微分调节衰老Methylation-Regulating酶的基质细胞驱动大肠癌细胞应对DNA-Demethylating Epi-Drugs

文摘

结肠癌晚期从原发肿瘤部位扩散到遥远的器官colon-unassociated基质的人口为肿瘤细胞的生长提供了有利的利基。heterocellular结肠癌细胞之间的相互作用和colon-unassociated成纤维细胞在遥远的转移地点很重要,然而,这些信息交互为转移性结肠癌治疗策略仍然低估了。最近的研究表明的治疗潜力DNA-demethylating epi-drugs 5-azacytidine(阿扎)和5-aza-2脱氧胞苷(DAC)治疗实体肿瘤。而影响这些epi-drugs单独或结合其他抗癌疗法很好地描述,检查参与组成分泌腺基质细胞的影响及其在癌症细胞应对这些代理仍然是难以捉摸的。在这项研究中,我们确定正常和衰老colon-unassociated成纤维细胞的影响及其对结直肠癌(CRC)的条件培养液细胞响应阿扎和DAC利用细胞DNA脱甲基记者系统。我们的数据表明,成纤维细胞细胞增殖加速,不同调节DNA methylation-regulating酶的表达,增强DAC-induced脱甲基的CRC细胞。相比之下,从衰老成纤维细胞条件培养液,调节NF -κB drug-untreated CRC的活动改变了脱氧胞苷激酶水平细胞和废除DAC影响DNA甲基转移酶1的退化。类似于2 d文化,衰老成纤维细胞增加CRC细胞的DNA脱甲基coculture球状体,除了增加CRC的具备干细胞细胞。这项研究提供了第一个证据的影响正常衰老基质细胞和DNA脱甲基的DAC的条件培养基。数据显示增加活动的DAC高基质细胞cocultures和显示肿瘤基质的潜力比预测DNA-demethylating表观遗传癌症治疗的结果。

1。介绍

结直肠癌(CRC)是最常见的癌症之一,与异构治疗结果(1,2,越来越多的证据表明基质的CRC入侵的关键作用,转移,化疗和放疗反应(3- - - - - -5]。CRC患者样本的基于图像的定量研究表明,大量的癌症在肿瘤间质成纤维细胞作为治疗CRC手术后复发的指标(6]。的不良预后CRC亚型特点是具备干细胞和/或epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT),间叶细胞基因的表达升高主要是由肿瘤相关基质(7]。高Wnt信号活动在肿瘤细胞靠近基质myofibroblasts具备干细胞进一步表明,结肠癌细胞的部分是由肿瘤微环境(8]。

细胞的异质性肿瘤微环境在肿瘤进展中发挥着关键作用,入侵,转移,抗癌治疗的结果(9]。而肿瘤基质本身不是恶性,基质细胞获得异常表型和支持癌症的生长和进展(9,10]。重要的是,衰老基质细胞在肿瘤微环境的作用是进入光由于能力驱动的肿瘤的生长,导致一个微分癌细胞对抗癌药物的反应(11,12]。衰老是一个正常的细胞事件触发后癌细胞基因毒性压力,如放疗和化疗(13]。然而,在其他类型的非癌变细胞治疗导致旁观者衰老肿瘤微环境的建议导致癌症复发和加重化疗的副作用12,14,15]。因此,越来越多的兴趣了解衰老的基质细胞改变肿瘤细胞的反应不同的类抗癌药物(16]。

DNA甲基转移酶抑制剂(DNMTIs),如5-azacytidine(阿扎)和5-aza-2脱氧胞苷(DAC),表明承诺活动启动代理治疗实体肿瘤在早期的临床试验17- - - - - -20.]。DNMTIs已报告,结合其他抗癌疗法(协同工作21- - - - - -25和放射治疗26,27]。尽管DNMTIs单独或结合放疗的影响都报道说,目前还不清楚如何正常衰老和/或基质细胞的肿瘤微环境影响癌细胞DNA-demethylating药物的反应。除了肿瘤基质相声,结肠检查参与组成分泌腺纤维母细胞和senescence-associated分泌表型(SASP)发挥着至关重要的作用在调节肿瘤细胞的增殖11,28]。分泌的因素从正常和衰老基质细胞也被建议为肿瘤发生和微分药物效果(29日]。

