文摘
生物钟控制内源性生物,是一个系统,调节身体的生理和行为。转录因子的大脑和肌肉ARNT-like蛋白1 (BMAL1)和Period2 (Per2)是生物钟的组件,并且他们在生物钟功能中起到至关重要的作用。两个Bmal1−−/老鼠和Per2−−/老鼠显示明显的骨体积变化。在这项研究中,我们抑制Bmal1的表达在骨骨髓来源间充质干细胞(bmsc)使用慢病毒载体窝藏RNAi序列,这增加了bmsc的成骨分化能力。我们也抑制Per2使用腺病毒载体基因表达窝藏RNAi序列,同样的,bmsc的成骨分化能力增强。此外,当Bmal1与Per2基因表达被抑制在bmsc通过慢病毒和adenoviral干扰,bmsc的成骨分化能力强于单基因抑制。我们的数据支持Bmal1和Per2 BMSC成骨分化中扮演消极的角色,Bmal1和Per2有协同效应BMSC的成骨分化。
1。介绍
骨是一个生物体的最活跃的器官,在生活和重建它。研究表明,有一些信号通路参与骨代谢,和它们之间的生物钟是(1]。严重的后果可能会出现,如果昼夜节律紊乱,如骨矿物质密度的减少以及骨质疏松症患者的风险增加(2,3]。基因参与间充质干细胞成骨细胞分化和基因参与矿物沉积有节奏的表达都是(4- - - - - -6]。Bmal1和Per2都是分子生物钟的重要组成部分,他们表达在骨与24小时周期(7]。老鼠缺乏Bmal1显示加速衰老表型和没有正交的骨,和年长的老鼠缺乏Bmal1骨权重较低(8,9]。/ Bmal1−−小鼠发生骨量较低(10),但另一项研究表明,Bmal1−−/小鼠成骨细胞数升高和骨形成参数(MAR:矿产附着率;BFR:骨形成率),这表明Bmal1抑制骨形成。研究表明,Per1−−/;Per2m / m, Per1−−/;/ Per2−−, Per2Brdm1突变小鼠表现出高骨量表型(11,12]。因此,Bmal1和Per2调节骨形成中起到至关重要的作用。此外,Bmal1的核心组件和Per2都是生物钟自身调节的反馈循环。Bmal1和Per2是否有相互作用在骨形成的监管仍然是未知的。
探索Bmal1的具体角色和Per2骨形成和确定Bmal1的监管和Per2交互在这个过程中,我们抑制Bmal1的表达或/和Per2 bmsc并观察其分化为成骨细胞的能力。数据显示的mRNA和蛋白表达成骨分化标记(高山、Runx2 Ocn),高山活动,和钙化结节形成bmsc的能力是增强Bmal1抑制后,这表明Bmal1负面作用在bmsc的成骨分化的规定。Per2抑制后,bmsc的成骨分化能力也增强,表明Per2也有消极作用在bmsc的成骨分化的规定。Bmal1 Per2,同时抑制后的bmsc的成骨分化能力强于bmsc的单基因抑制后,表明Bmal1和Per2 bmsc的成骨分化的协同效应。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
bmsc(5)通过隔离还是C57 / BL6雄性老鼠从Cyagen购买生物科学股份有限公司(广州)。bmsc被确定为CD29 (+), CD44 (+), CD117(−)和CD31(−),通过12 bmsc有良好的脂肪形成和骨生成能力,由卖方所描述。这些细胞被培养在湿润的气氛中有5%二氧化碳在37°C和新鲜alpha-minimum必不可少的媒介(αmem)含10%胎牛血清的边后卫,链霉素100毫克/毫升、青霉素和100 U /毫升(基础培养基);媒介改变了每周2 - 3次。bmsc汇合的80% - -90%时,他们通过用0.25%胰蛋白酶和0.01% ethylenediamine-tetra乙酸(EDTA)。通过下面5细胞用于实验。
2.2。实验小组
有七组在当下研究:空控制BMSC组(组1、空),Bmal1的shRNA慢病毒vector-transfected BMSC组(组2、Bmal1压迫组,Lenti-Bmal1成分),的绿色荧光蛋白(GFP)表达慢病毒vector-transfected BMSC组(组3,Lenti-GFP-Puro) Per2成分腺病毒vector-transfected BMSC组(组4、Per2压迫组,Adeno-Per2成分),红色荧光蛋白表达腺病毒- (RFP) vector-transfected BMSC组(组5,Adeno-RFP-Puro), Bmal1的shRNA慢病毒,Per2 shRNA adenovirus-transfected BMSC组(6组,Bmal1和Per2镇压集团Lenti-Bmal1 shRNA-Adeno-Per2成分),以及GFP-expressing慢病毒和RFP-expressing adenovirus-transfected BMSC集团(Lenti-GFP-Puro-Adeno-RFP-Puro集团7日)。关于最后两组,我们首先构造稳定Bmal1 shRNA lentivirus-transfected BMSC线条和GFP-expressing lentivirus-transfected BMSC Per2成分和RFP-expressing腺病毒,然后添加的行。
