提示和技巧质量控制分析方法验证的良好生产规范间充质基质细胞生产

文摘

间充质基质细胞(MSC)的细胞治疗在欧盟被归类为先进的治疗药品(ATMPs),和他们的生产必须满足的要求良好生产规范(GMP)规则。尽管他们分类作为药用产品已经得到充分认识,还有缺乏信息和指标验证方法和noncompendial和compendial方法适应这些特殊生物制品与内在特征区分他们从经典的合成或生物药物。在本文中,我们目前的结果验证研究的上下文中执行MSC发展ATMPs临床试验使用。具体来说,我们描述无菌检测的验证政策之后,木糖醇,外源病毒、细胞计数和immunophenotyping。我们的工作表明,可以充分验证分析方法也ATMPs和之间的基于风险的方法来填补这一空白处方的指导方针的传统医药产品和这些小说的独特的特点,极有前途的新药。

1。介绍

制药和生物制药产品的制造业受到标准化质量体系监管的良好生产规范(GMP)规则1]。间充质基质细胞(MSC)代表细胞疗法产品,根据欧盟的规定(2)被列为先进治疗医药产品(ATMPs)。因此,他们必须按照GMP标准生产。药用产品的质量控制部门制造工厂的目标是保证产品的质量依赖于明确的证据之间的关系准确测量和产品的关键质量属性,如安全、身份、纯度和效力。这些问题描述在欧洲药品局的具体指导方针(EMA) [3]。安全源自演示,产品不含外源代理人:细菌、真菌、病毒以及其他组件可能代表病人将接受的风险;蜂窝组件的身份保证活性物质的存在和可能由表型和基因型的概要文件定义;纯度表明细胞疗法的产品含有高浓度的活性物质和从其他不必要的细胞群是免费的,它关注预期的治疗效果。最后,效力试验措施所需的生物活性在最后的电池产品,在关系定义的一般作用机理或任何临床的目的。

验证方法在这种情况下的成功示范生产和质量的一致性,并提供任何的行动过程,过程,方法,实际上或活动且一致地满足特定的需求。特别是,根据国际会议协调Q2(我Q2 R1)指南4],需要验证的分析方法与目的证明过程和质量控制实验室的测试采用了适合预期用途,所以适当的给结果的质量属性,如前所述。验证活动通常由四个步骤:(1)资格的人员和设备作为先决条件的所有操作;(2)描述验证策略的编写和批准验证协议;(3)性能验证实验;和(4)收集结果和注意事项的验证报告(5]。验证协议应明确定义的角色和每个人的责任和元素参与验证的性能,如设备、用品、试剂、参考资料和标准,最重要的是,验证参数和验收标准,保证验证规范的实现。我Q2 (R1)指南定义以下参数,应考虑进行验证:准确性、精密度(重复性、中间精密度)、特异性、检测限、定量限、线性、范围。

策略和验收标准方法检测微生物污染的药品(微生物检查、细菌内毒素、和支原体)描述了在欧洲药典(博士欧元)。验证的目的是确定是否一个特定的产品包含物质可能会干扰的结果分析。因为ATMPs本质上不是惰性产品,需要适当的考虑和适应策略,关于他们的临床应用,设计一个精确的验证研究。

是更具挑战性的ATMP质量控制部门验证noncompendial分析方法(这些方法不包括和官方博士。欧元)中所描述的,尤其是身份,纯度和效力。除了有限的可用性适当的标准和参考材料,缺乏具体的专著和指导方针使验证工作更加困难。

尽管ATMPs的GMP生产的一个重要问题,在文献中,很少有论文关于特定的验证策略(6- - - - - -8有不同的方法。

重要的是要注意,最近ATMPs特定的GMP指南发表(9,第一次区分临床实验ATMPs(至少在早期临床试验阶段)和授权ATMPs(产品,已达到市场营销授权)表示。一流的产品在本文档中显然是宣布全面验证分析方法不是必需的,但是演示方法的适用性可能就足够了,而验证临床ATMPs预计在先进的实验阶段。在我们的经验10),风险评估应该驱动ATMP开发人员选择,基于这种方法,我们选择验证的所有方法,其结果用于临床实验的ATMPs发布。我们确实相信只有一个准确、具体,精确的方法可以有信心的结果,可以支持我们的细胞产品的知识,因此对其授权的方式。

