比较人类尿液的增殖和分化潜能,胎盘蜕膜和骨骨髓来源干细胞

文摘

人力多功能干细胞疗法显示非凡的潜力在再生医学和组织工程应用中由于自己的能力的自我更新和分化成多个成熟细胞类型在适当的条件下。目前,人类多能干细胞可以从不同来源分离,但变化在他们的基本生物学可能导致次优的选择种子细胞在临床前和临床研究。因此,本研究的目的是比较多能干细胞的生物学特性与人类骨髓,胎盘蜕膜,分别和尿液。首先,我们发现urine-derived干细胞(usc)显示不同的形态与其他类型的干细胞。南加州大学和胎盘蜕膜basalis-derived间充质干细胞(PDB-MSCs)优越的增殖能力与骨骨髓来源间充质干细胞(bmsc);这些细胞增长最高的克隆形成单位(CFU)计数。使用流式细胞仪在表型分析,相似性在所有干细胞标记表达式被发现,扣除CD29和CD105。关于干细胞分化能力,南加州大学被观察到有更好的脂肪形成的和内皮功能以及血管化潜在的bmsc和PDB-MSCs相比。至于成骨和chondrogenic感应,bmsc优于所有三种类型的干细胞。未来的治疗适应症和临床应用的bmsc, PDB-MSCs,和南加州大学应该根据他们的特点,如生长动力学和分化能力。

1。介绍

多功能干细胞(msc)是细胞与广泛的生物功能有一个独特的自我更新能力和显示广泛的multipotential分化成许多不同类型的细胞(1,2),如成骨、脂肪形成的,chondrogenic和内皮血统。有很多优势的潜在使用msc。近年来,临床前和临床研究证明msc对血管化的治疗潜力3)和受损组织的再生,如骨,软骨,心肌,肌腱(4- - - - - -8]。此外,msc也显示相当大的潜在治疗各种疾病如自身免疫性疾病、造血缺陷,和生育保护(9- - - - - -12]。目前,多功能干细胞很容易分离骨髓,外周血、皮肤、脂肪组织,尿液和胎盘(4,13- - - - - -16]。

骨髓是最常见的多功能干细胞来源。多功能干细胞以来第一次可以从骨髓中分离,人类干细胞研究发展迅速。例如,骨骨髓来源间充质干细胞(bmsc)应用于软骨修复(5,17,18),椎间盘修复(19),和骨修复20.在临床实践中。然而,伴着被入侵收获过程需要限制,这限制了他们的使用自体方法和可能导致施主能级发病率(21,22]。由于这些原因,msc的替代来源进行了研究。

胎盘是一个msc的替代来源。胎盘蜕膜basalis-derived间充质干细胞(PDB-MSCs)已经引起了极大的兴趣在再生医学和组织工程因为收获没有侵入性程序和使用没有道德问题(23]。发表的一些研究已经证明,PDB-MSCs拥有广泛的自我更新能力,multilineage分化,和大量的免疫调节23,24]。PDB-MSCs也分享一些多能胚胎干细胞的性质以及其他性能的多功能干细胞(16]。

最近,urine-derived干细胞(usc)从尿液分离研究了作为一个有前途的候选人为许多组织工程治疗由于multilineage分化特性(骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、细胞,内皮细胞)和足够的扩散活动13,25,26]。优势的南加州大学包括非侵入性和低成本的收获以及被认为是道德的使用。此外,南加州大学已经从自体分离尿液不诱发免疫反应或拒绝(25]。因此,南加州大学被认为是一个有吸引力的替代来源的多功能干细胞用于各种各样的用途。

在这项研究中,我们只专注于南加州大学的增殖和分化潜能的差异,PDB-MSCs,和bmsc通过比较他们的形态,immune-phenotypes,增殖能力和分化潜能(成骨、脂肪形成的、chondrogenic和内皮)。

2。材料和方法

本研究中国西部医院的伦理委员会批准,四川大学,成都,中国。

2.1。隔离和bmsc的文化

人类骨髓样本来自六个患者(年龄从45到65岁)接受全髋关节置换术的华西医院骨科部门提供书面知情同意。bmsc孤立使用我们以前的报告中概述的方法(27]。短暂,骨髓送气与磷酸盐(PBS)稀释、分层聚蔗糖溶液(TBD科学,中国),和离心机500 g 30分钟收集单核细胞从梯度界面。然后,单核细胞在生长培养基培养(杜尔贝科修改鹰中葡萄糖(美国Gibco DMEM-HG)为10%v/v胎牛血清(的边后卫,HyClone、南美)和1%的青霉素、链霉素),后改为移除不依从细胞72小时的文化。bmsc在T-25孵化培养瓶在37°C公司为5%₂。达到70 - 80%融合后,细胞被稀释的通道1:3。第四段和第十段细胞用于形态分析,和剩余的细胞从第四篇文章被用于其他化验。