结肠癌晚期以来从原发肿瘤部位蔓延到遥远的器官和组织(30.],colon-unassociated基质人口可能发挥重要作用在形成良好的转移性适合CRC的细胞。CRC细胞之间的交互和noncolon成纤维细胞在遥远的转移地点很重要,然而,这些heterocellular肿瘤基质相互作用对预防和/或治疗转移性结直肠癌仍然可以理解的策略。在这项研究中,我们调查了colon-unassociated正常的人类包皮和肺成纤维细胞的影响和辐射诱导衰老同行CRC细胞响应阿扎和DAC的二维(2 d)和球体的文化。此外,我们研究的影响从正常和衰老成纤维细胞细胞条件培养液对结肠癌细胞增殖和DAC-induced DNA脱甲基作用。本研究使用脱甲基的记者描述我们最近执行,今后HCT116-pFLJ-H2B细胞,称为HCT116 [31日]。

2。材料和方法

2.1。细胞化学、细胞培养和记者

阿扎和DAC合成如前所述[32]。DMSO浓度在治疗井总是小于0.1%。

人类正常的BJ包皮成纤维细胞(写明ATCC®crl - 2522™)和人类正常MRC-5肺成纤维细胞(写明ATCC ccl - 171™)分部从写明ATCC购买(英国米德尔塞克斯)和培养EMEM (Gibco®,热费希尔科学Inc .,沃尔瑟姆,妈,美国)补充10%胎牛血清(的边后卫;Gibco热费希尔科学)。人类A549肺癌细胞(写明ATCC ccl - 185™)分部在火腿F-12培养基培养(Gibco热费希尔科学)补充10%的边后卫。所有细胞都保存在一个标准的湿润孵化器有限公司5%₂/大气37°C。

脱甲基记者HCT116细胞生成和培养如前所述31日]。GFP-expressing BJ细胞(BJ-GFP)被转导生成使用Cignal Lenti GFP慢病毒粒子,而核因子-κB (NF -κ(A549-NF - B)记者A549细胞κB)生成使用Cignal Lenti NF -κB记者从试剂盒慢病毒颗粒(希尔登,德国)后,制造商的协议。简单地说,所有的细胞都被感染的感染复数10微升/细胞。提高转换效率,SureENTRY转导试剂(试剂盒)是使用一个集中的8μ克/毫升。转导细胞受到选择压力的3μ嘌呤霉素(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。BJ-GFP细胞是由单细胞分离排序在BD FACSAria II细胞分选仪(美国BD生物科学,圣何塞,CA)为了避免多个段落在克隆选择和复制衰老。

2.2。衰老由x射线辐照诱导条件培养基,细胞的可行性分析

纤维母细胞文化受到10 Gy x射线照射x射线RS225辐照器(Xstrahl、萨里、英国)的剂量率2.3 Gy /分钟。辐照细胞然后保持1到3周之前收集的条件培养基或使用细胞进行实验。0.22收集条件培养液过滤后使用μm无菌注射器过滤器(美国默克密理博,伯灵顿,MA)和稀释到25%之前完成新媒介实验提供重要组件支持细胞生长所必需的。

对细胞生存能力分析,HCT116被播种在96 -孔板和暴露在x射线辐照如上所述。8 h后,辐照HCT116服用DAC (0.2 -20μ米)在25%的条件培养基从辐照BJ 72 h或完整的媒介,和细胞生存能力是由一个标准的3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)测定。

