SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2018/5024175 5024175 研究文章 结合PLGA支架和msc对大脑组织工程:一个潜在的治疗脑损伤的工具 周 凌 1 你 Jiangyi 2 方 Guangbi 2 邓 李 2 3 http://orcid.org/0000 - 0003 - 2000 - 6269 高 小青 2 3 郭 康ydF4y2Ba 3 香港 Jiming 4 Lv 京 3 关 Weikang 3 http://orcid.org/0000 - 0002 - 7462 - 6423 杨 朝鲜族 2 3 兰格 Andrzej 1 内分泌系 附属医院 西南医科大学 太平街 646000年泸州 中国 swmu.edu.cn 2 解剖学系 西南医科大学 中山路 646000年泸州 中国 swmu.edu.cn 3 系神经生物学 基础医学研究中心 西南医科大学 中山路 646000年泸州 中国 swmu.edu.cn 4 人体解剖学和细胞科学 医学院的 曼尼托巴大学 温尼伯 MB 加拿大 umanitoba.ca 2018年 5 8 2018年 2018年 02 03 2018年 26 06 2018年 12 07年 2018年 5 8 2018年 2018年 版权©2018年灵周et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

神经组织工程是一个重要的脑损伤的治疗策略。间充质干细胞(MSC)移植已被证明能够促进脑损伤修复和功能恢复,和聚(lactic-co-glycolic酸)(PLGA)也被发现有轴承细胞的能力。在目前的研究中,观察PLGA支架的能力支持msc和神经元的附着生长在体内和体外的影响评估PLGA支架msc的增殖和神经分化,本研究进行下面的步骤。首先,msc和神经元培养,用绿色荧光蛋白(GFP)标记或识别和PLGA支架合成。接下来,msc和神经细胞接种在PLGA支架及其粘附率调查和msc的增殖利用MTT试验评估。msc诱导的神经感应介质后,msc的形态变化和神经分化使用扫描电子显微镜(SEM)和免疫细胞化学检测,分别。最后,细胞迁移和粘附在PLGA支架在体内被免疫组织化学检查,核染色、扫描电镜。实验结果表明,PLGA不干扰msc的增殖和神经分化,msc和神经元生长和迁移在PLGA支架。这些数据表明,MSC-PLGA复杂可以作为组织工程材料用于脑损伤。

 泸州市人民政府和泸州医学院 14 jc0140 四川省科技部门 四川省教育委员会 18 za0516 1。介绍

近年来,组织工程学的发展提供了一个新的战略组织损伤的修复。组织工程的核心是构建新组织组成的替代品生物材料和细胞促进生物功能的恢复和维护( 1, 2]。生物材料不仅为细胞粘附提供三维空间,增长,移民也形式可调微环境细胞的营养获得和废物排泄( 3]。神经组织工程生物材料用于主要可以分为5类:人工合成的非生物降解的材料,非降解性复合管道,天然生物材料,生物降解复合材料,可降解高分子材料。

保利(lactic-co-glycolic酸)(PLGA)是一种生物可降解高分子材料的降解时间PLGA的比例可以调整仅仅通过改变乳酸和羟基乙酸共聚物为特定的应用程序。PLGA比例为75:25的解放军:PGA表现出极大的稳定体液pH值(7.2)的最优降解率(9%到12%),和轴突再生的PLGA支架植入老鼠受到胸脊髓横断损伤( 4]。间充质干细胞(msc)分化成neuron-like细胞在特定的文化条件下和有一些神经元的电生理特性 5- - - - - - 7),这使得它们的种子细胞治疗神经组织损伤。本研究的目的是评估是否MSC-PLGA脚手架复杂是一个潜在的治疗脑损伤的工具。

 2。材料和方法 2.1。准备和msc的标签

两个成人和新生的雄性SD (SD)中已经老鼠(动物屋中心,西南医科大学)被用于这项研究。程序使用动物是按照指导建议实验室动物保健和使用的科学技术部规定的中国。骨髓是来自丽江大鼠的股骨骨髓腔。msc被分离和纯化骨髓密度梯度离心法和贴壁培养方法,他们用alpha-minimum基本培养基培养( αmem) (HyClone)补充10%的边后卫,100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升(Gibco)。当培养细胞汇合的,他们resuspended和亚文化。