2.3。建设稳定的Bmal1 shRNA-Transfected BMSC线条和GFP-Expressing Lentivirus-Transfected BMSC线
通过5 bmsc被播种在6-well塑料盘子的初始密度5×105细胞每口井的基本媒体,Bmal1 shRNA慢病毒(Arntl成分,由Hanheng生物合成,上海,中国)(组2、Bmal1压迫组,Lenti-Bmal1成分)或GPF-expressing慢病毒(pHBLV-U6-ZsGreen-Puro)(组3,Lenti-GFP-Puro)添加/在一个感染复数(MOI) 20。细胞培养24小时后,介质被替换为基本,48小时后,细胞被基础培养基筛选补充了2μ克/毫升嘌呤霉素。的一个倒置荧光显微镜下观察绿色荧光水平(日本奥林巴斯IX70),和我们计算转染效率RT-qPCR和免疫印迹分析。细胞通道,直到他们是稳定的,两个通道后,适当的细胞冻存以下实验。
2.4。Per2 shRNA腺病毒载体和RPF-Expressing腺病毒载体转染
BMSC,稳定Bmal1 shRNA-transfected BMSC, GFP-expressing lentivirus-transfected BMSC,培养在24-well塑料盘子的初始密度4×104细胞每在基本的媒体,和细胞汇合的80%后,Per2成分的腺病毒载体(Hanheng生物合成,中国上海)添加到井含有BMSC和Bmal1 shRNA-transfected BMSC (Adeno-Per2成分和组6组4日,Lenti-Bmal1 shRNA-Adeno-Per2成分,分别地。),和RFP-expressing腺病毒载体(Hanheng生物合成,中国上海)添加到井含有BMSC和GFP-expressing lentivirus-transfected BMSC (Lenti-GFP-Puro-Adeno-RFP-Puro Adeno-RFP-Puro集团5日和组7日,resp)。莫伊的20倍。一个倒置荧光显微镜下观察荧光水平48 h后,我们决定使用免疫印迹检测转染效率。的稀释anti-BMAL1 (1: 500), anti-PER2(1: 500)和反β肌动蛋白主要抗体(1:1000)。和辣根peroxidase-conjugated二级抗体的稀释(1:1000)是使用。
2.5。RT-qPCR分析
这些七组的细胞培养与1×10 6-well板块5细胞每口井,几组被要求相应的腺病毒转染。细胞汇合的80%后,他们一起在成骨的介质(基本培养基培养50μg / ml L-ascorbate, 10 nM地塞米松,10毫米β甘油磷酸盐),信使rna表达7和14天的osteoinduction后评估。细胞收获和保存在一个RNA保护解决方案(RNA维护)。总RNA提取应用一个简单P总RNA提取工具。吸光度(A)在260 nm使用分光光度计测量量化的总RNA,和一个A260: A280比2.0的RNA样品被认为是高纯度。两毫克的总RNA从每个样本获得的用于逆转录应用SYBR-Prime ScriptTM rt - pcr设备制造商的协议。实时PCR进行20 -μl反应混合物在一式三份ABI棱镜7300实时PCR系统(美国应用生物系统公司)根据制造商的协议。管家基因β肌动蛋白作为内部参考,引物应用于实时PCR分析如表所示1。我们计算未知样品的初始复制数字使用7300实时PCR系统标准曲线。
2.6。西方墨点法
