SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2018/4659159 4659159 研究文章 神经干细胞Cell-Conditioned中改善脑缺血再灌注损伤大鼠 http://orcid.org/0000 - 0001 - 7573 - 5325 杨 HongNa 1 王 Cuilan 2 程ydF4y2Ba 回族 2 李 局域网 2 马 双 2 王 郝 1 傅 YaRu 4 http://orcid.org/0000 - 0002 - 4818 - 8538 曲 《 3 4 叶 亚当 1 危重病医学的部门 山东大学齐鲁医院 山东大学 济南 250012年山东 中国 sdu.edu.cn 2 神经学部门 山东大学齐鲁医院 山东大学 济南 250012年山东 中国 sdu.edu.cn 3 精神病学部门 伊利诺斯大学医学院的 西泰勒街1601号 芝加哥 伊尔60612 美国 uic.edu 4 R & D细胞和组织的银行 山东省齐鲁干细胞工程公司 济南 250000年山东 中国 2018年 3 4 2018年 2018年 09年 07年 2017年 22 09年 2017年 10 10 2017年 3 4 2018年 2018年 版权©2018杨HongNa et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

介绍。我们之前的研究表明NSC-CM(神经干细胞cell-conditioned介质)抑制细胞凋亡 在体外。此外,许多研究表明,神经营养因子和微粒分泌的条件培养基nsc有神经保护作用。因此,我们假设NSC-CM有能力防止脑I / R损伤。 方法。成年男性Sprague-Dawley大鼠大脑中动脉闭塞接受手术的动物模型脑I / R损伤被随机分配到两组:对照组和NSC-CM-treated组。1.5毫升NSC-CM或PBS(磷酸缓冲盐)管理慢慢通过尾静脉3 h, 24小时,48 h后缺血发作。 结果。NSC-CM显著改善神经系统缺陷和减少脑梗塞体积,伴随着保留线粒体超微结构。此外,我们还发现,NSC-CM显著抑制细胞凋亡在通过改善缺血性脑bcl - 2 (b细胞lymphoma-2)的表达。 结论。NSC-CM可能是另一种有效治疗缺血性中风。

 中国国家自然科学基金 81701057 布斯罗伊德基金会 计划5150年在济南的城市 泰山海外学者 tshw201502002 主要研究和开发计划 2016年zdjq0104 1。介绍

缺血性中风是残疾的主要原因,世界上第二死因( 1]。到目前为止,组织纤溶酶原激活物(tPA)仍然是唯一有效的治疗方法。但是,狭窄的治疗窗(4.5小时)和颅内出血的危险相对高有限tPA的临床应用 1]。此外,神经保护药物测试患者在临床试验中被证明失败,因为副作用和/或低功效虽然所有这样的代理证明减少神经元细胞死亡和中风梗塞大小在细胞培养和动物模型,分别是( 1]。因此,我们需要找到新的治疗缺血性中风的治疗策略。

最近,干细胞疗法,尤其是神经干细胞(NSC)治疗,获得了越来越多的吸引在治疗缺血性中风。先前的研究证明,nsc能够促进神经恢复通过直接的行动(神经元替代) 2)和间接旁观者行为分泌BDNF ( 3)(脑源性神经营养因子),抑制炎症的过程,提高endoneurogenesis [ 4])。但是,原始资源,低生存,和神经分化率( 5以及潜在的肿瘤形成的国家安全委员会( 6限制了其临床应用。因此,干细胞治疗不理想的治疗缺血性中风。然而,据报道,国家安全委员会发布的许多神经营养因子,如脑源性神经营养因子( 7),GDNF (line-derived胶质细胞神经营养因子),NT-3 (neurotrophin-3) [ 8),和其他可溶性因子,以及微泡(MVs) [ 9culture-conditioned介质)。此外,还有未知的神经营养因子和nondegraded有丝分裂因素,如:bFGF(基本成纤维细胞生长因子)和表皮生长因子(表皮生长因子)。尤其是低循环BDNF浓度与贫穷有关长期功能性缺血性中风的结果( 10),而鼻内BDNF防止脑I / R损伤( 11]。此外,GDNF和NT-3已经证明对脑I / R损伤[发挥神经保护 12, 13]。

