改变的表达造血调控分子Lipopolysaccharide-Induced骨髓间充质干细胞的再生障碍性贫血患者

文摘

我们调查的RNA转录表达造血调控分子,即,巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 1α肿瘤坏死因子(TNF)α粒细胞集落刺激因子(g - csf),基质细胞衍生因子(SDF) 1α干细胞因子(SCF)和转化生长因子(TGF)β在lipopolysaccharide-induced骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)和水平的可溶性形式文化BM-MSCs上层清液和BM等离子体的获得性再生障碍性贫血(AA)患者( )和控制( )。AA患者的BM-MSCs控制相比有明显降低MIP-1的表情α成绩单( ),高表达的肿瘤坏死因子-α( ),g - csf ( ),SDF-1α( )记录和自洽场的表达式和TGF -没有区别β记录。BM-MSCs文化上层清液和BM AA患者的血浆相比控制MIP-1水平也较低α( 和 ,分别)和肿瘤坏死因子的水平较高,α( )和g - csf ( 和 ,)但是没有差异SDF-1的水平α和自洽场。TGF -的水平β尽管相似文化的上层清液BM-MSCs的团体,但他们在BM显著降低血浆的病人比控制( )。我们的数据表明,BM-MSCs AA患者改变了表达造血调控分子暗示他们可能在疾病的发病机理中的作用。

1。介绍

获得性再生障碍性贫血(AA)是一种骨髓衰竭状态,其特征是外围全血细胞减少症和发育不全的骨髓(BM)正常造血细胞是脂肪细胞所取代。AA的大多数情况下是特发性原因在哪里不知道,大多数研究都聚焦于内在造血干细胞缺陷或免疫介导造血干细胞(hsc)的破坏AA发病机制,但精确的疾病的发病机理尚不清楚,直到现在(1,2]。

BM间充质干细胞(BM-MSCs)及其分化细胞构成造血利基在大英博物馆和有一个重要的角色在维持长期造血作用[2]。我们和其他团体报道增加脂肪形成的和/或降低成骨分化的潜力BM-MSCs AA患者(3- - - - - -5]。增加脂肪形成和骨生成的减少仍在大英博物馆的负面影响造血作用[6,7),因此,这些改变的分化潜能BM-MSCs AA患者可能导致缺乏在AA造血作用。此外,使用交叉coculture实验,它也表明,BM-MSCs AA患者缺乏hematopoiesis-supportive活动(8,9]。自从BM-MSCs主要与肝星状细胞通过分泌分泌分子包括细胞因子,趋化因子,生长因子维持造血体内平衡(2,10),因此我们的假设是造血调控分子表达的改变可能参与调解这些功能异常的BM-MSCs AA。

因此,本研究的目的是研究造血调控分子的表达包括巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 1α肿瘤坏死因子(TNF)α粒细胞集落刺激因子(g - csf),基质细胞衍生因子(SDF) 1α干细胞因子(SCF)和转化生长因子(TGF)β的BM-MSCs AA患者。

2。材料和方法

2.1。主题

29 AA患者(12个雌性,雄性17日)平均年龄为32.86±16.43年(范围12 - 64年)和相同数量的年龄,sex-matched控制招募了研究中。AA的诊断和严重程度的分级是根据公布的标准(11]。控制包括10健康的捐赠者和19免疫性血小板减少性紫癜患者经历了一个诊断BM测试,但正常的骨髓。知情同意后,5毫升的BM髂后上嵴的每个主题都吸进肝素化BM-MSC管隔离和文化。