这些七组的细胞培养与1×10 6-well板块5每口井的细胞,和一些组织被要求相应的腺病毒转染。细胞汇合的80%后,他们培养的成骨的介质如RT-qPCR协议所述,和总蛋白后获得7和14天。GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶)或β肌动蛋白作为内部参考。上述时间培养后,这些细胞与冰冷的磷酸盐(PBS)洗两次,然后从凯基生物溶解细胞溶解的缓冲区总蛋白提取工具。然后我们收集的溶解产物是离心后的上层清液,享年14000岁15分钟在4°C和上层清液使用BCA (bicinchoninic酸)的定量分析方法。我们使用标准的sds - page处理总蛋白提取过程和随后转移到PVDF膜。阻塞后,我们探索膜主要使用适当的特定抗体和辣根过氧化物酶,(合)共轭二次抗体。我们观察应用化学发光免疫反应性的蛋白质工具包。ChemiDoc XRS凝胶文档系统和数量一个软件(Bio-Rad)被用来确定乐队强度。
2.7。定量碱性磷酸酶和蛋白质化验
这些七组的细胞培养与1×10 6-well板块5每口井的细胞,和一些组织被要求相应的腺病毒转染。定量分析碱性磷酸酶活性,PBS是用来洗细胞osteoinduction 7天后,和10毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液和0.1% Triton x - 100 (pH值7.4)被用来溶解细胞。这些细胞随后被重复三次冻融循环处理。声波降解法之后,高山活动被王生化测量改性方法应用商业套件指示。使用布拉德福德总蛋白质含量测定方法;反应是在510 nm处和计算基于牛γ球蛋白的标准。高山的数据表示为单位/ L的蛋白质。
2.8。茜素红染色
这些七组的细胞培养在24-well板块4×104细胞/,和一些组织被要求相应的腺病毒转染。细胞汇合的80%后,他们培养的成骨的介质中描述RT-qPCR协议。14天的成骨诱导后,4%多聚甲醛用于修复实验和对照组的盖玻片24-well盘子了20分钟。细胞与PBS冲洗后,他们沾染了茜素红染色溶液,在室温下孵化了30分钟,然后倒相显微镜下观察到的细胞。茜素红的强度每组被使用图像Pro-Plus 6.0量化。
2.9。统计分析
所有实验至少三次。测量了平均数±标准差。统计比较测定析因方差分析(方差分析),其次是Student-Newman-Keuls (SNK)测试做多重比较。统计意义的价值被认为是 。
3所示。结果
3.1。镇压Bmal1信使rna和蛋白质水平和/或Per2 bmsc病毒转染后
慢病毒感染后48 h,倒置荧光显微镜是用来检测到GFP在bmsc(图1(一))。如图1 (b),转染效率大于60%,压制Bmal1的mRNA转录Bmal1压迫组织是成功的。Bmal1基因的抑制是通过免疫印迹分析进一步证实了在蛋白质水平(数字1 (f)和1 (g))。BMAL1蛋白的表达BMAL1压迫组显示一个明显的下降而Lenti-GFP-Puro组。此外,PER2蛋白的表达也减少了Bmal1压迫组。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
adenoviral 48 h后感染,RFP中检测出bmsc在倒置荧光显微镜下观察(图1 (c))。如图1 (d),转染效率大于70%,抑制Per2 Per2 mRNA转录本成功的镇压。Per2基因的抑制是通过免疫印迹分析进一步证实了在蛋白质水平(数字1 (f)和1 (h))。此外,BMAL1蛋白的表达也减少了Per2压迫组。
经过48小时的慢病毒和adenoviral感染,GFP和RFP中发现bmsc在倒置荧光显微镜下观察(图1 (e))。Bmal1的shRNA慢病毒和Per2 shRNA腺病毒组(6)削弱Bmal1 Per2蛋白的表达与GFP-expressing慢病毒和RFP-expressing腺病毒(7)组(数据1 (f)- - - - - -1 (h))。抑制Bmal1 Per2基因表达的蛋白水平证实了所有组的免疫印迹分析(数据1 (f)- - - - - -1 (h))。
3.2。表达成骨分化标记Osteoinduction后每组
osteoinduction 7天后,没有高山的mRNA表达统计上的显著差异,Runx2,和Ocn组1、组3组5,组7(图2),这表明GFP和/或RFP不干扰高山的表达,Runx2, Ocn四空病毒组。抑制Bmal1或Per2基因(组2和组4)增强的mRNA表达高山,Runx2和Ocn(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。然而,在同时抑制Bmal1 Per2,高山的mRNA表达,Runx2, Ocn远比单基因抑制组(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。BMAL1的表达的差异,RUNX2, OCN蛋白质水平的7组是按照RT-qPCR结果(数据3(一个)- - - - - -3 (d))。