MVs(微泡)是纳米尺度,包围的囊泡释放细胞,可以运输货物,包括DNA, RNA和蛋白质之间细胞细胞间交流的一种形式。培养基中发布MVs nsc在开发期间,被证实在神经损伤起到保护作用,调节神经活动,扮演着重要的角色在神经系统的发育和功能 9, 14, 15]。这些遗传信息被证实在MVs干细胞修复受损组织不直接替代细胞( 16]。已经证明有病变之间的负相关卷和NSC-derived MVs缺血性中风患者( 17),这表明,移植NSC-derived MVs可以降低脑梗塞体积。此外,以前的研究也表明,MVs从人类nsc能够减弱神经炎症和保护主机辐射大脑神经元形态( 18]。NSC-CM此外,移植到老鼠的大脑受伤不仅导致subventricular区NSC扩张的人口也增强的形成新的神经元迁移到受损的网站( 19]。NSC-CM被证实的能力诱导间充质干细胞向神经干细胞的细胞 在体外( 20.),进一步表明NSC-CM可能增强endoneurogenesis。更重要的是,NSC-CM可能大大减弱神经元细胞凋亡在大鼠脊髓损伤后( 21]。我们以前的研究也表明NSC-CM显著抑制细胞凋亡,增强神经元分化RA-differentiated SH-SY5Y细胞 在体外( 22]。因此,我们假设NSC-CM可能防止脑I / R损伤的能力。

因此,在当前的研究中,我们测试是否通过静脉注射NSC-CM可以改善神经功能恢复和减少脑梗死体积引起的脑缺血/再灌注(I / R)损伤的老鼠。此外,我们试图调查可能的神经保护机制NSC-CM脑I / R损伤大鼠。

 2。材料和方法 2.1。NSC-CM(神经干细胞Cell-Conditioned介质)准备

所有动物协议和程序在当前研究伦理委员会的审查和批准的指导方针的山东大学动物实验。E15-18怀孕Sprague-Dawley (SD)老鼠从动物研究中心购买山东中医药大学(济南,中国),用于分离神经干细胞(nsc)。分离和培养的方法根据金协议执行nsc et al。 23的详细方法,收集NSC-CM根据协议执行我们之前提供的 22]。总之,E15-18 SD大鼠的大脑皮层区域隔离,和脑膜剥落洁净工作台。皮质被转移到一个15毫升锥形管包含3毫升哈佛商学院(汉克斯平衡盐溶液)5分钟,然后分离成小块使用1毫升吸管小费。3毫升hbs包含小块的皮质被100纳米过滤器和过滤离心机在1000 RPM ∗ 10分钟单细胞RT(室温)。在完成之后,这些细胞被resuspend培养基包括DMEM / F12(表达载体、钙、美国),重组人表皮生长因子(EGF);20 ng / ml)和碱性纤维母细胞生长因子(bFGF;20 ng / ml)(研发系统,明尼阿波利斯,美国),B27(无血清培养基补充制定提供最佳生长条件NSC扩张,1:50;英杰公司)、肝素(5 μg / ml;σ,圣路易斯,密苏里州,美国),2毫米谷酰胺,antibiotic-antimycotic混合物(1:100;表达载体,10000 u /毫升青霉素,10000 μg / ml链霉素,25岁 μg / ml两性霉素B),在悬架可行的细胞的数量是评估使用锥虫蓝,和细胞悬浮液的密度调整为2 ∗ 105细胞/毫升。然后,细胞悬浮液被播种到完成一个包含15毫升的t - 75瓶培养基在37°C公司5%2湿润孵化室(费舍尔,匹兹堡,美国)4天。4天后,单个细胞克隆成NSC球状体,媒介是彻底改变了新鲜培养基完成。7.5毫升新鲜培养基是改变每3天完成。每2周,我们大neurospheroids切成小球状体的观察显微镜下(奥林巴斯、日本)。每个介质变化的时候,我们收集了老鼠NSC条件培养液通过过滤膜孔径为0.4 μ米直径(美国微孔,Billerica的)。过滤条件的媒介在1000 RPM离心机 ∗ 10分钟rt,之后,我们观察到的媒介在显微镜下以确保没有细胞污染。神经干细胞cell-conditioned介质是7天保持在4°C。