2.2。隔离、文化和Immunophenotypic BM-MSCs的表征

BM-MSCs被孤立、培养和特征如前所述[3]。简而言之,单核细胞密度梯度离心法从大英博物馆送气的培养在25厘米²水瓶(美国BD生物科学)在37°C公司5%₂用5毫升的完整文化媒体组成的αGlutaMAX mem, 1%, 16.5%胎牛血清,100 U /毫升青霉素,100µg / ml链霉素(所有从Gibco和热费希尔科学,美国)。48小时后,不依从细胞被移除和介质替换。当文化confluency达到70 - 80%,贴壁细胞收获用0.05%胰蛋白酶(Gibco)和山肩进一步扩张。细胞的3^{理查德·道金斯}通道被用于所有的实验。

immunophenotypic表征,BM-MSCs被孵化细胞染色30分钟以下preconjugated抗体:CD73 (PE), CD90 (PE)、CD105 (PE),存在(PE)、CD34 (FITC)、CD45 (FITC) HLA-DR (FITC)和CD13 (PE)(都来自Serotec, (http://www.abdserotec.com))。细胞染色isotype-matched抗体作为控制。洗后,这些细胞被收购了BD FACS-Canto流式细胞分析仪(美国BD生物科学,圣何塞,CA)和数据分析是使用流式细胞仪表达软件完成的。

2.3。分化BM-MSCs Adipocytic和Osteocytic血统

分化的BM-MSCs adipocytic osteocytic细胞进行了使用脂肪形成和骨生成工具,分别(美国Gibco,马里兰州)按照制造商的指示,已经报道了我们3]。脂肪形成的和成骨分化,细胞被固定和沾油红O染色后18天,和茜素红染色后21天的孵化分化培养基,分别。

2.4。RNA提取和定量实时PCR(存在)

BM-MSCs获得的3^{理查德·道金斯}通过semiconfluent文化进一步24小时纯阿尔法MEM培养基培养(Gibco)补充500 ng / ml脂多糖(LPS);Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),24小时后使胰蛋白酶化和总RNA提取使用试剂盒试剂(表达载体,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)。互补脱氧核糖核酸合成和定量实时PCR进行先前建立的实验室(3]。使用2折表达变化进行了计算^−ΔΔCt方法。寡核苷酸作为引物(MWG生物技术经纪有限,班加罗尔,印度)给出了RT-qPCR表1。

2.5。量化的造血调控因子BM-MSC文化上层清液和BM等离子体

准备文化上层清液,3^{理查德·道金斯}通过BM-MSCs培养24小时在2.5毫升的纯阿尔法MEM培养基(Gibco)包含500 ng / ml的有限合伙人。这些文化的文化上层清液是1000年收获和离心机10分钟来删除任何细胞碎片。大英博物馆等离子体被离心法收集骨髓送气音,享年1000岁10分钟。文化上层清液和BM等离子体被储存在−20°C到使用。自洽场,定量估计的g - csf SDF-1 MIP-1α肿瘤坏死因子-α,TGF -β在大英博物馆文化上层清液,与此同时等离子体的每个主题是由ELISA试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,美国),按照制造商的说明。

2.6。统计分析

结果计算均值±SE。统计学意义是取决于学生的以及使用GraphPad棱镜软件版本5 (GraphPad、圣地亚哥、钙、美国)。的值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。形态和Immunophenotypic表征

AA患者的BM-MSCs显示BM-MSCs呈纺锤状形态相似的控制。流仪分析他们的表型标记表明BM-MSCs AA患者以及控制表达类似水平的MSC标记CD73 CD89, CD105,存在和缺乏的表达CD13、CD34、CD45、HLA-DR(图1(一))。

3.2。脂肪形成的和BM-MSCs成骨分化

油红O染色的脂肪细胞分化从AA BM-MSCs显示更高的密度和更大的脂滴的大小表明更高脂肪形成的潜在的AA BM-MSCs控制BM-MSCs相比(图1 (b))。然而,BM-MSCs AA患者表现出较小的成骨的潜在而控制msc陶醉茜素红染色(图1 (b))。

3.3。在BM-MSCs造血调控基因的表达

AA患者的BM-MSC ( )相比,控制( )没有MIP-1成绩单的组成型表达的差异α肿瘤坏死因子-αTGF -β1 g - csf SDF-1α,自洽场。然而,LPS刺激后,MIP-1的转录水平α大幅下降(褶皱减少:7.1; ),而那些TNF -α(褶皱增加:7.0; ),g - csf(褶皱增加:2.38; ),SDF-1α(褶皱增加:1.36; )明显高于没有现金流量表的水平差异,TGF -β(图1成绩单,之间的病人和控制2(一个))。