(一)
(b)
(c)
(一)
(b)
(c)
(d)
osteoinduction 14天之后,后期的mRNA表达的差异中成骨分化标记Ocn 7组是按照7天后osteo-induction(图4(一))。OCN蛋白质的表达的差异在7组是按照RT-qPCR结果(图4 (b)和4 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。碱性磷酸酶活性成骨诱导后7天
经过7天的成骨诱导,抑制Bmal1或Per2基因增加了活动的早期成骨分化标记高山(图4 (d));同时抑制Bmal1和Per2之后,ALP的活性强于单基因抑制组。
3.4。14天的成骨诱导后骨结节形成
14天的成骨诱导后,抑制Bmal1或Per2基因增加钙化结节(图的形成5)。然而,在同时抑制Bmal1 Per2,钙化结节形成bmsc的能力远比单基因抑制组。
(一)
(b)
4所示。讨论
目前的研究表明,信使rna和蛋白质的表达成骨分化标记(高山、Runx2 Ocn),高山活动,以及钙化结节的能力形成BMSC后被增强的抑制Bmal1 Per2,证明BMSC的成骨分化能力增加,Bmal1和Per2 BMSC成骨分化调控的负面角色。同时抑制Bmal1和Per2之后,BMSC的成骨分化能力更强比单基因抑制后,表明Bmal1与Per2 BMSC成骨分化可能有协同效应。
4.1。Bmal1与骨代谢的关系
福等人证明Bmal1−−/小鼠成骨细胞数量增加,骨形成参数,表明Bmal1的负面作用调节骨形成(11]。Takarada等人还显示,在8-week-old Bmal1−−老鼠,成骨细胞表面/骨表面,骨形成率/骨表面和矿物质的股骨附着率histomorphometric分析显著增加(13]。同样,我们的数据表明,抑制Bmal1之后,bmsc的成骨分化能力增强,表明Bmal1的负面作用调节骨形成。/然而,Bmal1−−老鼠并没有表现出较高的骨量(HBM),这可能是由于性腺机能减退,增加骨吸收状态(14- - - - - -17]。尿消除deoxypyridinoline交联,胶原降解的副产品,是增加Bmal1−−老鼠,表明骨吸收确实加强在这些老鼠,解释,至少在某种程度上,缺乏的高骨量表型Bmal1−−老鼠。藤等人表明osteoclast-related基因,如核转录因子的激活t细胞,胞质1 (NFATc1)和组织蛋白酶K (CTSK),显示昼夜节律性与生物钟基因相似,如Bmal1 Per1,和Per2股骨(松质骨)的老鼠7]。染色质免疫沉淀反应(芯片)分析显示BMAL1蛋白质之间的相互作用和NFATc1的启动子区域和CTSK。因此,生物钟基因Bmal1不仅影响骨形成新陈代谢也骨吸收代谢。
Samsa等人发现Bmal1−−/小鼠低骨重量表型,表现出骨密度下降以及活跃的骨细胞和成骨细胞数量的减少;bmsc的分化为成骨细胞的能力下降,这是不同于福等人的结果和我们的结果。然而,福等人所做的实验主要是在2个月大的老鼠,其骨架没有达到峰值骨量(18];老鼠仍然年轻,被基因敲除的影响较小,因此不显示过早老化的迹象。研究Samsa et al .,他们所做的实验主要是在5个月大的孩子老鼠,当骨骼的增长几乎是完成;因此,老鼠更受早衰症状引起的基因敲除。因此,低骨量的表现型Bmal1−−/老鼠Samsa等人报道了可能是因为引起的早衰症状Bmal1淘汰赛,诱导骨质量损失,和潜在的增加引起的骨形成Bmal1淘汰赛都被早衰symptom-induced骨质量损失的影响。
我们之前的研究和李等人的研究表明,通过Wnt / Bmal1可能调节骨形成β连环蛋白通路,糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)可以作为媒介和Bmal1和Wnt /之间的联系β连环蛋白通路(19,20.]。敏等人表明Bmal1可以促进成骨分化MC3T3-E1细胞通过调节BMP2的表达(21]。关于Bmal1与骨形成之间的关系,他们的结果似乎不同于本研究。然而,使用模型,不考虑细胞的背景下,不同的细胞制剂或使用nonphysiologic损失和功能的方法导致了观测的对比数据。在大多数情况下,缺乏环境信号在体外实验中,可以发现体内而丰富的环境信号。因此,对于实验结果的可靠性和实用性,我们将在下一步进行体内实验。
4.2。Per2和骨代谢之间的关系