 2.2。动物模型制备和治疗

男性Sprague-Dawley老鼠( n = 40 )重150 - 200克买来的动物研究中心山东中医药大学(济南,中国)。动物被保持在标准实验室的条件下,保持在温度和湿度控制的房间在12 h / 12 h光/暗周期,并免费获得食物和水。脑缺血/再灌注(I / R)损伤诱导大脑中动脉阻塞(MCAO)如前所述,我们组( 24]。短暂,老鼠被10%的水合氯醛麻醉(3毫升/公斤BW, i.p。)和右颈动脉分叉,右侧颈总动脉(CCA),右颈内动脉(ICA)和右颈外动脉(ECA)暴露在表演者的腹侧颈部切口。的单丝尼龙silicone-beaded提示(Sunbio生物技术,北京),直径0.28毫米,是标记在18毫米silicone-beaded提示插入正确的ICA。单丝尼龙插入正确的ICA直到阻力在16 - 20毫米的分歧感到右CCA。单丝尼龙固定,然后小心翼翼地撤回90分钟后大脑中动脉闭塞的允许再灌注。在整个过程中,体温维持在37±0.5°C,恒温控制的红外线灯。脑缺血/再灌注大鼠随机分为2组。一组在慢慢管理1.5毫升NSC-CM通过尾静脉注射3 h,缺血发作后24小时、48小时。另一组是慢慢地管理1.5毫升PBS(磷酸缓冲盐)通过尾静脉注射3 h, 24小时,48 h后缺血发作。

 2.3。神经缺损评分、脑梗死体积测量

盲人审查员的神经缺损评分评估缺血发作后第三天。中投行为量表(正常和最大得分,21)被用来评估神经缺陷根据以前的报告( 25]。一个较低的分数与最严重的神经缺陷。每组数据的10大鼠平均,表示为均值±SEM,两组之间的比较。

评估神经缺损评分后,大鼠( n = 4 每组)被杀使用过量的10%水合氯醛(4毫升/公斤BW, i.p。)的孤立大脑测量脑梗塞卷用TTC染色(2、3、去除氯)如前所述,我们( 24]。孤立的大脑被储存在−20°C 20分钟;然后,五冠部分切割和孵化2% TTC(美国σ)37°C为30分钟。孵化后,所有的部分都固定在4% PFA(多聚甲醛缓冲)24小时;IPP6.0系统(美国媒体控制论)被用来计算脑缺血体积。缺血性总额被表示为一个百分比的脑缺血体积的半球侧病变。4从每组大鼠平均数据,表示为均值±SEM,两组之间的比较。

 2.4。TUNEL染色

评估神经缺损评分后,大鼠( n = 5 每组)与10%水合氯醛麻醉(3毫升/公斤BW, i.p。)和灌注transcardially冰PBS其次是4% PFA(多聚甲醛在PBS, pH = 7.4)。之后,大脑被移除,在30%和20%蔗糖溶液脱水。大脑被冻结在Tissuse-Tek嵌入化合物(日本樱花Finetek)和cryosectioned低温恒温器(德国徕卡CM1850)。大脑的部分被用于进一步的终端原位dUTP尼克和标记(TUNEL)染色。TUNEL染色(武汉博士德,中国)进行检测凋亡细胞缺血性脑和应用根据制造商的指示。总之,五个串行部分的间隔50 μ从每个老鼠被随机获得。在孵化后3 0.025%,3-diaminobenzidine(民建联、博士德、武汉,中国)H + 0.033%2O2在PBS 10分钟,部分与苏木精复染色。之后,部分脱水,覆盖着中性香脂,并用光学显微镜检查(奥林巴斯、日本)。IPP6.0提供计算TUNEL staining-positive细胞。五个地区内皮层和半影每节被随机选择细胞计数在脑缺血脑20×放大。细胞总数和TUNEL-positive细胞得到在每一个地区。TUNEL-positive细胞的百分比被描述为TUNEL-positive细胞的数量的比例在每个区域细胞的总数。平均十部分的五个地区的数据,表示为均值±SEM,两组之间的比较。

