神经干细胞条件培养液改善大鼠脑缺血再灌注损伤

摘要

介绍。我们之前的研究表明NSC-CM(神经干细胞条件培养基)抑制细胞凋亡体外。此外，许多研究表明，神经营养因子和微粒子分泌到条件培养基中NSCs具有神经保护作用。因此，我们推测NSC-CM具有保护脑I/R损伤的能力。方法。脑中动脉闭塞术造脑I/R损伤动物模型的成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组和nsc - cm治疗组。缺血后3小时、24小时、48小时，尾静脉缓慢给药1.5 ml NSC-CM或PBS(磷酸盐缓冲盐水)。结果。NSC-CM显著改善神经功能缺损和减少脑梗塞体积，伴有保存线粒体的超微结构。此外，我们还发现，在缺血侧即NSC-CM显著抑制细胞凋亡经由改善的Bcl-2（B细胞淋巴瘤-2）的表达。结论。NSC-CM可能是缺血性脑卒中的一种有效的替代治疗手段。

1.介绍

缺血性中风被认为是世界上致残的主要原因和第二大死亡原因[1]。迄今为止，组织纤溶酶原激活剂(tPA)仍是唯一有效的治疗方法。但治疗窗口狭窄(4.5 h)，颅内出血风险较高，限制了tPA的临床应用[1]。此外，尽管在细胞培养和动物中风模型中，所有这些药物都被证明分别能减少神经元细胞死亡和梗死面积，但在临床试验中，在患者身上测试的神经保护药物因副作用和/或低疗效而被证明失败[1]。因此，我们需要寻找新的治疗策略来治疗缺血性脑卒中。

近年来，干细胞治疗特别是神经干细胞治疗在缺血性脑卒中的治疗中越来越受到人们的关注。已有研究证明，NSCs可通过直接作用(神经元替代)促进神经系统恢复[2]和间接旁观者动作分泌BDNF [3.[](脑源性神经营养因子)，抑制炎症过程，促进神经内膜形成[4]）。但是，原有的资源，成活率低，和神经元分化率[5]以及潜在的肿瘤形成的神经干细胞[6限制了其临床应用。因此，基于干细胞的治疗并不是缺血性中风的理想治疗干预。然而，有报道称NSCs可释放多种神经营养因子，如BDNF [7， GDNF(胶质细胞源性神经营养因子)，NT-3(神经营养因子-3)[8]，以及其它可溶性因子，以及微泡（MVS）9在一个培养条件的培养基中。此外，还有未知的神经营养因子和未降解的有丝分裂因子，如:bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)和EGF(表皮生长因子)。特别是低循环浓度的BDNF与缺血性脑卒中的长期功能预后差有关[10]，而鼻内BDNF免受脑I / R损伤[11]。此外，GDNF和NT-3已被证实对脑I/R损伤具有神经保护作用[12,13]。

微泡是一种纳米大小的、膜结合的小泡，从细胞中释放出来，可以在细胞间运输包括DNA、RNA和蛋白质在内的货物，作为细胞间通讯的一种形式。MVs是NSCs在发育过程中在培养基中释放的，被证实对神经损伤起保护作用，调节神经活动，在神经系统的发育和功能中发挥重要作用[9,14,15]。这些来自干细胞的MVs基因信息被证实可以修复受损组织而不直接替换细胞[16]。已经证实，有在缺血性中风的患者的损伤体积和NSC衍生的MV之间的负相关[17]，提示NSC衍生的MV的该移植能减少脑梗塞体积。此外，先前的研究还表明，从人NSCs的MV能够削弱神经炎症和照射脑保护主机神经元形态[18]。此外，将NSC- cm移植到损伤的小鼠大脑中，不仅可以使脑室下区NSC数量扩大，还可以促进新神经元的形成并迁移到损伤部位[19]。NSC-CM被证实具有将间充质干细胞诱导成神经干细胞样细胞的能力体外(20]，这进一步表明NSC-CM可以提高endoneurogenesis。更重要的是，NSC-CM能显著衰减神经细胞凋亡后脊髓损伤的保护作用[21]。我们之前的研究也表明，NSC-CM显著抑制了ra分化的SH-SY5Y细胞的凋亡，增强了神经元的分化体外(22]。因此，我们推测NSC-CM可能具有保护脑I/R损伤的能力。