促进生长和迁移的观察msc的PLGA支架或大脑,msc与绿色荧光蛋白(GFP)标记(如前所述)( 8]。短暂,我们放大之前冻结的腺病毒(pAdEasy-1-pAdTrack巨细胞病毒),含有GFP基因。当第三通道融合msc增加到70 - 80%,腺病毒解决方案是补充说,这是紧随其后的是在一个孵化器孵化2天(37°C, 5%二氧化碳),和msc在荧光显微镜下显示绿色荧光。然后后续实验的细胞被收获。

 2.2。准备和神经元的识别

皮质神经元从已经准备新生大鼠如前所述[ 9]。新生大鼠被斩首,脑皮质被转移到PBS。切除脑膜和血管后,组织被切成小块,其次是孵化trypsin-EDTA 0.25%解决方案(Beyotime) 37°C 20分钟。然后用20%胎牛血清加入LG-DMEM终止孵化。在800转离心10分钟后,细胞进行后续实验。

皮质神经元与神经介质分散(Sciencell)和1%(卷/期)神经元增长补充(Sciencell),然后他们被播种密度的5×105/毫升到盖玻片预镀与poly-L-lysine 6-well板块(康宁)。媒介取代每隔3天,7天之后,这些细胞被固定为4%甲醛和用于识别神经元通过免疫细胞化学。

 2.3。制造的PLGA支架

的PLGA合成了室温成型/粒子沥滤法之前的描述( 8]。简而言之,75%乳酸和25%乙醇酸溶解在二氯甲烷和与渗氯化钠混合粒子从80年到120年不等 μm。混合物倒在模具形成光盘(5厘米×5厘米×0.2厘米)。成型压力下24小时后,光盘取出,沉浸在去离子水释放氯化钠粒子和支架真空干燥和保存在一个塑料袋在使用前。

 2.4。细胞粘附在PLGA支架

切成块的PLGA支架(1厘米×1厘米×0.2厘米)。后者是浸泡在75%的酒精2小时,然后用无菌水冲洗3次在洁净工作台和干;之后,无菌PLGA支架被置于24-well文化板块。msc和神经元被播种在支架1×10的密度5细胞/支架在相应标准的细胞培养条件下介质。3天之后,文化媒介被移除和支架上的细胞和富国被胰蛋白酶消化,算作收集 n P l G 一个 和 n w e l l ,分别。msc和神经元的粘附率支架计算如下: (1) r = n P l G 一个 n P l G 一个 + n w e l l × One hundred. % 。

2.5。MTT试验

的影响PLGA msc在体外的增殖是评估通过使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑试验(MTT)说明书的基础上MTT细胞增殖和细胞毒性试验设备(Beyotime)。简而言之,msc被播种在PLGA支架在播种1×10的浓度5细胞/支架(1厘米×1厘米×0.2厘米)每口井的24-well培养板培养48小时。对照组相同处理,除了PLGA支架被省略了。培养基被替换为新的媒介24小时。然后MTT反应的解决方案是添加到每一个,和下一个板是孵化4小时37°C。所有井的媒介被移除后,甲瓒溶解溶液添加到每个在37°C,孵化4小时。所有井的上层清液转移到96孔培养板,和吸光度的测定标在570海里。

 2.6。神经诱导msc

msc被播种在盖玻片和PLGA支架24-well培养板中 αmem补充的边后卫(HyClone)为10%。3天后,媒介是取代入伍前的解决方案组成 αmem 1 10%的边后卫,更易与l β巯基乙醇( β加)24小时。其次是由神经感应介质 αmem 1更易与l β加,2%二甲亚砜(DMSO)和1 μmol / l all-trans维甲酸(RA)(σ)6小时。盖玻片和5 PLGA支架固定在4%多聚甲醛(PFA)在磷酸盐和支架是切成15 μ米的部分。盖玻片和部分被用来观察PLGA支架的影响通过免疫细胞化学在msc分化。支架是申请移植和5支架固定4%戊二醛用于扫描电子显微镜(SEM)。

 2.7。PLGA支架移植

创伤性脑损伤(TBI)模型生成如前所述[ 10]。简而言之,一个2个月大鼠与1%戊巴比妥钠麻醉(40毫克/公斤)通过腹腔内管理,然后固定在一个立体框架(Stoelting)卧姿。头皮切口后,一块右顶骨被开采。双切口暴露前脑,和缺陷区域(3毫米×3毫米×2毫米)创建与大脑的手术刀。PLGA支架插入或MSC-PLGA脚手架复杂的大脑,缝合伤口。创伤性脑损伤后14天,老鼠(5 /组)被深麻醉,他们的大脑被移除,然后PLGA支架和SEM MSC-PLGA脚手架复杂的拍摄。其他老鼠灌注transcardially PFA 0.9%盐水其次是冰冷的4%。4%的大脑取出和后缀PFA 24 h。然后他们脱水以30%蔗糖溶液中,嵌入在组织冰冻的媒介,切成连续冠状部分(15 μ米厚度),冷冻切片机(莱卡)核染色和免疫组织化学染色。