2.3。β牛乳糖衰老细胞的分析

衰老细胞未照射和1 -质询辐照纤维母细胞染色使用文化β牛乳糖(β加)染色工具包(细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国制造商的协议。与赫斯特33342年细胞复染色(分子探针®,尤金,或者美国)在细胞成像之前,旅行者CV7000S显微镜(日本横河、东京、日本)使用20 x客观和405/488/561纳米激光线(赫斯特)和明亮的字段过滤β加。捕获的图像导入到哥伦布™图像分析系统(美国PerkinElmer沃尔瑟姆,MA)。衰老细胞使用texture-based量化分析的核和胞质地区Saddle-Edges-Ridges哥伦布(SER)算法在图像分析系统(33]。简单地说,细胞核被确定基于赫斯特染色。然后,发现细胞核的面积和圆度计算和基于区域的细胞群被选中和圆度。接下来,选择周围的细胞质细胞核被人口计算纹理属性(在明视场通道)基于SER点特性。细胞与SER现货价值高于阈值进行了计算和量化。

分析蛋白质的标记细胞衰老,复制和衰老成纤维细胞收集处理和免疫印迹分析如下所述。

2.4。Coculture和条件培养液文化设置

单一栽培的HCT116 cocultures HCT116未照射或1 -质询和辐照衰老成纤维细胞建立在明确底部CellCarrier 384 -孔板(PerkinElmer) 7: 3和3:7比率,以下简称低基质cocultures和高基质cocultures,分别。总细胞密度总是1000细胞/。注意所有cocultures建立在EMEM支持所有类型的细胞的正常生长。

研究从衰老成纤维细胞条件培养基的影响文化HCT116扩散和脱甲基,实验设置的方式有一个自由交流的媒介HCT116细胞之间和1 -质询辐照成纤维细胞在不同的井没有直接的细胞间接触。

2.5。药物治疗,脱甲基,2 d细胞增殖分析文化

细胞治疗72 h与DAC或阿扎在1μ米和5μM浓度稀释在适当的介质和成像和分析评估其它地方描述的EGFP的信号强度(31日]。HCT116细胞增殖的速度(72 h / 24 h)在未经处理的文化类型是由数的总数RFP-H2B-tagged HCT116细胞核使用哥伦布图像分析系统(PerkinElmer),如前所述[31日]。

2.6。球体文化、药物治疗和成像

球状体生成所述其他地方(34]。低基质coculture和高基质coculture HCT116球状体和未照射或1 -质询辐照建立了成纤维细胞在上述比率(见部分2。4)。球状体出了至少1周之前任何治疗的开始。研究条件培养基的影响,被转移到一个新的球状体agarose-coated 384孔板含有25%从辐照成纤维细胞条件培养液的文化。球面成像和EGFP强度的量化和球体大小进行描述的其他地方(31日,34]。所有的药物治疗了96 h球状体。

图像DAC-treated球状体是用一张光Z.1显微镜(卡尔蔡司,耶拿,德国)。在成像之前,DAC-treated球状体收集和清洗1 x磷酸盐(PBS)。被染色2 h 10球状体μ米赫斯特在室温下核染料。洗在球状体1 x PBS去除残留的赫斯特和安装在1.5% (w/v)低熔点的琼脂糖(40°C)。被卷入一个0.5毫米的玻璃球状体与金属毛细管柱塞(卡尔蔡司),并允许在室温下聚合为5分钟。毛细管是垂直安装在试样夹,沉浸在样品室充满自由EMEM酚红。包含球状体的聚合琼脂糖然后使用金属柱塞挤压到样品室,和多方向的z堆栈图像获得使用20 x光学检测和两个10 x光照与合适的激光和光学过滤器。捕获的图像处理使用禅宗蓝色图像处理软件(卡尔蔡司)。

2.7。细胞分类和免疫印迹分析

HCT116条件培养基培养在25%未照射或1 -质询辐照纤维母细胞文化和高基质cocultures HCT116与未照射或辐照成纤维细胞治疗与1μDAC 72 h。HCT116立即收集来自条件培养液文化和细胞溶解药物治疗后免疫印迹分析和处理。分析DAC的影响在cocultures HCT116, RFP-expressing HCT116排序在FACSAria二世首次被孤立的细胞分选仪(BD生物科学),然后为西方墨点法处理。Nonfluorescent正常BJ sBJ cocultures也同时孤立的细胞免疫印迹实验。