因此，在本研究中，我们测试了静脉注射NSC-CM是否能改善大鼠脑缺血再灌注(I/R)损伤引起的神经功能恢复和脑梗死体积的减少。此外，我们试图探讨NSC-CM对大鼠脑I/R损伤可能的神经保护机制。

2。材料和方法

2.1。NSC-CM（神经干细胞条件培养基）的制备

本研究中所有的动物实验方案和程序均经山东大学动物实验伦理委员会指导方针的审查和批准。E15-18孕鼠Sprague-Dawley (SD)购自山东中医药大学动物研究中心，用于分离神经干细胞(NSCs)。NSCs的分离和培养方法按照Kim等的方案进行[23]，并根据我们以前提供的协议执行的处理收集NSC-CM的详细方法22]。总之，E15-18 SD大鼠皮层区域分离，并脑膜被剥离干净的长椅上。The cortexes were transferred to a 15 ml conical tube containing 3 ml HBSS (Hanks balance salt solution) for 5mins, then dissociated into small pieces using a 1 ml pipette tip. 3 ml HBSS containing small pieces of cortexes was filtered by 100 nm filters and centrifuged at 1000 RPM在RT（室温）10分钟，以得到单细胞。After that, the cells were resuspend in a completed culture medium including DMEM/F12 (Invitrogen, CA, USA), human recombinant epidermal growth factor (EGF; 20 ng/ml) and basic fibroblast growth factor (bFGF; 20 ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), B27 (serum-free medium supplements formulated to provide optimal growth condition for NSC expansion, 1 : 50; Invitrogen), heparin (5 μ克/毫升;Sigma, St Louis, MO, USA), 2 mM L-glutamine, and an antibiotic-antimycotic mixture (1 : 100; Invitrogen, 10,000 u/ml penicillin, 10,000 μg/ml链霉素，25μ克/ ml两性霉素B）。使用台盼蓝中的悬浮液中的活细胞的数量进行评价，并且将悬浮液的细胞密度调整为210⁵细胞/毫升。然后，将细胞悬液接种到含有15 ml完整培养基的T-75烧瓶中，温度为37℃，CO为5%₂-湿润孵化室(Fisher，宾夕法尼亚州匹兹堡市)，为期4天。4天后，将单细胞克隆成NSC球状体，用新鲜的完全培养基更换培养基。每3天更换7.5 ml新鲜的完整培养基。每2周，我们将较大的神经球粒切成小球粒，在显微镜下观察(日本Olympus)。在每个培养基变化时，我们收集大鼠NSC条件培养基，通过孔径为0.4的膜过滤μ直径m (Millipore, Billerica, MA, USA)。过滤后的培养基以1000 RPM离心在RT下10分钟。在那之后，我们观察到显微镜下的媒体，以确保没有细胞污染。神经干细胞的条件培养基保持在4℃下7天。

2.2。动物模型制备及治疗

雄性大鼠( ) 150-200克，购自山东中医药大学动物研究中心(中国济南)。这些动物被置于标准的实验室条件下，保持在温度和湿度受控的房间中，按12小时/12小时的光/暗循环，并可以自由获得食物和水。本组之前描述的脑缺血/再灌注(I/R)损伤引起的大脑中动脉闭塞(MCAO) [24]。Briefly, the rats were anaesthetized by 10% of chloral hydrate (3 ml/kg BW, i.p.) and the right carotid bifurcation, the right common carotid artery (CCA), the right internal carotid artery (ICA), and the right external carotid artery (ECA) were exposed to the performer by a ventral neck incision. The monofilament nylon with a silicone-beaded tip (Sunbio Biotech, Beijing), 0.28 mm in diameter, was labeled at 18 mm to the silicone-beaded tip before inserting into the right ICA. The monofilament nylon was inserted into the right ICA until resistance was felt at 16–20 mm from the bifurcation of the right CCA. The monofilament nylon was then fixed and carefully withdrawn after 90 min of middle cerebral artery occlusion to permit reperfusion. Throughout the procedure, body temperature was maintained at 37 ± 0.5°C with a thermostatically controlled infrared lamp. The cerebral ischemia/reperfusion rats were randomly divided into 2 groups. One group was slowly administrated with 1.5 ml NSC-CM by tail vein injection at 3 h, 24 h, and 48 h after ischemia onset. The other group was slowly administrated with 1.5 ml PBS (phosphate buffer saline) by tail vein injection at 3 h, 24 h, and 48 h after ischemia onset.