 2.8。扫描电子显微镜

扫描电镜(s - 3400 n、日立、日本)被用来观察PLGA支架的特点和细胞的形态。成像之前,细胞培养或种植在支架与4%戊二醛固定,通过一系列分级丙酮脱水,然后溅射镀黄金。样本研究10 kV的加速电压。

 2.9。免疫组织化学

细胞的幻灯片或冻结部分处理0.3% Triton x - 100然后阻塞山羊血清为8%。孵化后,主要包括的抗体 β微管蛋白(1:100稀释,Abcam), microtubule-associated protein-2 (MAP2)(1: 100稀释,Abcam),或胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)(1: 200稀释,σ)一夜之间在4°C,样本处理anti-rabbit /鼠标免疫球蛋白(Alexa萤石®488 /萤石594共轭)(1200稀释;细胞信号技术)为30分钟37°C,然后与赫斯特染料染色。负控制相同处理,除了主要的抗体被省略了。

 2.10。统计分析

体外细胞实验都是重复三次,使用SPSS 18.0软件的分析窗口。并给出了数据意味着±标准错误(SE),并使用单向方差分析进行统计比较。一个 P 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

 3所示。结果 3.1。培养细胞的形态学特征

主msc开始坚持在12小时内提出,多边形或纺锤形状(图3 - 4天之后 1(一))。第三通过msc显示明显的一致性(图 1 (b)),他们感染adenovirus-lighted荧光显微镜(图下绿色荧光 1 (c))。主要的皮质神经元显示越来越短的突起(图3天内 1 (d))。然后许多出现神经突,形成许多神经网络在第七天(图 1 (e)),并提出了积极的 β微管蛋白通过免疫细胞化学染色(图 1 (f))。

msc和神经元的形态学特征。(一)主msc培养4天。(b) 3 rd-passage msc培养了2天。(c)的msc感染腺病毒2天是亮绿色荧光。(d)的主要神经元培养3天,7天(e)。(f)的识别神经元通过疣状 β微管蛋白。酒吧= 50 μm。

 3.2。附件的msc和神经元PLGA支架

孔隙度的PLGA支架接近90%的体积通过使用液体替代方法,和内部气孔的PLGA支架直接通过SEM是积极的(数据可视化 2(一个)和 2 (b))。msc和神经元的培养5天后,发现了大量的细胞粘附和扩展表面的PLGA支架和细胞持平,彼此连接(数字 2 (c)- - - - - - 2 (e))。在接种后第3天,msc的粘附率和神经细胞在PLGA支架分别为97.4%和96.5%,分别和两组之间没有显著差异(图 2 (f))。

PLGA支架和细胞粘附。(一)PLGA支架。(b)扫描电镜成像的PLGA支架。酒吧= 100 μm。(c)扫描电镜成像的神经元PLGA支架。酒吧= 10 μm。(d) msc在PLGA支架被点燃的绿色荧光。酒吧= 50 μm。(e)扫描电镜成像的msc PLGA支架。酒吧= 10 μm。(f)的粘附率msc和神经元在PLGA支架。

 3.3。的影响PLGA支架msc在体外分化和增殖

感应后,msc送给neuron-like形态学膨胀细胞体和细长的过程,和细胞间界限成为体现(图 3(一个))。诱导msc可以表达神经元的标记(MAP2), MAP2+msc在PLGA支架组没有显著不同的价格相比对照组(数字 3 (b), 3 (d), 3 (e))。此外,MTT试验被用来评估msc的增殖培养的PLGA支架和msc显示类似的吸光度的PLGA和控制组织孵化后7天( P < 0.05 )(图 3 (c))。这些结果表明,PLGA支架不干扰msc在体外的增殖和神经元分化。

的影响PLGA支架msc在体外分化和增殖。(一)扫描电镜成像的诱导msc在PLGA支架。酒吧= 10 μm。(b)的速度MAP2-positive神经诱导后细胞在msc。(c) msc的增殖在盖玻片和PLGA支架。对照组(d)和PLGA支架组(e):绿色荧光显示msc在体外。神经元(MAP2积极)沾着红色荧光。黄色荧光显示绿色和红色的colocalization,从而表明msc的分化。酒吧= 50 μm。