2.2。隔离和PDB-MSCs文化

人类胎盘样本来自三个健康的捐赠者的母亲(28日至33岁)后提供书面知情同意。PDB-MSCs被孤立的从这些样本根据我们以前的报告15,28]。短暂,蜕膜在PBS收集和清洗去除残留的血液。样品被机械碎成小颗粒和0.25%胰蛋白酶消化(美国Gibco), 0.1%胶原酶IV(英杰公司、美国),和80 U /毫升DNAse我(美国σ)30分钟37°C。有核细胞集中,密度梯度离心法30分钟(500克),悬浮在5毫升含DMEM-HG完全培养基(美国Gibco)为10%v/v的边后卫(HyClone、南美)和1%的青霉素和链霉素。PDB-MSCs在T-25孵化培养瓶在37°C公司为5%₂。达到70 - 80%融合后,细胞被稀释的通道1:3。第四段和第十段细胞用于形态分析和剩余的细胞从第四篇文章被用于其他化验。

2.3。隔离和南加州大学的文化

我们获得人类尿液样本从五个健康男性成人捐助者(年龄从24到30岁)在收到书面知情同意。南加州大学是孤立的协议后,在我们以前的报告(25]。短暂,尿液样本与青霉素和链霉素在500 g离心10分钟在室温下。细胞颗粒与PBS(洗 )再次离心10分钟500 g。决定活细胞的总数减少到尿液中,细胞和锥虫蓝染色和统计。然后,细胞最后播种与培养基24-well板块(角化细胞无血清培养基和祖细胞培养基比1:1 5%v/v所描述的边后卫(HyClone、南美)陈et al。25和Zhang et al。29日])。南加州大学在T-25孵化培养瓶在37°C公司为5%₂。达到70 - 80%融合后,细胞被稀释的通道1:3。第四段和第十段细胞用于形态分析,和剩余的细胞从第四篇文章被用于其他化验。

2.4。克隆形成单位(CFU)测定

从我们之前的研究克隆形成能力分析修改15]。bmsc,镀PDB-MSCs,南加州大学的80个细胞密度/厘米²在完全培养基和培养(与10%的边后卫H-DMEM bmsc PDB-MSCs;南加州大学培养基为南加州大学)。8天后,细胞被固定与甲醇和沾0.1%结晶紫(美国σ)解决方案为30分钟37°C。我们计算数量的MSC克隆利用Image-Pro + 6.0软件(美国媒体控制论),和50多个细胞的集合是算作一个殖民地(30.]。

2.5。细胞增殖

细胞增殖是根据我们之前的研究评估方法(15]。简单地说,2×10³PDB-MSCs bmsc,南加州大学在96孔板(镀 )。细胞生存能力监控在天0,1,3,5,7,9,分别。一个小时后的10μ100年l CCK-8 (Dojindo、日本)μl培养基,光密度是决定使用分光光度计在490 nm背景校正在630海里。

2.6。流式细胞术分析

第四段的bmsc, PB-MSCs,南加州大学收获0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)。对于每一个染色,约1×10⁶细胞培养与异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白- (PE)共轭单克隆抗体:CD29、CD34、CD45、CD73, CD90、CD105, CD166和HLA-DR (BD Pharmingen™)在4°C 30分钟在黑暗房间然后洗resuspended在200年μl PBS ( )。贝克曼的表型分析Cytomics FC 500流式细胞分析仪(美国贝克曼库尔特)。CD31表达内皮分化后测试在同样的过程。

2.7。在体外分化

为了分析PB-MSCs multipotency,成骨、脂肪形成的,chondrogenic,内皮分化表现在特定感应媒体。成骨、脂肪形成的分化方法优化从我们之前的研究15]。

2.7.1。成骨诱导

为了诱导成骨分化,bmsc, PDB-MSCs,南加州大学被播种在6-well板块3×10的密度⁴与成骨的培养基培养细胞/好,(15与媒介改变了21天每3天。感应后,细胞被固定和染色茜素红溶液(美国σ)30分钟。积极量化彩色区域成骨诱导后,ImageJ软件(美国国家卫生研究院,版本1.47 t)使用。红染色检测通过过滤颜色阈值(L0 - 200对茜素红染色)在实验室中颜色空间。固定阈值被用于每组图像。积极的像素点的总数的比例每个图像像素量化。