2.3。神经缺损评分和脑梗死体积测量

盲检者在缺血发作后第3天评估神经缺损评分。根据既往报道，采用21分行为量表(normal and maximum score, 21)评估神经功能缺损[25]。较低的分数与最严重的神经缺陷相关。各组10只大鼠数据取平均值，用均数±SEM表示，两组比较。

评估神经缺损评分后，大鼠( per group) were killed using overdose of 10% of chloral hydrate (4 ml/kg BW, i.p.) for the isolation of the brains to measure cerebral infarct volumes using TTC (2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride) staining as previously described by us [24]。分离的大脑在−20℃保存20分钟;然后，5个冠状切面被解剖，并在2% TTC (Sigma，美国)37℃孵育30分钟。孵育后，所有切片在4%多聚甲醛缓冲液中固定24小时;采用IPP6.0系统(Media Cybernetics, USA)计算脑缺血体积。总缺血体积以病灶同侧半球脑缺血体积的百分比表示。各组4只大鼠数据取平均值，用平均值±SEM表示，两组比较。

2.4。TUNEL染色

评估神经缺损评分后，大鼠( per group) were anesthetized with 10% chloral hydrate (3 ml/kg BW, i.p.) and perfused transcardially with ice PBS followed by 4% PFA (paraformaldehyde in PBS, pH = 7.4). After that, the brains were removed and dehydrated in 30% and 20% sucrose solution. The brains were frozen in Tissuse-Tek embedding compound (Sakura Finetek, Japan) and cryosectioned on a cryostat (Leica CM1850, Germany). The sections of the brains were used for further terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick and labeling (TUNEL) staining. TUNEL staining (Boster, Wuhan, China) was performed to detect apoptotic cells in the ischemic hemisphere and applied according to the manufacturers’ instructions. In brief, five serial sections with an interval of 50 μ每只大鼠随机取m。在0.025% 3,3-二氨基联苯胺(DAB, Boster，中国武汉)中孵育，加0.033% H₂O₂PBS 10 min，苏木精反染。脱水后，用中性香脂覆盖切片，用光学显微镜(Olympus，日本)观察。使用IPP6.0计算TUNEL染色阳性细胞。每张切片随机选取皮层和半暗区5个区域进行脑缺血半球细胞计数，20倍放大。各区域的总细胞数和tunel阳性细胞数。tunel阳性细胞的百分比描述为tunel阳性细胞数量占每个区域细胞总数的百分比。取10个切片中5个区域的数据平均值，用平均值±SEM表示，两组比较。

2.5。免疫印迹分析

评估神经缺损评分后，大鼠( per group) were killed by overdose of 10% chloral hydrate (4 ml/kg BW, i.p.) and the ischemic hemisphere was isolated for further Western blot analysis. Each ischemic hemisphere was centrifuged at 12,000 rpm for 30 minutes at 4°C. The supernatant was collected, and protein concentration was measured using a BCA protein assay kit (Beyotime, Shanghai, China). Protein extract and sample buffer were mixed and boiled 5 minutes at 100°C before loading onto 15% polyacrylamide gels. We performed Western blot analysis using standard techniques with an ECL Plus detection kit (Millipore, Billerica, MA). The antibodies used in Western blot analysis were rabbit anti-Bcl-2 (Boster, Wuhan, China, 1 : 200) and mouseβ-actin (1: 1000;ZSGB-Bio)。每个样品重复3次进行Western blot分析。波段被归一化为β肌动蛋白水平，以及带的密度使用ImageJ分析软件（NIH，Bethesda，MD获得）测量。数据进行平均，表示为平均6 SEM，和2组间比较。

