PLGA支架和间充质干细胞联合应用于脑组织工程:一种治疗脑损伤的潜在工具

摘要

神经组织工程是脑损伤治疗的重要策略。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)移植已被证实能够促进脑损伤的修复和功能恢复，聚乳酸-羟基乙酸(poly (lactic-co-glycolic acid, PLGA)也被发现具有承载细胞的能力。在本研究中，为了观察PLGA支架在体内和体外支持MSCs和神经元粘附生长的能力，评估PLGA支架对MSCs增殖和神经分化的影响，本研究进行了以下步骤。首先，培养MSCs和神经元，用绿色荧光蛋白(GFP)标记或其他标记，合成PLGA支架。接下来，将MSCs和神经元接种在PLGA支架上，观察其黏附率，并采用MTT法评价MSCs的增殖情况。神经诱导培养基诱导MSCs后，分别用扫描电镜(SEM)和免疫细胞化学方法检测MSCs的形态变化和神经分化情况。最后通过免疫组化、核染色和扫描电镜观察PLGA支架在体内的细胞迁移和粘附情况。实验结果表明，PLGA不干扰MSCs的增殖和神经分化，MSCs和神经元可在PLGA支架中生长和迁移。这些数据表明MSC-PLGA复合物可作为脑损伤的组织工程材料。

1.介绍

近年来，组织工程的发展为组织损伤的修复提供了一种新的策略。组织工程的核心是构建由生物材料和细胞组成的新型组织替代品，促进生物功能的恢复和维持[1，2］．生物材料不仅为细胞的粘附、生长和迁移提供了三维空间，而且还形成了可调节的细胞获取营养和排泄废物的微环境[3.］．用于神经组织工程的生物材料主要分为5类:人工合成不可降解材料、不可降解复合管道、天然生物材料、可生物降解复合材料、可生物降解高分子材料。

聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)是一种生物可降解的高分子材料，可通过改变共聚物中乳酸和羟基乙酸的比例来调节其降解时间。PLGA与PLA: PGA的比值为75:25时，PLGA在体液(pH 7.2)中表现出良好的稳定性，降解率为9% ~ 12%左右，在大鼠胸椎脊髓横断损伤后，植入PLGA支架的轴突可再生[4］．间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)在特定的培养条件下可分化为神经元样细胞，具有神经元的一些电生理特性[5- - - - - -7，这使它们成为一种治疗神经组织损伤的种子细胞。本研究的目的是评估MSC-PLGA支架复合体是否是治疗脑损伤的潜在工具。

2.材料和方法

2．1．间充质干细胞的制备与标记

选用2个月大的成年大鼠和1天大的新生SD大鼠(西南医科大学动物屋中心)。动物使用程序按照国家科技部制定的《实验动物护理使用指导意见》执行。取2月龄大鼠股骨骨髓腔内的骨髓。采用密度梯度离心法和贴壁培养法从骨髓中分离纯化MSCs，采用α -最低必需培养基(α-MEM) (HyClone)添加10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素(Gibco)。当培养的细胞融合时，重悬并传代。

为了便于观察MSCs在PLGA支架或大脑中的生长和迁移，如前所述，用绿色荧光蛋白(GFP)标记MSCs [8］．简单地说，我们扩增了先前冷冻的腺病毒(pAdEasy-1-pAdTrack巨细胞病毒)，该病毒含有GFP基因。当第三代MSCs生长到70-80%汇合时，加入腺病毒溶液，在37℃，5% CO2培养箱中孵育2天，荧光显微镜下MSCs呈现绿色荧光。然后收集细胞用于后续实验。

2．2.神经元的制备与鉴定

如前所述，皮质神经元取自1天大的新生大鼠[9］．将新生大鼠斩首，将大脑皮质转移到PBS中。去除脑膜和血管后，将组织切成小块，在0.25%胰酶- edta溶液(Beyotime)中37℃孵育20分钟。然后加入20%胎牛血清的LG-DMEM终止孵育。800 rpm离心10分钟后，收集细胞用于后续实验。

皮质神经元用含有1% (vol/vol)神经元生长补充物(Sciencell)的神经元介质(Sciencell)分散，然后以5 × 10的密度播种⁵在6孔板中预涂聚l -赖氨酸(Corning)。培养液每3天更换1次，7天后用4%甲醛固定细胞，免疫细胞化学鉴定神经元。