2.7.2。脂肪形成的诱导

脂肪形成的诱导bmsc,镀PDB-MSCs,南加州大学的密度3×10⁴细胞/好,诱导的脂肪形成的媒介(15]。媒介是每三天更换一次。8天后,细胞被固定和沾油红O解决方案(美国σ)30分钟可视化脂质空泡。为了量化积极染色区域脂肪形成的诱导后,ImageJ软件(美国国家卫生研究院,版本1.47 t)使用。红染色检测使用颜色阈值(L0 - 230的油红O染色)实验室颜色空间。固定阈值被用于每组图像。积极的像素的比例计算每个图像像素的总数。

2.7.3。Chondrogenic感应

Chondrogenic分化进行了以下描述的协议在我们之前的研究25]。短暂、bmsc PDB-MSCs,南加州大学在500 g离心5分钟1×10的密度⁶在chondrogenic培养基培养细胞的颗粒后(Cyagen生物科学公司,美国)。媒介是每2 - 3天更换一次。21天之后,球团矿和4%多聚甲醛固定24小时,洗在PBS三次。然后,固定球取出,用50%和70%乙醇脱水,嵌入在石蜡和分段。Deparaffinized部分与甲苯胺蓝染色30分钟来可视化解决方案细胞外matrix-bound蛋白聚糖。

第2.7.4。内皮细胞诱导和管形成试验

内皮分化、bmsc PDB-MSCs,南加州大学镀3×10的密度⁴/好,诱导内皮细胞基底介质(EBM2 Lonza)补充50 ng / ml血管内皮生长因子(VEGF、PeproTech、美国)。中当时每3天更换一次。8天后,细胞CD31表达分析,收集管形成分析,和实时PCR检测。

在体外管的形成进行了分析以进一步研究内皮分化功能。参与和endothelial-induced bmsc, PDB-MSCs,南加州大学被播种在基底膜基质48-well菜6×10的密度⁴细胞/。人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为一个积极的控制。20小时后,细胞被冲洗与PBS紧随其后的是染色赫斯特33342(美国σ)解决方案(10μg / ml) 30分钟的孵化器在37°C公司为5%₂。荧光显微镜(日本奥林巴斯IX50)是用于网络形成的分析。管子的数量计算使用Image-Pro + 6.0软件(美国媒体控制论)。

2.8。定量Reverse-Transcriptase-Polymerase连锁反应(rt - pcr)

rt - pcr分析执行endothelium-related基因表达内皮细胞诱导后8天,chondrogenic chondrogenic感应21天后闲暇的基因表达。总RNA提取使用RNAiso +试剂(豆类、日本)和reverse-transcribed cDNA使用PrimeScript RT试剂盒(豆类、日本)。特定基因的表达是量化使用SYBR预混料交货Taq II工具包(豆类、日本)IQ5实时系统(美国Bio-Rad)。endothelial-related基因特定的引物(血管性血友病因子(vWF)和PECAM-1)和chondrogenic细胞相关基因(hCOL2A1和hACANF)表中给出1。每个目标基因表达分析和比较了管家基因glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)。2数据进行了分析^{- - - - - -△△Ct}方法和结果表示相对于基因表达水平的BMSC对照组。

2.9。统计分析

所有的数据表示为 。使用SPSS 17.0软件进行统计分析(SPSS、美国)。与学生的结果进行了分析 - - - - - -测试和 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。形态

培养7到10天之后,从骨髓贴壁细胞,尿液和胎盘消化细胞克隆形成。这些单独的细胞融合在2周内达到70至80%。bmsc和PDB-MSCs显示类似纺锤状呈形态,南加州大学有一个鹅卵石石头的形状和装饰后通道4和通道10(图1)。

3.2。cfu、增殖、表型

集落形成单位分析,综合展示更好的克隆形成能力与南加州大学和PDB-MSCs相比;PDB-MSCs导致克隆形成能力比南加州大学( , ,和 , )(图2(一个))。以台盼蓝排斥、颗粒的平均总数量的活细胞来源于200毫升尿液样本是784±180.8。克隆形成单位的数量主要南加州大学源于200毫升尿液样本10到18不等。

相比,细胞增殖,PDB-MSCs和南加州大学都在3天达到高峰增长速度和提出更高的增殖能力与bmsc从第一天到第五天。在此期间,没有发现显著差异在南加州大学和PDB-MSCs(图2 (b))。南加州大学最高增长率从每天7 - 9。在此期间,没有发现显著差异PDB-MSCs和bmsc之间(图2 (b))。