细胞细胞溶解在缓冲区里帕(150毫米生理盐水、1.0% NP-40或者特里同x - 100, 0.5%钠脱氧胆酸盐,0.1%十二烷基硫酸钠,50毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值(8.0))补充完整™蛋白酶抑制剂鸡尾酒(瑞士巴塞尔罗氏公司)通过声波降解法冰。蛋白溶解产物(20 - 50μg)电泳和转移到PVDF膜(默克密理博)和探测与抗体(其它地方描述的35]。主要抗体DNA甲基转移酶1 (DNMT1;目录编号:5032,1:1000稀释)、波形蛋白(目录编号:5741,1:1000稀释),β连环蛋白(目录编号:8480,1:1000稀释),和p21^{waf1 / cip}(目录编号:2947,1:1000稀释)购买从细胞信号技术(丹弗斯、马、美国);p53(目录编号:ab131442, 0.02μ从Abcam g / mL稀释)(英国剑桥);p16(目录编号:sc - 759;1:500稀释)圣克鲁斯生物技术(美国达拉斯,TX);和春节methylcytosine加双氧酶1 (TET1;目录编号:nbp2 - 15135;1:1000稀释)和脱氧胞苷激酶(dCK;目录编号:H00001633-B01P;1μg / mL稀释)从罗福斯生物制剂(利特尔顿有限公司、美国)。鼠标反β肌动蛋白抗体(目录编号:A5441;1:4000稀释)被用作加载控制从Sigma-Aldrich购买。墨迹是使用山羊anti-mouse或anti-rabbit Alexa萤石®488二级抗体(1:2000稀释)从生活技术(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。

2.8。NF -κB活性和细胞因子分析

确定NF -κ活动,内部开发A549-NF -κ记者B细胞(36)被播种密度的10000细胞/在火腿F-12介质的白色不透明96 -孔板(PerkinElmer)。24小时后,取代原有的媒介与未照射未稀释的条件培养基或1 -质询辐照纤维母细胞的文化,和细胞进一步孵化24和48 h。100年,在每个孵化μL Britelite +发光试剂(PerkinElmer)每口井的添加,板块内容混合在一个板块瓶,发光信号测量的设想Multilabel板读者(PerkinElmer)。

促炎细胞因子和趋化因子在条件培养液化验使用细胞因子人类磁25-Plex面板Luminex™工具(技术)制造商的协议和分析200年Luminex系统分析仪(美国奥斯汀,得克萨斯州)。

所有与样本进行化验条件中获得未照射或辐照纤维母细胞文化的三个独立的文化。

2.9。统计分析

所有统计分析进行至少2 - 4独立生物复制使用GraphPad棱镜(GraphPad软件版本7,圣地亚哥、钙、美国),和差异被认为是重要的 。除非特别提到,数据分析使用单向方差分析与Dunnett多重比较检验。在一个示例t以及,数据与假设值的100%。

3所示。结果

3.1。辐照的数量增加β-Gal-Positive衰老成纤维细胞

辐照是衰老的以来诱导物,在不同的细胞类型(13]。因此,我们首先确定的数量β-Gal-stained衰老细胞在未照射和1-week-old辐照BJ纤维母细胞文化含量高图像分析中描述的材料和方法。与未照射BJ文化相比,有显著增加的数量β-Gal-positive衰老BJ (sBJ)成纤维细胞后辐照(图1周S1a;未照射BJ 2.7±0.3%和5.5±0.5% 1-wk-IR sBJ文化, , ,学生的t以及,未配对)。额外的辐照BJ成纤维细胞培养2周进一步增加的百分比β-Gal-positive细胞42.9±3.1% ( 与未照射BJ, ,学生的t以及,未配对)。