2．3.PLGA支架的制备

如前所述，采用室温成型/颗粒浸出法合成PLGA [8］．简而言之，将75%的乳酸和25%的乙醇酸溶解在二氯甲烷中，与80 ~ 120的过筛氯化钠颗粒混合μm.将混合物倒入模具中，形成5cm × 5cm × 0.2 cm的圆盘。压力成型24小时后，取出支架盘，浸泡在去离子水中释放氯化钠颗粒，将支架干燥保存在真空塑料袋中使用。

2．4．细胞在PLGA支架上的粘附

将PLGA支架切成1cm × 1cm × 0.2 cm的小块。后者在75%酒精中浸泡2小时，然后用无菌水冲洗3次，置于干净的工作台中干燥;然后将无菌PLGA支架置于24孔培养板中。MSCs和神经元以1 × 10的密度接种在支架上⁵在标准细胞培养条件下，每个支架在相应的培养基中培养细胞。3 d后，去除培养基，胰酶消化收集支架和孔上的细胞，计数为和 ，分别。计算MSCs和神经元在支架上的粘附率如下:

2．5．MTT试验

根据MTT细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒(Beyotime)说明书，采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)法检测PLGA对MSCs体外增殖的影响。简单地说，将MSCs以1 × 10的播种量播种在PLGA支架上⁵24孔培养板每孔支架(1 cm × 1 cm × 0.2 cm)培养48小时。对照组除省略PLGA支架外，处理方法与对照组相同。用新鲜培养基替换培养基24小时。每孔加入MTT反应液，37℃孵育4小时。取出所有井的培养基后，在每孔中加入福玛赞溶解液，37℃孵育4小时。将所有孔上清液转移到96孔培养板上，用酶标仪在570 nm处测定各孔的吸光度。

2．6．骨髓间充质干细胞的神经元诱导

将MSCs接种于盖玻片和PLGA支架上，置于24孔培养板中α-MEM添加10% FBS (HyClone)。3天后，用预诱导液替换培养基α-MEM, 10%胎牛血清，1 mmol/lβ巯基乙醇(β-ME) 24小时。接着是由α-MEM, 1 mmol/lβ-ME、2%二甲基亚砜(DMSO)和1μmol/l全反式维甲酸(RA) (Sigma) 6小时。将5个覆盖层和5个PLGA支架用4%多聚甲醛(PFA)在磷酸盐缓冲盐水中固定，并将支架切成15块μ米的部分。通过免疫细胞化学方法观察PLGA支架对MSCs分化的影响。5个支架进行移植，5个支架用4%戊二醛固定进行扫描电镜(SEM)。

2.7。PLGA支架移植

创伤性脑损伤(TBI)模型如前所述生成[10］．简单地说，2个月大的大鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，然后俯卧位固定在立体定位架(Stoelting)上。头皮切开后，钻取右侧顶骨。双切口暴露前脑，用手术刀在脑内造出缺损区域(3mm × 3mm × 2mm)。将PLGA支架或MSC-PLGA支架复合物置入脑内，缝合创面。TBI后第14天，深度麻醉处死大鼠(5只/组)，取大鼠脑组织，取PLGA支架及MSC-PLGA支架复合物进行扫描电镜观察。其余大鼠经心灌注0.9%生理盐水后，再灌注4%的冰性PFA。取出大脑，用4%的PFA固定24小时。然后用30%蔗糖溶液脱水，包埋于组织冷冻培养基中，切成连续冠状切片(15μm厚度)，用冷冻切片机(徕卡)进行核染色和免疫组化染色。

2.8。扫描电子显微镜

采用扫描电子显微镜(S-3400N, Hitachi, Japan)观察PLGA支架的特点及附着细胞的形态。成像之前，在支架上培养或生长的细胞用4%戊二醛固定，通过分级丙酮系列脱水，然后镀上金溅射。样品在10kv加速电压下进行检测。

2.9。免疫组织化学

细胞切片或冰冻切片用0.3% Triton X-100处理，然后用8%山羊血清阻断。在用包括β使用抗兔/小鼠IgG (Alexa Fluor®488/Fluor 594偶联物)(1200稀释;细胞信号转导技术(Cell Signaling Technology))， 37°C孵育30min，然后用Hoechst染色。除一抗被省略外，阴性对照也同样处理。

2.10。统计分析

所有体外细胞实验均重复3次，使用SPSS 18.0软件进行分析。数据以均数±标准误差(SE)表示，采用单因素方差分析进行统计比较。一个值< 0.05认为有统计学意义。