3.4。AA BM-MSCs分泌造血调控分子

BM-MSCs AA患者的文化上层清液( 控件(相比) 显示没有区别MIP-1的水平α肿瘤坏死因子-αTGF -β1 g - csf SDF-1α,自洽场水平。然而,LPS刺激后,BM-MSCs的文化上层清液的病人相比,控制MIP-1的水平也会大大降低α(216.7±58.72 vs 670.1±72.85; )和肿瘤坏死因子的水平较高,α(172.32±32.05 vs 44.76±10.89 )和g - csf (306.8±56.90 vs 123.2±17.68; )没有差别的自洽场的水平(24.32±3.09 vs 31.98±3.45; )和TGF -β1 (310.0±63.68 vs 204.70±36.37; )(图2 (b))。

3.5。的造血调控分子水平BM等离子体

大英博物馆的等离子体AA患者( 的控件(相比) )也表现出显著降低水平的MIP-1α(8.70±3.51 vs 31.91±5.58; )和肿瘤坏死因子的水平较高,α(34.26±8.87 vs 9.07±2.47; )和g - csf (505.32±112.80 vs 3.48±5.99; 与没有区别),自洽场的水平(996.20±67.68 vs 1050±64.70; )和SDF-1α(3695.0±268.4 vs 3706.0±296.0; )。然而,TGF -的水平β1在BM等离子的患者明显低于控制(335.2±97.07 vs 850.7±139; )(图2 (c))。

4所示。讨论

我们观察到BM-MSCs AA患者虽然有形态和表型类似于控制但脂肪形成的较高和较低的成骨分化潜能,这与先前的报道是一致的,我们和其他组织(3- - - - - -5]。研究BM-MSC派生的角色在AA造血调控分子,我们最初评估MIP-1的表达α肿瘤坏死因子-αg - csf, SDF-1α自洽场,TGF -β1成绩单BM-MSCs AA患者和控制水平的可溶性形式的这些造血调控分子BM-MSCs文化上层清液的组成条件下两组但观察两组之间没有显著差异表达的转录的分子或细胞培养上清液中可溶性蛋白质含量。因此,我们测量这些造血调控细胞因子刺激后BM-MSCs有限合伙人,这是一个强有力的兴奋剂的这些细胞和诱导激活通过绑定到他们的toll样受体(12,13]。的LPS-stimulated BM-MSCs AA患者相比MIP-1的控制表现出显著的低表达α和高表达的肿瘤坏死因子-α、g - csf和SDF-1α成绩单以及MIP-1低α和更高的肿瘤坏死因子-α和g - csf水平文化上层清液SDF-1的水平没有区别α自洽场,TGF -β1。大英博物馆AA患者的血浆也改变这些造血调控分子确凿的水平的变化水平文化上层清液,除了TGF -β1水平相对较低的地方大英博物馆等离子体虽然文化水平相当的上层清液的病人和控制。尽管一些零星的报道可在文学在这些造血调控分子在AA患者骨髓单核细胞,但就我们所知,这是第一个研究这些分子的成绩单BM-MSCs及其文化上层清液的蛋白质含量BM-MSCs以及BM AA患者的血浆。

MIP-1没有以前的报告α成绩单或蛋白质BM-MSCs AA患者。然而,一个长期骨髓AA患者的文化报告显示MIP-1水平升高α在基线文化上层清液14 20 AA患者和il - 1α刺激的文化水平进一步增加7例但明显减少剩余7患者观察到我们目前的研究(14]。MIP-1α据报道,抑制原始肝星状细胞的增殖可能保持静止而促进成熟的肝星状细胞增殖突出其在造血作用[双向作用15]。此外,MIP-1α也是重要的中介msc和肝星状细胞或免疫细胞之间的相互作用的大英博物馆调节他们的功能性质16]。因此,我们观察MIP-1几乎没有表情的αBM-MSCs和相应的降低其水平BM等离子体AA患者可能会损害肝星状细胞的信息交互与msc和BM-MSCs的造血支持功能。