 2.5。免疫印迹分析

评估神经缺损评分后,大鼠( n = 5 每组)被过量的10%水合氯醛(4毫升/公斤BW, i.p。)和缺血性脑被隔离为进一步免疫印迹分析。每个缺血性脑离心机在12000 rpm 30分钟在4°C。上层清液收集,蛋白质浓度测定用BCA分析工具包(Beyotime、上海、中国)。蛋白质提取和样品缓冲涨跌互现,煮5分钟前在100°C加载到15%聚丙烯酰胺凝胶。我们进行免疫印迹分析使用标准技术一种ECL +检测设备(微孔、Billerica MA)。中使用的抗体免疫印迹分析兔子anti-Bcl-2(武汉博士德,中国,1:200)和鼠标 β肌动蛋白(1:1000;ZSGB-Bio)。每个样本重复了3次免疫印迹分析。乐队被归一化 β肌动蛋白水平,乐队的密度是衡量使用ImageJ分析软件(NIH,马里兰州贝塞斯达)。数据是平均的,表示为平均6 SEM,两组之间的比较。

 2.6。电子显微镜

评估神经缺损评分后,大鼠( n = 4 每组)被过量的10%水合氯醛(4毫升/公斤BW, i.p。)和快速孤立的1毫米3缺血性脑皮层下电子显微镜分析。上面的孤立缺血性脑皮质立即后缀在3%戊二醛(3% 0.1甲次砷酸盐缓冲,pH = 7.4)一夜之间在4°C。与PBS后冲洗三次,缺血性脑皮质然后osmicated 1%四氧化锇在PBS 2 h,脱水在增加乙醇浓度(30%,50%,70%,80%,90%,95%,和100%)15分钟和嵌入在环氧树脂812树脂。超薄部分(0.06 μ米)切片和染色与醋酸双氧铀及柠檬酸铅,然后用jem - 1200 EX电子显微镜检查由盲目的考官。

 2.7。统计分析

统计分析了使用GraphPad棱镜5 (GraphPad软件,拉霍亚,CA)。数据表示为与SEM手段。两个示例 t测试是用于数据分析。意义是 P < 0.05 。

 3所示。结果 3.1。NSC-CM显著防止神经缺陷引起的脑缺血/再灌注损伤

评估是否NSC-CM发挥神经保护作用在老鼠脑I / R损伤,我们测量了神经缺损评分和脑梗塞卷在脑缺血发作后第三天。我们应用比例规模评估大鼠的神经缺损评分在脑缺血发作后的第三天。一个较低的分数与最严重的神经缺陷。作为显示在图 1 (d),我们发现大鼠的神经缺损评分接收NSC-CM尾静脉注射均明显高于对照组( P < 0.01 )。此外,我们还执行TTC染色法测定脑梗死体积。如图 1(一), 1 (b), 1 (c),我们发现NSC-CM尾部静脉注射显著降低脑梗塞体积,相对于对照组( P < 0.01 )。因此,这些数据表明NSC-CM有能力防止老鼠脑I / R损伤。

的影响NSC-CM神经缺损评分、脑梗死体积的脑缺血/再灌注损伤。代表TTC染色图像在脑缺血后第三天开始NSC-CM组对照组(a)和(b),条形图显示脑缺血体积的百分比(c)在半球侧病变在脑缺血后第三天开始显著减少了治疗后与对照组相比NSC-CM ( n = 5 每组)。 ∗ ∗ P < 0.01 ,两个示例 t测试。条形图显示NSC-CM (d)显著提高神经缺损评分根据21-score点,而控制。 ∗ ∗ P < 0.01 ,两个示例 t测试。