接下来,我们确定了诱导衰老的分子标记未照射和1 -质询辐照BJ文化。未照射BJ的成纤维细胞显示弱p21水平升高^{waf1 / cip}。按照β加染色数据,辐照诱导衰老标记物的表达,p16和p21^{waf1 / cip}除了p53, 1 -质询sBJ文化(图印地)。

3.2。成纤维细胞的敏感性增加HCT116在2 d Cocultures DAC

研究衰老成纤维细胞对DNA-demethylating HCT116反应药物的影响,低和高基质cocultures HCT116、1-week-old辐照sBJ建立了。比较EGFP效应的强度会增加文化相关的DAC和阿扎HCT116 DNA脱甲基的顺序高基质coculture >低基质coculture >单作(图1(一))。检查如果这种影响仅限于衰老细胞,我们执行一个类似的比较HCT116 DAC和阿扎治疗后与未照射coculture BJ成纤维细胞。未照射BJ sBJ类似成纤维细胞,成纤维细胞显著增加DAC-induced HCT116 DNA脱甲基作用,但是在阿扎的影响没有区别(图1(一))。由于DAC HCT116有更大的影响在cocultures脱甲基,我们决定执行所有与DAC后续研究。同时,从先前的研究明显HCT116细胞,DAC显示最大脱甲基1μM浓度;因此,我们选择1μ为进一步研究[M DAC浓度37]。接下来,观察是否衰老细胞效应被其他复制衰老成纤维细胞类型,我们对待cocultures HCT116质询辐照老化MRC-5 (sMCR-5)和sBJ成纤维细胞与1μM DAC。数据显示增加DAC的脱甲基作用在HCT116 coculture sMRC-5和三星期的辐照sBJ成纤维细胞(图。1 (b))。总的来说,数据表明,增加脱甲基的HCT116 DNMTIs更明显衰老成纤维细胞的存在。

我们下一个检查SASP HCT116反应的影响对DAC-induced脱甲基作用。细胞培养的方式有一个自由交流的媒介HCT116和sBJ或sMRC-5细胞之间,但没有直接HCT116 sBJ或sMRC-5信息联系(图1 (b))。结果显示没有1日SASP的显著影响μM DAC-induced脱甲基在HCT116(图1 (b))。

3.3。成纤维细胞和他们的条件培养基影响DAC-Induced改变DNA甲基转移酶1的水平

进一步解读正常和衰老成纤维细胞的影响,我们分析了蛋白质的DNA甲基化水平的变化和demethylation-regulating酶,DNMT1 TET1,分别在HCT116隔绝cocultures HCT116、未照射BJ或sBJ成纤维细胞。结果显示的差别明显对这些DNMT1的未经处理的HCT116 cocultured与未照射BJ或sBJ成纤维细胞相比HCT116单一栽培。虽然1μM DAC下调DNMT1水平单作HCT116、显著差别的对这些基因在HCT116 cocultured sBJ(图2(一个); 、双向方差分析)。尽管有改变的TET1 HCT116 DAC治疗后不同的文化类型,在统计学上是不重要的(图2(一个))。

我们进一步研究的影响未照射BJ, sBJ成纤维细胞条件培养基从DNMT1 HCT116 TET1水平。而1μM DAC抑制HCT116 DNMT1水平在治疗时从正常BJ成纤维细胞条件培养液的存在,这种抑制是废除的条件培养基从sBJ文化(图2 (b))。涉及到的数据缺乏显著增加DAC-induced HCT116 DNA脱甲基的存在条件培养基从sBJ文化(见图1 (b))。TET1水平没有显著差异在HCT116细胞条件培养基培养(图2 (b))。