因此,本文的目的是给一个明确的解释我们如何设计验证compendial noncompendial方法来确定安全(微生物测定、木糖醇、外源病毒),身份,和纯度(细胞计数和immunophenotyping) GMP MSC的质量控制,要求释放早期临床试验标准。

2。材料和方法

2.1。Prerequirements:验证仪器、用品、试剂和人员资格

根据GMP指南(1),验证工具、物资和试剂已经表现描述(11]。简单,仪器受到安装资质(智商),按照制造商的规范和操作资格(OQ)。试剂在收到正确检查与规范和记录。授权为质量控制部门遵循GMP员工持续的培训计划。职责的人员参与质量控制程序和质量控制经理的责任显然是写分析协议中描述的职位描述,作为GMP要求的指导方针。

2.2。验证计划和我的定义参数

对于每个方法,验证策略详细描述报告的验证协议选择我Q2 (R1)参数(4)的类型分析,运行和复制的数量,用于计算的公式,验收标准,仪器,操作符,和时间表的时间完成验证研究。所有的结果和分析记录在一份报告中,负责批准质量控制(RQC)部门。如果验证条件没有满足,RQC管理这个条件作为一个“不服从”,发现并改正的原因失败,和重新验证活动通过发行一个新的计划。

以下参数被用于验证本研究描述。(我)特异性:能力评估明确的分析物的存在组件可能会出现。通常,这些可能包括杂质。(2)准确性:亲密之间的协议价值被接受作为一个传统的真实价值或一个公认的参考价值和价值发现。在我们noncompendial验证分析,精度可以表示如下:(1)精度误差(根据以下公式计算: (2)准确性(至于百分比值)是按照下列公式计算: (3)精度:亲密之间的协议(分散程度)的一系列测量获得的多个采样相同的均匀样品在规定的条件下。精度在这里被认为是在两个层面:重复性(intra-assay精度)和中间精密度(interassay精度),它被考虑的百分比计算变异系数(CV)之间的一系列的测量,计算公式: (iv)检出限(检测极限,LoD):中被测物能被定量测定的最低金额,可以检测到,但不一定量化作为精确值。(v)线性:能力(在一定范围内)获得的测试结果直接与浓度成正比(量)分析物的样品。我们计算了考虑相关系数广场(1和0.9之间)。(vi)范围:上部和下部之间的间隔分析物的浓度(含量)的样本(包括这些浓度)已经证明了分析过程有一个合适的精度水平,精度和线性度。

2.3。参考和保留样品验证:细胞来源和制造业

根据GMP指南(附件1312),所有的验证方法进行引用或保留样品的最终产品由MSC从脐带血(CB)和骨髓(BM)。短暂,起始物料,CB或BM,介绍了质量控制分析后我们班上B-GMP设施和被播种在阿尔法修改鹰介质(Macopharma、Mouvaux、法国)补充,分别与gamma-irradiated胎牛血清(的边后卫)的澳大利亚起源(Gibco,生活技术,卡尔斯巴德、钙、美国)或血小板溶解产物(研究所毛皮Klinische Transfusionsmedizin和乌尔姆Immungenetik Gemeinnutzige GmbH,德国乌尔姆),在50000个总有核细胞的浓度(TNC) /厘米²在文化室系统(康宁,Lowel MA)。

24 - 72小时后,不依从细胞被洗与磷酸盐(PBS) (Macopharma)完全培养基的改变。文化是日常监测菌落外观,培养基是改变每三天。80%的融合,这些细胞被分离使用25毫升/层TrypLE-Select (Gibco,生活技术)和亚文化在同一培养条件在1000 - 4000的浓度MSC /厘米²。在每个通道,MSC洗和低温贮藏10% DMSO (CRYOSERV, Mylan机构,Canonsburg, PA,美国),10%的人血清白蛋白(HSA;Kedrion,卢卡,意大利),生理盐水(美国巴克斯特,迪尔菲尔德中学,IL),在cryo-bags (CryoMACS, Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国),保留样品(代表样本的最终产品完全包装单位),和/或在cryovials (Laboindustria,帕多瓦,意大利)作为参考样本。附加的低温贮藏后立即的解决方案,这些袋子和瓶被加载到一个可控速度冰箱(刨床Kryo Biorep,米兰,意大利),编程−1°C /分钟,直到45°C,又看了看−−5°C /分钟直到−110°C。冻结单位被转移到气相液态氮和存储在专用的坦克。冷冻曲线验证并记录在批记录中。为验证协议,新鲜和冻存MSC根据验证和临床应用。