使用流式细胞仪(图表型分析3)。所有三个细胞类型显示类似的负面表达CD34、CD45、和HLA-DR(低于1%),但他们表现出不同的趋势而言,CD29(南加州大学7.3%,bmsc 30.6%, PDB-MSCs 86%)。值得注意的是,尽管CD73的表情,CD90、CD105,和存在都是积极的在三个测试细胞(其中大部分高于95%),bmsc对CD105是弱阳性(59.2%)。

3.3。Multilineage分化潜能

南加州大学的multilineage分化能力,bmsc, PDB-MSCs进行了分析在体外。在条件培养基对某些天,所有的细胞都积极为茜素红染色,油红O,甲苯胺蓝,展示了他们multilineage分化潜能(图4)。然而,其分化能力不同对评估的阳性染色区域ImageJ和rt - pcr的结果。

成骨分化(图5(一个)),积极的bmsc面积为34.5%±2.7%,优于南加州大学和PDB-MSCs(19.2%±3.5%和8.4%±3.4%, )。南加州大学也导致了一个更大的正面面积比PDB-MSCs ( )。

脂肪形成的分化(图5(一个)),南加州大学的积极方面,bmsc,和PDB-MSCs 34.1%±4.5%, 25.8%±2.9%,分别和7.7%±2.1%。积极的地区南加州大学BMSC和PDB-MSC图像图像比( )虽然bmsc比PDB-MSCs拥有更积极的领域( )。

chondrogenic分化(数字5 (b)和5 (c)),rt - pcr的结果表明chondrogenesis-related基因的表达(aggrecan和胶原蛋白II)在诱导bmsc明显高于诱导南加州大学以及PDB-MSCs。诱导南加州大学是类似于诱导PDB-MSCs aggrecan和胶原蛋白II基因表达的水平。

在内皮细胞的分化分析,参与组织表现出负面结果和CD31表达低于0.2% endothelial-induced南加州大学,bmsc,和PDB-MSCs 18.8%±0.80%, 7.23%±0.30%,分别为和9.16%±0.25%表达(图6(一))。CD31表达endothelial-induced南加州大学是最高的在三个endothelial-induced组( )。Endothelial-induced PDB-MSCs导致CD31表达高于Endothelial-induced bmsc(图6 (b))。

3.4。管形成分析

此外,我们管的形成进行分析,评估干细胞血管化潜力。所有表现出内皮分化组在体外“船”形成基底膜基质经过20小时(管/ mm的数量²: , ,和 )。Endothelial-induced南加州大学有更多的管/毫米²比endothelial-induced bmsc和PDB-MSCs ( )。没有显著区别endothelial-induced PDB-MSCs和bmsc的管子数量/毫米²。参与组内,没有管观察bmsc PDB-MSCs。有趣的是,即使没有感应,南加州大学组(管/ mm的数量²:5.61±0.49)似乎也有类似的管成形能力治疗组。定量结果表明,南加州大学最高管数量每平方毫米 )在治疗和参与组(数字7(一)和7 (b))。

最后,基因表达水平的两个内皮细胞标记,CD31、vWF、都在三组增强诱导和分化南加州大学的表达水平明显高于其他两组( )。内皮细胞诱导PDB-MSCs导致CD31基因表达水平高于内皮诱导bmsc ( )。没有显著区别内皮诱导PDB-MSCs和bmsc vWF基因表达水平(数字7 (c)和7 (d))。

4所示。讨论

人类干细胞是从不同的组织有不同的功能,包括细胞增殖、集落形成能力和分化能力。因此,它是必不可少的获取识别生物物理每个细胞类型的信息以优化实验和临床选择种子细胞。这里第一次的bio-characteristics人类骨髓干细胞来源于胎盘蜕膜,和尿液进行调查,特别是细胞形态、增殖、分化表型,multilineage属性。尽管这项研究没有包括其他常见干细胞候选人,比较最有希望的或最广泛使用的种子细胞包括南加州大学、bmsc, PDB-MSCs可能为干细胞移植研究提供有价值的证据。

形态学、bmsc PDB-MSCs显示呈纺锤状形态,这被认为是一个典型的人物mesoderm-origin间充质干细胞在南加州大学rice-grain-like形状。这urothelial-like形状符合最近的证据从其他组13,25]。此外,bmsc的形态学和PDB-MSCs更细长和分散。效率,形成殖民地仍然是一个重要的细胞制剂的质量分析(31日]。CFU分析在这项研究表明bmsc, PDB-MSCs,南加州大学显示集落形成的能力。然而,bmsc导致更好的克隆形成能力比PDB-MSCs和南加州大学。