 3.4。PLGA体内的结构

PLGA的大脑结构进行形态观察与核染色在创伤性脑损伤后14天。在显微镜下,组织组织移植PLGA支架之间独特的PLGA支架组(数字 4(一)- 4(c))和MSC-PLGA支架组(数字 4(d) - 4(f))。在前,组织结构是宽松和间隙空间大,而更紧凑的结构和更小的空间可以观察到后者。

PLGA支架的结构变化与创伤性脑损伤的大脑。(一)过程观察PLGA支架与创伤性脑损伤大脑。(b)核染色显示了大脑中种植PLGA支架。酒吧= 500 μm。(c)的放大图片广场(b)的框架。PLGA支架概述地区(虚线)。酒吧= 200 μm。(d)过程观察MSC-PLGA脚手架在大脑中复杂的创伤性脑损伤。(e)核染色显示了种植MSC-PLGA脚手架复杂的大脑中。酒吧= 500 μm。(f)的放大图片广场(e)的框架。MSC-PLGA脚手架概述地区复杂(虚线)。酒吧= 200 μm。

 3.5。细胞迁移和粘附在PLGA支架体内

移植后的PLGA支架进入大脑在创伤性脑损伤后14天,有些细胞迁移到PLGA,包括胶质细胞(图 5(一个)(图)和神经元 5 (b))。MSC-PLGA脚手架复杂时植入大脑,大脑msc可以迁移到邻近的区域(图 5 (c))。此外,我们发现,细胞可以坚持更好MSC-PLGA脚手架上复杂的比PLGA支架(数字 6(一)和 6 (b))。结果表明PLGA-mixed msc更有利于细胞粘附和迁移,因此,脑组织和支架的结合紧密。

细胞迁移的PLGA支架与创伤性脑损伤大脑。(一)星形胶质细胞(箭头)沾anti-GFAP(红色)在PLGA支架迁移。(b)神经元(箭头)沾anti-MAP2(红色)在PLGA支架迁移。(c) msc(绿色箭头)迁移MSC-PLGA脚手架的复杂。“☆”显示了PLGA支架或MSC-PLGA脚手架复杂的大脑中,而虚线表明支架的边界。酒吧= 50 μm。

大脑细胞的粘附在PLGA支架与创伤性脑损伤。(一)扫描电镜成像PLGA支架上的细胞的粘附。(b)扫描电镜成像MSC-PLGA支架上的细胞的粘附复杂。酒吧= 5 μm。

 4所示。讨论

生物材料支架和种子细胞之间的兼容性是一个核心问题,构建工程组织和器官。生物材料支架作为细胞载体和外生移植应该有一个积极的作用对细胞生长和分化的或没有明显的副作用,而且应该伴随着良好的生物相容性和容易降解体内植入后( 11, 12]。PLGA一直作为药物载体因其生物相容性和生物降解 13, 14]。种子细胞来源于自体组织用于构建组织工程是最好的选择。msc收到了广泛的关注,因为他们可以从自体组织和获得容易分离,扩大体外,并进一步诱导分化成神经细胞,脂肪细胞,成骨细胞,细胞和其他细胞类型( 15- - - - - - 18]。在这项研究中,我们发现PLGA不干扰msc的增殖和神经分化。

细胞粘附和迁移特性将影响扩散,细胞的分化和功能( 19, 20.]。实现的功能细胞支架,细胞载体应确保良好的附着力,生长和繁殖的种子细胞和宿主细胞。在目前的工作,优势表明,PLGA支架能够支持3 d增长msc和神经元体内和体外neural-induced msc仍然可以坚持PLGA支架。之前的研究表明,msc能分泌各种细胞外基质,神经营养因子、细胞粘附因子( 21, 22)和msc移植能促进中枢神经系统损伤的修复 23, 24]。我们发现MSC-PLGA复杂的移植了受损的大脑比简单的PLGA支架更加完整。总之,我们的结果表明,MSC-PLGA可能用于合适的移植神经组织工程,但其生物特性体内值得进一步研究。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 作者的贡献

凌Jiangyi周和要你的贡献同样的文章。

 确认

这项工作是支持的研究项目的科学基金会中国四川省教育委员会(18 za0516)的联合研究项目四川省科学技术和泸州市人民政府和泸州医学院(14 jc0140)。作者感谢廖Yansheng实验方法上的建议。

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