辐射提升dCK信使rna和蛋白质含量38,之间存在明显关联dCK水平和吉西他滨(机体的影响39]。dCK添加第一个磷酰集团DAC和病原反应酶的整个过程的DAC转换成三磷酸的形式包含在DNA (40]。我们接下来研究蛋白质含量dCK DAC-treated HCT116隔绝cocultures BJ或sBJ成纤维细胞和培养条件培养基从BJ或sBJ文化。事实上,我们的数据显示一个高水平的dCK DAC-untreated HCT116隔绝cocultures HCT116 BJ或sBJ成纤维细胞;然而,这个表达式是高HCT116隔绝cocultures sBJ成纤维细胞(图S2a)。治疗与DAC似乎进一步增加的dCK水平coculture-isolated HCT116。有趣的是,来自sBJ文化的条件培养基的存在降低了dCK水平HCT116治疗或没有DAC(图开通)。

3.4。成纤维细胞和他们的条件培养液细胞增殖增加2 d的文化

自脱甲基DAC更明显的增殖细胞(41),我们检查正常,衰老成纤维细胞的影响及其对HCT116扩散的条件培养基。单一栽培相比,HCT116扩散显著增加cocultured时正常,sBJ, sMRC-5成纤维细胞或在从衰老成纤维细胞条件培养液(数字3(一个)和3 (b))。

3.5。衰老成纤维细胞条件培养液DAC-Induced增加细胞毒性并显示高水平的促炎细胞因子和趋化因子

以确定衰老成纤维细胞的扩散条件medium-induced增加HCT116部分负责增加易感性HCT116 DAC,我们下一个决心DAC的细胞毒性/抑制细胞生长的影响在nonproliferating HCT116条件培养液的存在。我们第一次辐照HCT116诱导细胞周期阻滞(42),然后对辐照HCT116 DAC (0.2 -20μ米)没有或存在条件培养基sBJ文化。辐照HCT116减毒的DAC的细胞毒性/抑制细胞生长的效果没有条件培养基;然而,添加sBJ条件培养液逆转这种效应(图3 (c)(左)。虽然DAC是显著有效的改变未照射HCT116的可行性,条件培养基的进一步增加DAC(图的影响3 (c),对吧)。

NF -κB通路建议为衰老程序(43),诱导细胞凋亡抑制NF - DNA-demethylating代理κB活动(44]。证据也表明NF -之间的相关性κB和DNMT1水平(45]。此外,最近的一项研究显示炎性细胞因子的作用在调节酶的活性参与DNA甲基化和脱甲基作用[46]。鉴于这种相关性,我们分析了小组的水平25人类细胞因子和趋化因子的条件培养基从正常BJ, sBJ文化和媒介在NF -的影响条件κB的活动。条件培养基从sBJ显示高水平的α干扰素(IFN -α)、白细胞介素- 6 (il - 6)和interleukin-8(引发)和单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)相比,条件培养基从正常BJ文化(图3 (d))。的条件培养基sBJ显著增加NF -κ活动在NF - Bκ记者B细胞(图模型3 (d))。

3.6。增加易感性的DAC HCT116 Coculture球状体

信息交互在球状体更接近生理条件,因此是优秀的球状体模型来研究肿瘤基质的影响相互作用对肿瘤细胞对抗癌药物。我们接下来研究的影响正常BJ sBJ成纤维细胞在coculture HCT116 DNA脱甲基1后球状体μM DAC治疗。首先,尽管手机号,BJ成纤维细胞总是占据HCT116包围球状体的中心。GFP-expressing BJ成纤维细胞是可见的只有在大约100年μ米z飞机高度(图4(一)),表明有限的间质瘤细胞接触和底层自分泌和/或旁分泌因子的重要性。类似于2 d文化中,存在大量的正常BJ或sBJ细胞增加HCT116脱甲基在coculture球状体(数字4 (b)和4 (c));然而,这种效果更加明显在sBJ fibroblast-containing球状体(图4 (b))。

接下来,确定条件培养液对DAC-induced HCT116脱甲基,我们对待单作HCT116的球状体1μM DAC的条件培养基从正常BJ和sBJ文化。没有明显sBJ条件培养液对DAC-induced脱甲基在单作球状体(图4 (d))。