在我们的细胞增殖测定,南加州大学和PDB-MSCs增殖能力比bmsc核扩散的早期测试期间(1 - 5天)。后期的扩散试验,南加州大学显示更好的扩散能力比PDB-MSCs和bmsc(7 - 9天)。南加州大学的增长曲线显示更好的扩散能力比PDB-MSCs或者bmsc在整个扩散试验(1 - 9)。尽管没有先前的直接比较这三种细胞类型的研究,以往的研究预测我们的发现bmsc似乎不如其他多功能干细胞对于增长动力学(14]。核扩散和CFU化验使用不同的标准进行文化媒体针对bmsc, PDB-MSCs,南加州大学。因此,CFU和扩散分析允许比较具备干细胞干细胞增殖和功能使用细胞培养条件进行了优化。

作为调查的表型,流式细胞术检测所有三个细胞类型测试没有表达hematopoiesis-related抗原CD34、CD45(低于2%);人类白细胞抗原HLA-DR也是负(2%以下)。与此同时,每个细胞都有积极表达间充质干细胞相关抗原(CD73, CD90、CD105和存在)。这些发现与最小实验标准协议间充质干细胞作为细胞治疗[国际社会提出的32]。此外,显著区别CD29和相对较低的bmsc观察CD105的表达;这些研究结果似乎与一些文献不一致。各种可能引起干细胞起源,收获过程,和亚种群13,14]。

说明multilineage分化能力的南加州大学,bmsc, PDB-MSCs将导致更好地了解生物的角色。我们的数据表明,所有的多功能干细胞,在我们的调查中,拥有multilineage分化特性。根据我们的定量结果,bmsc最好成骨和chondrogenic能力比南加州大学和PDB-MSCs而南加州大学最好脂肪形成的比bmsc或PDB-MSCs和内皮功能。最近的证据的文献表明,多功能干细胞举行优惠原产地到他们的组织分化趋势,bmsc有最好的成骨和chondrogenic分化潜力,南加州大学和PDB-MSCs显示成骨和chondrogenic制造商的表达相对较低,这可能是由他们的表观遗传状态(33]。令人惊讶的是,我们还发现,南加州大学拥有健壮的内皮分化能力即使没有诱导条件。这还需要进一步的研究来理解这些底层机制。

常见的策略来克服缺乏血管化组织工程是基于形成新的血管内皮细胞和他们的能力,这一过程称为neoangiogenesis [34]。在这项研究中,管形成试验进行评估bmsc的血管化潜力,南加州大学,PDB-MSCs。如上结果描述,南加州大学有最好的内皮细胞分化能力在三个研究的干细胞来源。Endothelial-induced南加州大学有更多的管/毫米²内皮细胞诱导bmsc和PDB-MSCs。先前的研究[13,35,36)已经表明,有强有力的证据表明,南加州大学最有可能在肾脏肾小球壁层上皮细胞,这也可以解释为什么南加州大学有最好的内皮分化能力。总的来说,这些发现表明,南加州大学发现可能是另一种组织工程细胞来源与内皮细胞分化能力和血管化潜力比bmsc PDB-MSCs。

5。结论

总之,本研究表明,南加州大学有不同的形态与其他类型的干细胞。南加州大学和PDB-MSCs都显示比bmsc更好的扩散能力。然而,bmsc最好克隆形成能力比PDB-MSCs和南加州大学。使用流式细胞仪表型分析,相似性的干细胞被发现不包括CD29和CD105标记表达式。此外,bmsc观察成骨和chondrogenic能力比南加州大学和PDB-MSCs。南加州大学最好脂肪形成的内皮功能和血管化比bmsc和PDB-MSCs潜力。未来治疗的适应症和临床应用bmsc, PDB-MSCs,和南加州大学应该设计基于三个不同亚型之间的独特的特点,比如他们的生长动力学和分化能力。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

承光吴和陈长了同样的工作。

确认

这项工作是财政支持的国家高技术研究发展计划(批准号2012 aa020503),国家自然科学基金(批准号。81702171,81702171,31600792),成都高新技术区重点科技创新项目(批准号14 dfzd015),为中医药科学技术研究项目和民间医学贵州省级中医药管理局(批准号qzyy - 2018 - 003)和贵州省人民医院博士基金(批准号GZSYBS [2017] 04)。作者要感谢博士Anne-Laure Leblond,鲁本Casanova博士,Aashil先生巴达维亚的社论援助这个手稿。

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