Maronde等人表明,与野生型小鼠相比,Per2Brdm1突变小鼠表现出增加骨形成率和骨体积为12,48周大。此外,从Per2成骨细胞隔离Brdm1基因突变小鼠显著更大能力形成钙结节经过14天的成骨的文化(12]。在协议,我们的数据显示,Per2抑制后,bmsc的成骨分化能力升高,表明Per2负面作用在骨形成的规定。本研究表明,bmsc的成骨分化能力同样增强Bmal1的抑制或Per2基因后,而Per2Brdm1突变小鼠显示高骨量表型,这是不同的表现型Bmal1−−老鼠。一个可能的解释是,Per2-deficient老鼠有温和的早衰症状比Bmal1-deficient老鼠。因此,过早衰老的老鼠的影响较小symptom-induced骨量丢失。没有Per2在骨形成的抑制的效果,显示的小鼠骨量增加。
福等人发现Per1−−/;Per2m / m和野生型小鼠表现出类似的尿消除deoxypyridinoline交联,表明骨吸收在这些小鼠没有明显的影响(11]。Per2 Maronde等人发现Brdm1突变老鼠和老鼠缺乏Cry2显示明显增量骨体积在12周的年纪,但Per2Brdm1突变小鼠显示参数的变化对成骨细胞和破骨细胞活动的显示没有改变标记TRAP5b循环血清。然而,老鼠缺乏Cry2显示参数的变化对破骨细胞,降低血清水平的循环TRAP5b标记而不影响成骨细胞的活动。因此,Per2Brdm1突变小鼠骨量增加主要是通过加强骨合成和生理基因Per2影响骨骼代谢主要通过调节骨形成,而它不明显影响骨吸收。
关于Per2信号通路调节骨合成,研究发现,Per1−−/;Per2m / m, Per1−−/;/ Per2−−, Cry1−−/;/ Cry2−−老鼠表现出高骨量表型,表明骨形成负调控的分子钟(11]。研究发现,骨形成参数和骨量减少野生型小鼠长期瘦素i.c.v.输液后,这种治疗持续增强骨形成参数Per1−−/;Per2m / m老鼠。他们的数据支持,昼夜每介导基因leptin-dependent交感神经抑制成骨细胞的骨形成的差别,可能的机制是通过对这些基因原癌基因每个表达式,抑制的表达G1细胞周期蛋白,随后扩展的细胞周期,抑制成骨细胞增殖。
4.3。Bmal1之间的相关性和Per2调节骨代谢
目前的研究表明,Bmal1和Per2负面角色成骨分化的调控BMSC, Bmal1和Per2 BMSC成骨分化可能有协同效应。一些学者已经证明有一个Bmal1与Per2的活动之间的相关性和基因表达22]。Per1和Per2的表达显著降低在所有组织中Bmal1的−−老鼠,Bmal1也明显下调的组织Per1−−/;Per2−−老鼠。在协议,我们的数据显示,Bmal1抑制后,PER2蛋白质的表达下调。反过来,Per2被抑制后,BMAL1蛋白表达也表达下调。它解释说,至少在某种程度上,Bmal1的协同效应和Per2 bmsc的成骨分化。
输出信号的视交叉上核(SCN)据信传输标准昼夜时间周组织通过体液途径和交感神经系统(23,24]。一些论文表明,交感神经系统调节核心生物钟基因的表达和调节骨重建25]。平井一夫等人表明,异丙肾上腺素(Iso) MC3T3-E1成骨细胞的细胞,一个非选择性βar兴奋剂,精心策划的节奏表达规范化生物钟基因Bmal1和Per226]。Iso也使前列腺素内过氧化物的mRNA合酶2(也称为Cox2 Ptgs2,骨代谢的重要调节因子)表达节奏。他们发现Bmal1之间的交互和Per2介导的节奏影响Iso Ptgs2在成骨细胞的表达。此外,连续Iso治疗后,Ptgs2显著减少骨头。他们用生物信息学的方法来显示,包含E-box和D-box Ptgs2基因的启动子序列,证明昼夜振荡器Ptgs2基因调节成骨细胞。其他研究已经表明,启动子Per2含有D -和E-box-binding元素(27- - - - - -29日]。他们的研究结果显示,β基于“增大化现实”技术的信号调节Bmal1的表达和Per2成骨细胞和Bmal1与Per2蛋白质控制的表达由绑定的E-box Ptgs2 Ptgs2启动子,从而控制骨代谢。确实是有一些相关性Bmal1与Per2骨代谢调节,和他们可以控制这一复杂的生理活动通过几个共同的信号通路。
5。结论
我们的研究结果表明,BMSC的成骨分化能力是增强Bmal1的抑制或Per2后,表明Bmal1与Per2至关重要的BMSC成骨分化调控的负面角色。此外,Bmal1和Per2可能有协同效应对bmsc的成骨分化。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金的资助中国没有。81371113)。