鉴于DAC增殖细胞更有效(41),我们决定是否增加脱甲基coculture球状体和球状体的增加增长相关。我们比较的大小HCT116单作球状体与coculture HCT116和正常BJ或sBJ成纤维细胞球状体。结果显示显著增加的大小coculture单作相比球状体(图球状体4 (e))。然而,没有主要区别在1的影响μM DAC coculture球体大小单作相比(图球状体4 (e))。

最近发表的一项研究阐明,尽管细胞衰老逮捕细胞周期计划,衰老的关键信号组件机械,如p16、p21^{waf1 / cip}p53,极度调节干细胞具备干细胞功能,促进癌细胞的47]。因此,我们研究了波形蛋白的蛋白表达水平,EMT的典型表型,激活Wnt /β连环蛋白HCT116排序从coculture HCT116、sBJ球状体。结果表明在HCT116调节波形蛋白的表达从高基质coculture球状体(图4 (f))。结果(图S1和图4 (f))与增加的增长coculture在HCT116具备干细胞sBJ-induced球状体。

4所示。讨论

研究表明潜在的协同效应DNMTIs和放疗治疗实体肿瘤(26,27]。鉴于senescence-inducing财产的辐射,还有待观察是否和/或衰老的基质细胞如何影响肿瘤细胞应对DNMTIs。使用我们的最近开发的DNA脱甲基记者细胞(31日),我们表明,衰老成纤维细胞增加DAC的脱甲基作用HCT116 coculture条件下2 d和球体文化(数字1和4)。此外,增加DNA脱甲基作用比单一栽培基质cocultures表明高易感性的增加HCT116 DAC高基质微环境。DAC脱甲基作用效应的增加不仅仅是限于cocultures包含未照射正常成纤维细胞衰老成纤维细胞的存在也引起类似的效果,虽然小,HCT116 DNA脱甲基2 d和球体的文化。然而,脱甲基作用效果更明显在cocultures HCT116 irradiation-induced衰老成纤维细胞表明p21的表达增加^{waf1 / cip}和p16(图S1,数据1和4)。重复接种报道诱导复制衰老成纤维细胞(48]。增加HCT116 DNA脱甲基作用与未照射cocultures成纤维细胞有可能导致由于presenescent成纤维细胞的存在。这是明显存在的一小部分β-Gal-stained细胞和p21的表达^{waf1 / cip}在未照射BJ细胞(图S1)。

我们的数据也证明了内生的差别fibroblast-induced对这些未经处理的HCT116 DNMT1的水平。此外,数据还显示DAC DNMT1水平的增加效果比单一栽培从cocultures HCT116排序(图2)。让癌细胞γ辐照报道减少种能阻碍DNMT3b DNMT1的蛋白质含量和(49,50]。此外,研究表明,激活核苷类似物与dCK活动(39,51]。我们展示海拔dCK蛋白质水平HCT116 cocultured成纤维细胞,特别是irradiation-induced sBJ文化(图S2)。此dCK水平增加对应DAC脱甲基作用效应的增加在高基质cocultures HCT116(图1)。总的来说,数据显示辐射诱导旁观者效应的潜在作用通过肿瘤基质相声在调节肿瘤细胞的表观遗传变异在基质cocultures高。

据闻基质调节肿瘤细胞的生长,增加他们的侵袭性和转移性属性10]。符合这一点,我们观察到正常和衰老fibroblast-induced HCT116扩散增加2 d和球体cocultures(数字3和4)。由于DAC,像其他抗癌药物,据报道,有更大的影响在积极增殖细胞(41),增加扩散HCT116 2 d和球体cocultures可能使HCT116更容易DAC(数字3和4)。这部分的降低效果所示DAC辐照HCT116(图的可行性3)。