 3.2。NSC-CM显著减毒细胞凋亡通过改善bcl - 2的表达

调查的神经保护作用的可能机制NSC-CM在老鼠脑I / R损伤,我们应用TUNEL染色法测量缺血性脑凋亡细胞的数量。在数据显示 2(一个), 2 (b), 2 (f),NSC-CM显著降低缺血性脑凋亡细胞的数量,与对照组相比。进一步明确如何NSC-CM抑制细胞凋亡,我们应用免疫印迹测量大脑半球bcl - 2的表达。如图 2 (c)和 2 (g),NSC-CM显著增加bcl - 2的表达在缺血性脑 P < 0.01 )。因此,这些数据表明NSC-CM的能力改善缺血性脑的bcl - 2的表达可能有助于抑制细胞凋亡。

NSC-CM细胞凋亡和线粒体超微结构的影响在缺血性球体。代表TUNEL染色图像在脑缺血后第三天开始NSC-CM组对照组(a)和(b)。布朗粒子是TUNEL-positive细胞而蓝色粒子是正常细胞(c), bcl - 2蛋白的表达在两组的脑缺血半影评估免疫印迹。控制:组织接收PBS通过尾静脉注射;NSC-CM:集团接收NSC-CM通过尾静脉注射。代表线粒体超微结构对照组(d)在神经元和NSC-CM组(e)。黑色箭头表示线粒体肿胀cristase解体或失踪。红色箭头表示正常线粒体cristase集成。酒吧:500海里(f),条形图显示NSC-CM TUNEL-positive细胞的数量明显减少脑缺血性脑,与对照组相比。 ∗ ∗ P < 0.01 ,两个示例 t测试(g)。条形图显示NSC-CM显著增加在脑缺血性脑bcl - 2的表达,与对照组相比。 ∗ ∗ P < 0.01 ,两个示例 t测试。

 3.3。NCS-CM显著保护脑缺血脑线粒体超微结构

进一步澄清NSC-CM是否有保护线粒体的能力,我们用电子显微镜观察线粒体超微结构。如图 2 (d)的线粒体脑I / R损伤大鼠肿了起来。特别是,线粒体嵴几乎消失或出现瓦解。但NSC-CM尾静脉注射组,我们还观察到与集成一些正常的线粒体嵴尽管大多数线粒体肿大并出现解体嵴(图 2 (e))。更重要的是,线粒体NSC-CM尾静脉注射组比对照组少严重肿胀。因此,上述数据表明保留线粒体超微结构造成NSC-CM对脑I / R损伤导致神经保护。

 4所示。讨论

尽管使用nsc的承诺效果改善脑I / R损伤的恢复,诸如道德、immunorejection、潜在的肿瘤形成,和低生存和分化率影响的大脑仍然限制nsc的临床应用( 5]。NSC-CM总是丢弃的垃圾,因为nsc在NSC-CM产生可能的有害物质在细胞分裂 在体外。但是,NSC-CM已经收到越来越多的关注近年来因为旁观者的行为nsc体内广泛的调查,特别是MVs nsc发布的。NSC-CM证明施加体外凋亡效应( 22和体内 21]。规避一些潜在的混杂因素,寻找新的治疗策略改善脑I / R损伤,我们第一次探索多种NSC-CM尾静脉注射的影响在老鼠脑I / R模型,发现NSC-CM有效改善脑I / R损伤的老鼠。