肿瘤坏死因子-α据报道,引起骨髓发育不全在AA诱导肝星状细胞的凋亡细胞死亡Fas-Fas配体和/或TNF-related凋亡诱导配体通路(17]。水平的提高TNF -α已报告在AA, t细胞在骨髓的患者被认为是肿瘤坏死因子的主要来源-α(18,19]。我们的更高的TNF的表达——示范α在成绩单以及蛋白质含量BM-MSCs AA患者的第一份报告显示BM-MSCs也TNF -的重要来源α在BM AA患者。我们之前的研究表明TNF水平上升α在BM等离子但没有表达骨髓t细胞也支持我们当前的观测(20.]。

AA患者的BM-MSCs表达g - csf的记录与相应的高水平文化上层清液。这是一个由基质分泌造血细胞因子家族的重要成员和其他细胞类型。类似于我们的观察,高浓度的g - csf成绩单已报告在BM基质细胞和他们的文化上层清液21,22]。一方面,g - csf表达的增加被认为代表一个补偿性supraphysiological响应BM-MSCs促进减少AA造血作用。另一方面,g - csf水平较高的负相关数量的AA患者的骨髓细胞已经被报道。然而,BM移植和免疫抑制治疗后,g - csf水平已被证明AA患者恢复到正常水平,这同时也表明一个antimyelopoietic g - csf在AA的影响23,24]。SDF-1的表达α成绩单的BM-MSCs AA患者虽然在统计学上更高的控制相比,但在文化水平上层清液是类似于控制。自洽场的水平,这是完全由骨髓基质细胞,在基因和蛋白质与控制水平。数据SDF-1的先前的研究α和骨髓基质细胞的自洽场印证了我们的观察25,26]。

为了确定这些造血调控分子的改变在活的有机体内在骨髓微环境中,我们分析了BM等离子体的AA患者的水平。这是观察到类似于文化水平BM-MSCs上层清液,大英博物馆AA患者的血浆比控制MIP-1水平较低α和高水平的肿瘤坏死因子-α和g - csf水平的自洽场和SDF-1没有区别α。BM等离子体的这些细胞因子水平的改变也证实的mRNA转录水平LPS-stimulated BM-MSCs AA患者中,但由于人们普遍在AA患者的骨髓脂肪形成,因此BM脂肪细胞和其他细胞样的巨噬细胞和t细胞也可能有重要贡献这些细胞因子的改变在BM AA患者的血浆。TGF -的水平β1在BM显著降低等离子体比控制的患者,与类似的表达的文化上层清液BM-MSCs暗示缺乏生产的其他骨髓细胞样的细胞因子的t细胞和巨噬细胞。类似于我们的观察,低水平的TGF -β1之前已报告在AA患者的长期骨髓的文化27]。自从TGF -的主要功能之一β1是调解的调控t细胞扩张,这种细胞因子水平降低可能是负责报告的亚群的数量减少AA患者的骨髓(5]。未来的研究探索MIP-1的角色α肿瘤坏死因子-α,g - csf在造血和免疫调节功能的BM-MSCs AA将重要的更好地了解疾病的病理生理学。

5。结论

我们的数据表明,BM-MSCs AA患者明显降低MIP-1的表情α和高表达的肿瘤坏死因子-α和g - csf记录相应变更他们的水平在BM文化上层清液以及等离子体,共同突出异常BM-MSCs AA。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。任何额外的信息数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者没有利益冲突。

作者的贡献

SN、NKT和共产党导致了研究设计,数据的分析和解释。NKT和共产党纸和SN修改后的文章中写道。共产党,NKT EM,进行实验室工作。SN、共产党和KR提供试剂和工具的研究工作。基米-雷克南AA患者的实验室检查。钱德拉Prakash查图尔维迪和库马尔Tripathy贡献同样这项工作。

确认

这项工作是由一个校内的格兰特(PGI / DIR / RC / 304/2014) SGPGIMS,勒克瑙,批准SN和Ramalingaswami重返奖学金授予部门生物技术,印度政府(BT / RLF /返回/ 45/2012)认可的中国共产党。

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