2.6。电子显微镜

评估神经缺损评分后，大鼠( per group) were killed by overdose of 10% chloral hydrate (4 ml/kg BW, i.p.) and rapidly isolated 1 mm^3.缺血半球皮层下一个电子显微镜分析。The above isolated ischemic hemisphere cortexes were immediately postfixed in 3% glutaraldehyde (3% in 0.1 M cacodylate buffer, pH = 7.4) at 4°C overnight. Following rinsing three times with PBS, the ischemic hemisphere cortexes were then osmicated in 1% osmium tetroxide in PBS for 2 h, dehydrated in increasing concentrations of ethanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, and 100%) for 15 min and embedded in Epon 812 resin. Ultrathin sections (0.06 μ米）进行切片，并用乙酸双氧铀和柠檬酸铅，然后通过盲检查者用JEM-1200 EX电子显微镜检查染色。

2.7。统计分析

使用GraphPad Prism 5（格拉夫派得软件，拉霍亚，CA）进行统计分析。数据表示为与SEM手段。两个示例t检验用于数据分析。意义定为 。

3.结果

3.1。NSC-CM对脑缺血/再灌注损伤引起的神经功能缺损具有明显的保护作用

为了评估NSC-CM对大鼠脑I/R损伤是否具有神经保护作用，我们在脑缺血发生后第3天测量神经缺损评分和脑梗死体积。我们采用21分制来评估大鼠脑缺血后第3天的神经缺损评分。较低的分数与最严重的神经缺陷相关。如图所示1 (d)中，我们发现接收NSC-CM尾静脉注射的大鼠的神经缺损得分显著高于对照组（ )。另外，我们还进行了TTC染色测量脑梗死容积。如图所示1(一),1 (b)和1 (c)中，我们观察到，NSC-CM静脉注射尾减少显著脑的梗死体积，相比于对照组（ )。因此，这些数据表明，NSC-CM有保护大鼠抗脑I / R损伤的能力。

3.2。NSC-CM显着改善通过Bcl-2的表达的减毒细胞凋亡

为了探讨NSC-CM对大鼠脑I/R损伤的神经保护作用的可能机制，我们采用TUNEL染色法测定缺血半球的凋亡细胞数量。如图所示2(一个),2 (b)和图2（f）与对照组相比，NSC-CM明显减少缺血半球的凋亡细胞数量。为了进一步阐明NSC-CM是如何抑制细胞凋亡的，我们采用Western blot方法检测脑半球Bcl-2的表达。如图所示图2（c）和2（G）， NSC-CM显著增加缺血半球Bcl-2的表达( )。因此，这些数据提示NSC-CM改善缺血半球Bcl-2表达的能力可能有助于抑制细胞凋亡。

3.3。NCS-CM可显著保护脑缺血半球的线粒体超微结构

为了进一步澄清NSC-CM是否具有保护线粒体的能力，我们用电子显微镜观察线粒体的超微结构。如在图中所示图2（d），脑I/R损伤大鼠线粒体肿胀。特别是线粒体嵴几乎消失或出现崩解。但在NSC-CM尾静脉注射组，我们仍观察到一些正常的嵴整合的线粒体，尽管多数线粒体肿胀，呈现嵴崩解(图)图2（e）)。更重要的是，NSC-CM尾静脉注射组中的线粒体少严重肿胀比对照组。因此，上述数据表明，所造成的NSC-CM保存线粒体的超微结构促成对脑I / R损伤的神经保护作用。

4.讨论

尽管使用神经干细胞，以改善受影响的大脑脑I / R损伤，比如道德问题，免疫排斥，潜在的肿瘤形成和低存活和分化率的复苏仍限制了神经干细胞的临床应用[的良好效果5]。由于NSC-CM在细胞分裂过程中可能产生有害物质，NSC-CM常被丢弃体外。但是，NSC-CM已经受到越来越多的关注，近年来，因为旁观者体内神经干细胞的行动广泛的研究，特别是通过MV的神经干细胞释放。NSC-CM被证明发挥体外抗凋亡作用[22]和体内[21]。为了规避一些潜在的干扰因素，寻找一种改善脑I/R损伤的新治疗策略，我们首次在大鼠脑I/R损伤模型中探索了多尾静脉注射NSC-CM的效果，发现NSC-CM能有效改善大鼠脑I/R损伤。