正如预期的那样,我们的数据表明,连续管理NSC-CM显著降低脑梗死体积和改善神经缺损评分(数据 1 (b)和 1 (c))。缺血性中风被认为是引起的脑组织血流量减少,其次是缺血级联的激活导致细胞死亡和严重的神经损伤 26),包括细胞凋亡、氧化应激、炎症、和钙超载。它已经表明,细胞凋亡起着重要的作用在脑缺血发病大鼠( 27]。NSC-CM包括神经营养因子、GDNF和脑源性神经营养因子,而BDNF或GDNF确认施加瞬态后凋亡效应在老鼠大脑中动脉遮挡 28, 29日]。此外,NSC-CM也证实抑制SH-SY5Y细胞的细胞凋亡引起风湿性关节炎(维甲酸)体外 22]。因此,分析潜在NSC-CM这些有益的神经保护机制的影响,我们进行了TUNEL染色观察细胞凋亡。符合上述两个研究[ 22, 29日),NSC-CM显著降低缺血性脑TUNEL-postive细胞的数量(数字 2(一个), 2 (b), 2 (f)),这表明NSC-CM体内抑制细胞凋亡的能力。

这不是新局灶性缺血后bcl - 2具有保护作用[ 30.),和bcl - 2、凋亡蛋白之一,是降低局灶缺血后基因大多数特征( 30.]。此外,它也表明,BDNF能够防止脑I / R损伤通过改善bcl - 2的表达( 28]。MVs分泌nsc被证实有能力参加炎症的过程( 18]虽然炎症导致脑I / R损伤的细胞凋亡( 1]。因此,我们猜测NSC-CM有抑制细胞凋亡的能力。进一步探索NSC-CM对抗细胞凋亡的机制,我们选择bcl - 2作为抗凋亡蛋白的关键。我们的数据表明,NSC-CM显著提高bcl - 2的表达在缺血性脑(数字 2 (c)和 2 (g), P < 0.01 )。越来越多的证据表明,bcl - 2停止细胞凋亡通过稳定线粒体完整性( 27]。线粒体作为几十年的缺血性神经元死亡的重要组成部分,是展示变得肿胀发生脑I / R损伤时( 31日]。更重要的是,最早的表现缺血性神经元死亡是由于线粒体嵴的损失( 31日]。我们还观察到与集成一些正常的线粒体嵴尽管大多数线粒体肿大并出现解体嵴的接收NSC-CM组(图 2 (e)),这表明NSC-CM有能力保护线粒体超微结构。因此,我们得出结论,保护线粒体超微结构导致bcl - 2表达的增加。它已经证明了MVs分泌nsc扮演重要角色在神经系统的发展,提高endoneurogenesis和抑制炎症的过程 18]。众所周知,BBB的完整性被破坏在脑I / R损伤,这有利于穿透BBB对某些因素( 32]。NSC-CM的组件是复杂的,包含那些已知的神经营养因子,即脑源性神经营养因子( 7],GDNF, NT-3 [ 8),连同其他未知的可溶性因子释放nsc,以及微粒子( 9在CM 。虽然单个应用程序的BDNF、GDNF和NT-3可以穿透BBB和防止脑I / R损伤在先前的研究已经证明了别人,没有研究组合应用神经营养因子的影响在脑I / R损伤。然而,在目前的初步研究,我们没有关注NSC-CM的详细机制。进一步的研究是必要的来识别这些可溶性因子和计算比例NSC-CM全球蛋白质组学分析的内容在未来,这可能有助于阐明NSC-CM在脑I / R损伤的机制。在未来,我们还将使用超速离心法分离微粒子作证对脑I / R损伤的影响。

总之,我们表明,多个尾静脉注射NSC-CM显著改善脑I / R损伤通过抑制细胞凋亡和保护线粒体超微结构。换句话说,我们的数据表明NSC-CM是另一个有前景的无细胞缺血性中风的策略。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 作者的贡献

杨HongNa设计并进行实验。瞿HongNa杨和《写的手稿。王Cuilan和回族陈进行动物实验。李局域网和双马表现TTC染色法,免疫印迹和电子显微镜。王郝执行统计分析。

 确认

这项研究支持布斯罗伊德(1)基金会的资助,美国(2)计划5150年在济南城,(3)泰山海外学者(tshw201502002),(4)关键研发计划(2016 zdjq0104)在山东,中国《曲,(5)中国国家自然科学基金(没有。81701057)HongNa杨。

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