除了cocultures fibroblast-induced效应外,我们还研究了从衰老成纤维细胞条件培养液对HCT116扩散的影响在2 d的文化。结果表明增加文化从衰老成纤维细胞条件培养液对HCT116扩散。然而,从衰老成纤维细胞条件培养液废除DAC影响DNMT1表达在细胞治疗和减少dCK未经处理和DAC-treated HCT116(图S2)。分析衰老成纤维细胞条件培养液显示upregulation促炎细胞因子和趋化因子的水平。这个细胞因子/ chemokine-laden条件中增加了NF -κ活动在NF - BκB细胞A549记者。之间的相关性DNMTIs和NF -脱甲基作用的影响κB在文献中仍是有争议的。而一项研究表明,通过抑制NF - DNMTIs诱导细胞凋亡κB不是由于表观遗传重编程(44),另一项研究表明,增加NF -κB活动会使DNMT1水平(45]。在我们的研究中,我们没有观察到任何直接影响衰老成纤维细胞条件培养液DNMT1的蛋白质含量(图2)。尽管如此,DAC无力减少DNMT1水平细胞治疗从衰老成纤维细胞条件培养液文化(图2)表明DNA脱甲基SASP的潜在负面影响。本研究使用确立细胞株进行文化;因此,进一步的证据主要细胞和DNMT1淘汰赛细胞类型是必需的。检查参与组成分泌腺,分析显然是需要证实NF -之间的相关性κB活动和/或促炎细胞因子和趋化因子在DNA甲基化和脱甲基作用。

5。结论

同意肿瘤基质的预后意义比率在不同的癌症类型,我们的研究结果表明肿瘤基质的潜力比预测的结果DNA-demethylating后生CRC抗癌治疗癌症或其他类型。这项研究进一步增加易感性相关HCT116 DAC由于fibroblast-induced增加扩散和甲基化微分调节,demethylation-regulating衰老基质细胞的酶。总之,该研究提供了证据的衰老细胞基质对CRC cell-induced影响响应对原型的DNA-demethylating药物,DAC。背后的机制还需要进一步的研究来赋予观察基质cell-induced改变DAC-induced DNA脱甲基作用效果。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

没有利益冲突声明。

作者的贡献

Khushboo Agrawal和Viswanath Das 2 d和3 d设计和执行文化的实验导致了概念设计,数据分析和解释,手稿写作。娜塔莉Taborska衰老进行实验和分析数据。Jan古尔斯基和切赫Džubak流式细胞仪进行实验。所有这些作品都是由玛丽安Hajduch计划和监督。阅读和批准所有的作者都最后的手稿。两个Khushboo Agrawal和Viswanath Das同样co-first作者这项工作。

确认

作者感谢Jana Vaclavkova(分子和转化医学研究所)帮助细胞因子分析和Jana Vrbkova(分子和转化医学研究所)进行统计分析。这项研究得到了助学金颁发捷克教育部青年和体育部长(格兰特LO1304号,LM2015091和LM2015064),捷克共和国(TE01020028),技术机构和内部授权机构深造大学(IGA_LF_2016_019)。

补充材料

图S1:辐射增加衰老成纤维细胞的文化。(一)代表图像显示了赫斯特- - -β-Gal-stained未照射(non-IR)的文化和1 -质询辐照(IR)诱导衰老BJ (sBJ)文化。在中间的值β加面板显示的百分比β加积极的细胞。数据意味着±SEM, 井每384孔板从2个独立的实验。20 x客观;酒吧规模:100μm。(b)西方墨迹显示p53的表达,p21^{waf1 / cip}_,未照射(non-IR)和p16在BJ和1 -质询sBJ细胞照射后(IR)。图S2: coculture和条件培养基影响dCK表达式。(一)西方印迹显示dCK表达变化在BJ和HCT116隔绝cocultures HCT116、正常和sBJ细胞在缺乏(−)或存在DAC (+)。(b)的表达变化在DAC-treated dCK HCT116培养条件培养基从BJ或sBJ文化。dCK相对的褶皱表达式β肌动蛋白加载控制如下所示的屁股(a)和(b)从一个实验。(补充材料)

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