正如预期的那样，我们的数据表明，NSC-CM的连续给药显著减少脑梗塞体积和改进的神经学缺陷的分数（图1 (b)和1 (c))。缺血性中风被认为是由血流量减少到脑组织引起的，随后的缺血级联的活化导致细胞死亡和严重的神经元损伤[26]，包括细胞凋亡，氧化应激，炎症和钙超载。它已经证明，细胞凋亡在大鼠脑缺血的发病机制中起重要作用[27]。NSC-CM包括神经营养因子，如GDNF和BDNF，BDNF同时或GDNF证实大鼠短暂大脑中动脉闭塞[后发挥抗凋亡作用28,29]。此外，体外也证实NSC-CM可以抑制RA(维甲酸)引起的SH-SY5Y细胞凋亡[22]。因此，为了剖析NSC-CM这些有益的神经保护作用的潜在机制，我们使用TUNEL染色来观察细胞凋亡。与上述两项研究相符[22,29， NSC-CM显著减少缺血半球中tunel阳性细胞的数量(图)2(一个),2 (b)和图2（f）)，表明NSC-CM在体内具有抑制细胞凋亡的能力。

这并不是说新的Bcl-2有局灶性缺血再灌注后的保护作用[三十]，和Bcl-2中，作为抗凋亡蛋白的一个，被降低的基因中的一个，其特征在于最局灶性缺血后[三十]。此外，也有研究表明，BDNF能够通过改善Bcl-2的表达来保护脑I/R损伤[28]。NSCs分泌的MVs被证实具有参与炎症过程的能力[18]，而炎症促进了细胞凋亡的脑I / R损伤[1]。因此，我们猜测，NSC-CM具有抑制细胞凋亡的能力。为了进一步探索其对抗凋亡NSC-CM的机制，我们选择了Bcl-2的作为密钥抗凋亡蛋白。我们的数据表明，NSC-CM中的缺血性半球（图显著提高Bcl-2的表达图2（c）和2（G）, )。越来越多的证据表明Bcl-2通过稳定线粒体完整性来停止细胞凋亡[27]。线粒体作为几十年来缺血性神经元死亡的重要组成部分，在发生脑I/R损伤时发生肿胀[31]。更重要的是，缺血性神经元死亡的最早表现是由线粒体嵴的损失引起的[31]。在接受NSC-CM组，我们仍然观察到一些正常的嵴整合的线粒体，尽管大部分线粒体肿胀，呈现嵴崩解(图)图2（e）），这表明NSC-CM有保持线粒体的超微结构的容量。因此，我们的结论是，保留线粒体的超微结构促成的Bcl-2的表达增加。已经证明，通过神经干细胞分泌的MV在神经系统的发展起着重要的作用，增强了endoneurogenesis和抑制炎症的过程[18]。它公知的是BBB完整性脑I / R损伤，这是有利的穿透BBB一些因素[期间被破坏32]。NSC-CM的部件复杂的，含有这些已知的神经营养因子，即，BDNF [7]，GDNF，和NT-3〔8，以及许多其他从NSCs释放的未知可溶性因子，以及微粒子[9]在CM。虽然BDNF，GDNF和NT-3的单个应用程序可以穿透血脑屏障并防止脑I / R损伤如由他人在以往的研究证明，有没有关于对脑I / R损伤神经营养因子的组合应用效果研究。在目前的初步研究，但是，我们并没有专注于NSC-CM的详细机制。进一步的研究是必要的，在未来NSC-CM的内容，这可能有助于NSC-CM的阐明机制对脑I / R损伤全球蛋白质组学分析，以确定这些可溶性因子，计算比例。而且，我们在未来也将使用超速离心作证他们对脑I / R损伤效应隔离微粒。

总之，我们发现多尾静脉注射NSC-CM可以通过抑制细胞凋亡和保护线粒体超微结构，显著改善脑I/R损伤。换句话说，我们的数据表明，NSC-CM是另一种有前途的缺血卒中细胞清除策略。

