-well盘子和被允许迁移对10% FCS DMEM-LG生长介质在37°C公司为5%₂。消极的控制是未经处理的ESC_endo和ESC_囊肿。20小时后,nonmigrated细胞上的插入删除使用湿棉签,插入用PBS和细胞与冰冷的甲醇固定5分钟。PBS的插入又洗,沾1%伊红之前1小时。最后,插入在milliQ洗水和干和5随机迁移细胞被抓获的字段/插入10倍放大。细胞的数量,使用ImageJ迁移进行了分析和计算。

transwell细胞入侵检测进行了如前所述[ 23]。细胞培养3天后如上所述,ESC_endo和ESC_囊肿收获和统计。同日,transwell插入(8 μ米孔径,康宁公司)拟合24-well盘子被涂上一层0.1毫克/毫升基底膜基质两个小时。ESC_endo和ESC_囊肿被添加在25×10吗³采用无血清每插入DMEM-LG生长介质,放在24-well盘子和允许通过基底膜基质入侵对10% FCS DMEM-LG生长介质在37°C公司为5%₂。消极的控制是未经处理的ESC_endo或ESC_囊肿。20小时后,入侵细胞被染色和量化如上所述迁移试验。

所有统计分析使用GraphPad棱镜6。当数据是正态分布的,与学生的手段进行了分析 t以及,当它不是正态分布,分析了中位数Mann-Whitney测试。所有的值显示为均值±标准差(SD)。在这项研究中, n是指生物复制的数量。结果被认为是具有统计学意义 P < 0.05 。

研究Ad-MSC在基质细胞增殖的影响,Ad-MSC与ESC cocultured直接或在transwell系统中,或从Ad-MSC条件培养基的影响(影射或未灌注的干扰素- γ或干扰素- γ+肿瘤坏死因子- α在基质细胞检查。细胞增殖是由手动测量细胞计数,CFSE和MTT检测。

人工细胞计数显示,未灌注的和准备条件培养液Ad-MSC扩散显著增加( P < 0.05 )ESC_endo和ESC_囊肿与未经处理的控制(图 2(一个))。此外,CFSE和MTT分析还显示,从无撇的条件培养基Ad-MSC扩散显著增加( P < 0.05 )ESC_endo和ESC_囊肿与未经处理的控件(数字 2 (b)和 2 (c))。然而,在transwell系统,对ESC的扩散没有影响_endo和ESC_囊肿使用人工细胞计数、CFSE或MTT检测(图 2)。的CFSE检测,直接细胞coculture减少扩散显著( P < 0.05 )ESC_endo但没有影响ESC_囊肿(图 2 (b))。相反,使用MTT测定,直接细胞coculture系统显著( P < 0.05 ESC)减少扩散_囊肿但没有影响ESC_endo(图 2 (c))。与促炎细胞因子启动Ad-MSC干扰素- γ和肿瘤坏死因子- α导致对细胞增殖无撇号Ad-MSC相比没有区别,因此,启动停止了其他的研究。总的来说,结果表明,条件培养基从Ad-MSC增加ESC的扩散,和transwell系统没有影响ESC的扩散。直接的影响细胞coculture更模糊。

检查Ad-MSC对ESC的生存和凋亡的影响_endo和ESC_囊肿使用,膜联蛋白V使用流式细胞仪测定。transwell系统,直接细胞条件培养基,coculture显著( P < 0.05 ESC)减少细胞凋亡和提高生存_endo和ESC_囊肿与未经处理的控制(图 3)。

检查Ad-MSC在ESC的附着力的影响_endo和ESC_囊肿纤连蛋白粘附试验采用。transwell系统附着力显著增加( P < 0.05 )ESC_endo但没有影响ESC_囊肿与未经处理的控制(图 4(一))。相比之下,条件培养液系统附着力显著下降( P < 0.05 )ESC_囊肿但没有影响ESC_endo与未经处理的控制(图 4 (b))。因此,可以得出结论,ESC的附着力_囊肿不是Ad-MSC治疗后增加。此外,尽管条件培养基降低ESC的附着力_囊肿transwell系统维护ESC的附着力_囊肿不支持我们的假设,Ad-MSC可能对子宫内膜异位症治疗有用。

评估HUVEC的Ad-MSC对管形成的影响,从Ad-MSC收集的条件培养基的影响/ ESC_endo和Ad-MSC / ESC_囊肿cocultures HUVEC管形成进行了研究。从所有三个系统条件培养基诱导显著( P < 0.05 )增加管形成ESC比未经处理的控制_endo和ESC_囊肿分别(图 5(一个))。这表明条件培养液源自cocultures Ad-MSC和ESC可以支持管HUVEC的形成 在体外。

调查ESC的迁徙活动,他们被允许迁移至10% FCS通过8 μ米孔隙过滤器处理后条件培养基或与Ad-MSC transwell系统。transwell系统增加了ESC_囊肿迁移明显( P < 0.05 对ESC),但没有影响_endo与未经处理的控制(图 6(一)我)。此外,条件培养液两ESC系统减少了迁移_endo和ESC_囊肿显著( P < 0.05 (图)比未经处理的控制 6(一)ii)。结果的影响Ad-MSC ESC_囊肿迁移是矛盾的;然而,它可能会得出结论,Ad-MSC可以促进迁移的ESC_囊肿。

确定ESC的入侵能力_endo和ESC_囊肿使用人工基底膜,分析了入侵transwell化验。transwell系统对ESC的入侵能力没有影响_endo和ESC_囊肿与未经处理的控制(图 7(一)我)。与此相反,条件培养基降低ESC的入侵_endo和ESC_囊肿显著( P < 0.05 (图)比未经处理的控制 7(一)ii)。因此,可以得出结论,ESC的入侵_endo和ESC_囊肿不是Ad-MSC治疗后增加。此外,尽管条件培养基降低ESC的入侵_endo和ESC_囊肿transwell系统维护的入侵细胞类型,不支持我们的假设Ad-MSC可能对子宫内膜异位症治疗有用。