3.结果

3．1.培养细胞的形态学特征

原发性间充质干细胞在12小时内开始粘附，3-4天后呈现圆形、多边形或梭形(图)1(一))．第3代间充质干细胞表现出明显的均匀性(图1 (b))，在荧光显微镜下用腺病毒激发的绿色荧光感染(图1 (c))．初级皮层神经元在3天内突起更少、更短(图)1 (d))．随后出现了许多神经突，在第7天形成了许多神经网络(图)1 (e))，表现积极β-微管蛋白免疫细胞化学染色(图1 (f))．

３．２．MSCs和神经元在PLGA支架上的附着

采用液体置换的方法，PLGA支架的孔隙体积接近90%，并且通过SEM直接显示的PLGA支架内部孔隙相互连通(图)2(一个)和2 (b))．MSCs和神经元培养5d后，发现大量细胞在PLGA支架表面粘附延伸，细胞呈扁平状相互连接(图)2 (c)- - - - - -2 (e))．接种后第3天，MSCs和神经元在PLGA支架上的黏附率分别为97.4%和96.5%，两组间差异无统计学意义(图)2 (f))．

3．3．PLGA支架对间充质干细胞体外分化和增殖的影响

诱导后，骨髓间充质干细胞呈神经元样形态，胞体肿胀，胞突细长，可见细胞间边界(图)3(一个))．诱导的MSCs能表达神经元标记物(MAP2)，且MAP2表达率均高于诱导的MSCs⁺PLGA支架组与对照组间充质干细胞无明显差异(图)3 (b)，3 (d),3 (e))．此外，MTT法评价PLGA支架上培养的MSCs的增殖情况，在培养7天后，PLGA组MSCs与对照组MSCs的吸光度相似( )(图3 (c))．这些结果表明PLGA支架在体外对MSCs的增殖和神经元分化没有影响。

3．4．PLGA在体内的结构

脑外伤后14天采用核染色形态学观察PLGA的结构。在显微镜下，移植的PLGA支架与PLGA支架组的组织结构明显不同(图)4(一)-4(c))和MSC-PLGA支架组(图4(d) -4(f))。前者组织结构较松散，间隙较大;后者组织结构较紧凑，间隙较小。

3．5.PLGA支架在体内的细胞迁移和粘附

TBI后14天PLGA支架移植入脑后，部分细胞迁移至PLGA，包括胶质细胞(图)5(一个))和神经元(图5 (b))．当MSC-PLGA支架复合体植入脑内时，MSCs可以向邻近脑区迁移(图)5 (c))．此外，我们发现MSC-PLGA支架复合物比PLGA支架具有更好的粘附能力(图)6(一)和6 (b))．结果提示，plga混合MSCs更有利于细胞粘附和迁移，脑组织与支架的结合更紧密。

4.讨论

生物材料支架与种子细胞的相容性是构建工程组织和器官的核心问题。作为细胞载体和外源性移植物的生物材料支架应对细胞生长和分化有积极作用或无明显副作用，植入后应伴有良好的生物相容性和易于体内降解[11，12］．PLGA因其生物相容性和生物降解性而被用作药物载体[13，14］．来自自体组织的种子细胞用于构建工程组织是较好的选择。MSCs可从自体组织中获得，且易于分离、体外扩增，诱导分化为神经元细胞、脂肪细胞、成骨细胞、肌细胞等细胞类型，因而受到广泛关注[15- - - - - -18］．在本研究中，我们发现PLGA不干扰MSCs的增殖和神经分化。

细胞的粘附和迁移特性会影响细胞的增殖、分化和功能[19，20.］．为了实现细胞支架的功能，细胞载体必须保证种子细胞与宿主细胞的良好粘附、生长和繁殖。在目前的工作中，PLGA支架在体内和体外均能够支持MSCs和神经元的3D生长，神经诱导的MSCs仍然可以粘附在PLGA支架上。既往研究表明MSCs可分泌多种细胞外基质、神经营养因子、细胞粘附因子[21，22]， MSCs移植可促进中枢神经系统损伤的修复[23，24］．我们发现MSC-PLGA复合体的移植比单纯PLGA支架的移植更完整。总之，我们的研究结果表明MSC-PLGA可以作为神经组织工程的合适移植物，但其在体内的生物学特性值得进一步研究。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

两位作者宣称没有相互竞争的利益。

作者的贡献

周凌和图江一对这篇文章贡献相同。

致谢

四川省教委科学基金项目(no . 18ZA0516);四川省科技厅与泸州市人民政府、泸州医学院联合研究项目(no . 14JC0140)。关键词:岩石力学，数值模拟，数值模拟，数值模拟作者感谢廖燕生对实验方法的建议。

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