的利益冲突

作者声明，他们没有利益冲突。

作者的贡献

杨洪娜设计并完成了实验。手稿由杨洪娜和瞿廷宇撰写。王翠兰(Cuilan Wang)和陈辉(Hui Chen)进行了动物实验。李兰和马爽进行了TTC染色、Western blot和电子显微镜检查。王皓进行了统计分析。

致谢

本研究获得了(1)美国Boothroyd基金资助，(2)济南市5150项目资助，(3)台山海外学者资助(tshw201502002)，(4)山东省重点研究发展计划(2016ZDJQ0104)，(5)国家自然科学基金(no. 5)的资助。81701057)到杨洪纳。

参考

1. d . Y.-W。范氏,S.-Y。《急性中风的发病机制和炎性小体的作用》，李淑珍，《炎症小体的作用》。老化的研究评论第12卷，no。4，第941-966页，2013。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
2. Y.程，张J.，L.邓等人，“脉内输送神经干细胞移植入脑缺血，分化和改善成年大鼠短暂性脑缺血中风后的功能恢复，”国际临床与实验病理学杂志，第8卷，no。2928-2936页，2015年。查看在：谷歌学术搜索
3. M. Z. Ratajczak，M. Kucia，T Jadczyk等人，“在再生医学干细胞治疗旁分泌作用举足轻重的作用：我们可以翻译干细胞分泌旁分泌因子和微泡成更好的治疗策略？”白血病，第26卷，第1166-1173页，2011。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
4. S.刘某，S. H.李，S. U. Kim和B. W.尹，“人类神经干细胞促进内源性神经干细胞增殖，增强血管缺血大鼠脑”神经再生研究卷。11，第298-304，2016。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
5. Y.-H.唐，Y.-Y.马，Z.-J.张，Y.-T.王和G.-Y.杨，“机遇与挑战：干细胞治疗缺血性中风的治疗，”中枢神经科学与治疗学，第21卷，第337-347页，2015年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
6. T. R. Doeppner和D. M.赫尔曼，“干预防中风的基于细胞的治疗方法：从人证明了概念研究和考虑有关临床适用性意见”细胞神经科学前沿， 2014年第8期。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
7. T. D. Aumann, R. Talaveron, E. R. Matarredona, R. R. de la Cruz，和a.m. Pastor，“神经祖细胞植入调节大鼠轴突切除神经元的血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子的表达，”公共科学图书馆·一卷。8，文章e54519，2013。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
8. P.路，L. L.琼斯，E. Y.斯奈德和M. H. Tuszynski，“神经干细胞组成型分泌的神经营养因子，促进脊髓损伤后广泛宿主轴突生长，”实验神经学，第181卷，第115-129页，2003年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
9. S. M. Schindler, J. P. Little, a . Klegeris，“微粒:中枢神经系统疾病的新视角”，生物医学研究国际卷。2014年，文章编号756327，17页，2014年查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
10. T. M. Stanne, N. D. Aberg, S. Nilsson等人，“低循环急性脑源性神经营养因子水平与缺血性卒中后长期功能不良有关，”中风，第47卷，1943-1945页，2016年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
11. Y.江，魏N.，T路，朱军，徐G.和X柳“鼻内脑源性神经营养因子通过调节大鼠局部炎症免受缺血性刺激大脑”神经科学卷。172，第398-405，2011。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
12. U. KILIC，E. KILIC，G. P.迪茨，和M.巴尔，“静脉内TAT-GDNF是在小鼠脑缺血后的保护，”中风，第34卷，第1304-1310页，2003年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
13. 张杰，石正强，杨平等，“神经营养素-3对局灶性脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用受缺氧反应元件的调节，”神经科学，第222卷，第1-9页，2012。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
14. E. M.克拉默-阿尔伯斯和W. Ping Kuo-Elsner，《细胞外囊泡:对大脑有益的东西?》神经精神药理学卷。41，第371-372，2016。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
15. C.普罗，T.特洛塔，和M. A.帕纳罗，“微泡在大脑中：生物标志物，Messenger或调解员”神经免疫学杂志卷。288，第70-78，2015年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
16. 干细胞在肾脏修复中的旁分泌/内分泌机制:微囊介导的遗传信息传递的作用，肾脏病和高血压的最新观点第19卷，no。1, 2010年7-12页。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
17. G. Chiva-Blanch, R. Suades, J. Crespo等，“缺血性中风中神经祖细胞和血管室细胞的微粒脱落增加，”公共科学图书馆·一第11卷，no。1、2016年第e0148176条。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
18. J. E. Baulch, M. M. Acharya, B. D. Allen等，“干细胞衍生微泡的头颅移植改善认知和减少受辐射大脑的神经病理，”美国国家科学院院刊卷。113，没有。17，第4836-4841，2016。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
19. 李元辉，李善辉，金金勇等，“神经干细胞分泌因子促进大脑再生的组织性rafo - erk激活，”科学报告卷。6，文章32025年，2016年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
20. K.马，L.福克斯，G. Shi等人，“神经干的生成细胞样从骨髓来源的人类细胞的间充质干细胞，”神经学研究，第33卷，第1083-1093页，2011。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
21. 梁p、刘j、熊j等，“神经干细胞条件培养液保护脊髓损伤后的神经元并促进固有脊髓神经元传递神经回路重联。”细胞移植，第23卷，附录1，第S45-S56页，2014。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
22. Yang h, Wang J.， Sun J.， Liu X.， Duan W. M.， and T. Qu，“一种有效快速地从SH-SY5Y细胞生成神经元的新方法，”神经学字母卷。610，第43-47，2016。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
23. M.-Y.金，B.-S.月球和K.-Y.财，“分离和体外皮层神经祖细胞的维持，”分子生物学方法卷。1018，第3-10页，2013。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
24. 杨宏华，吕元华，马s等，“细胞外基质靶向递送对大鼠局灶性缺血再灌注后神经功能缺损的保护作用，”卒中杂志脑血管疾病，第24卷，第154-162页，2015年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
25. A. J. Hunter, J. Hatcher, D. Virley等，“局灶性中风后小鼠和大鼠的功能评估”，神经药理学第39卷，no。5，第806-816页，2000。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
26. A.查莫罗，A.迈泽尔，A. M.普拉纳斯，X. URRA，D.范·德比克，和R. Veltkamp，“急性中风的免疫学，”自然评论。神经学，第8卷，no。7，页401-410,2012。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
27. J.苗，L.王，X. Zhang等人，“实验缺血性中风阿利吉仑的保护作用：上调的P-PI3K，P-AKT，Bcl-2表达的，减毒的Bax的表达，”神经化学研究卷。41，第2300年至2310年，2016。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
28. W. R. Schabitz，C. Sommer的，W. Zoder，M.基斯林，M. Schwaninger和S.施瓦布，“静脉内脑源性神经营养因子减少的梗塞面积和counterregulates临时局灶性脑缺血后Bax和Bcl-2的表达，”中风，第31卷，第2212-2217页，2000。查看在：谷歌学术搜索
29. J. Shang, K. Deguchi, T. Yamashita等，“胶质细胞源性神经营养因子和肝细胞生长因子对暂时性脑中动脉闭塞大鼠的抗凋亡和抗自噬作用”神经科学的研究卷。88，第2197至2206年，2010。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
30. X.-L.胡，T.奥尔森，I.-M.约翰森，T. Brannstrom和P.韦斯特，“动态抗和促凋亡蛋白Bcl-W，Bcl-2的，和Bax与Smac蛋白/ DIABLO的改变大鼠光化学环中风后线粒体释放，”欧洲神经科学杂志第20卷，no。5，第1177-1188页，2004。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
31. P. Baxter, Y. Chen, Y. Xu, R. a . Swanson，“由核聚(adp -核糖)聚合酶-1引起的线粒体功能障碍:中风中细胞死亡的一种可治疗的原因，”平移中风研究卷。5，没有。1，第136-144，2014。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
32. Liang J.， Qi Z.， W. Liu等，“常压高氧减缓血脑屏障损伤，扩大组织型纤溶酶原激活剂治疗脑缺血的治疗时间窗。”中风卷。46，第1344至1351年，2015年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索

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