2.4。标准和积极的控制

2.4.1。微生物污染

微生物菌株(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)选择按照博士。欧元2.6.27 [13,14),在使用目前版本验证。细菌菌株的冻干、酵母和真菌是适当的准备和隔离在大豆酪蛋白消化琼脂(卡索琼脂)和Sabouraud, right-agar (SDA)板(美国默克密理博,MA)。在最优生长条件孵化后,菌株被储存在4°C±2。在琼脂板使用,他们为在特定条件和后测量吸光度(数量625),细胞悬浮液浓度被稀释获得两个,10 - 100 CFU /毫升和100 - 1000 CFU /毫升之一。每批培养基检测不育和生育使用前根据博士。欧元2.6.27(增长促进测试)。

2.4.2。木糖醇

预加载和precalibrated,一次性一次性Endosafe®PTS墨盒(美国查尔斯河实验室、查尔斯顿、SC)被用于验证。每个模块包含标准内毒素(CSE) 0.05内毒素单元(欧盟/毫升)。

2.4.3。外源病毒

积极控制肠病毒、腺病毒、人类巨细胞病毒(CMV)和巴尔病毒为分子诊断提供的质量控制(QCMD)在国际环境中外部质量评估(EQA)我们的实验室。工作建立了病毒载量考虑数量的结果显示在外部质量的报告程序。

2.5。微生物检验验证

执行这种验证三批CBMSC和三批BMMSC矩阵的目的来验证,如果任何组件的最终产品是resuspended抗菌活性,因此可能会干扰测试的结果。矩阵解CBMSC低温贮藏产品是由生理盐水,HSA,和DMSO在上述浓度,而BMMSC新鲜产品是resuspended HSA和生理盐水(5%卷:卷)。

验证方案和评价参数(表显示1)。分析进行了直接接种到类下的微生物培养基A-GMP层流罩在课堂上B-GMP包围。连续粒子计数监测和环境和运营商的微生物控制进行(11]。因此欧元博士。(13),被测试的最小体积是1%的最大体积批,所以对于CBMSC 10毫升(批处理的最大体积= 1000毫升)和0.1毫升BMMSC(批处理的最大体积= 10毫升)。因此,为了有一个合适的样本对最终产品进行无菌试验,细胞悬液分为无菌管(10到0.1毫升管)和每一个管,每一个微生物的培养液添加两个浓度,10 - 100 CFU /毫升和100 - 1000 CFU / mL,分别。通过这种方式,对于每一个微生物菌株,得到了两个级别的污染:1 - 10 CFU和10 - 100 CFU。准备工作(样品+微生物)被添加到瓶包含两个特定的培养基:流体thyoglicollate medium-FTM(微孔)金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌,sporogenes梭状芽胞杆菌,Propionebacterium曼秀雷敦,酿脓链球菌,微球菌危害和鼠疫enterocolitica和大豆酪蛋白消化medium-TSB(微孔)枯草芽孢杆菌,白色念珠菌,曲霉属真菌取代巴西橡胶树。第35 - 37的样本孵化°C 14天,结果是由视觉观察。积极的控制是由添加的微生物在没有产品,而消极的控制由样本添加到培养基。

2.6。细菌内毒素试验验证

方法选择对细菌内毒素测定显色动力学方法(方法D博士欧元2.6.14)(15)使用便携式测试系统(Charles River),自动化和便携式光谱光度测量的标配有恒温控制的孵化室。的鲎变形细胞溶解产物(LAL)和CSE衬底积极控制包装内放置墨盒,可以直接读取仪器的波长395纳米,而优化的检测信号产生的拉尔底物显色。最大灵敏度(0.005欧盟/ mL)的方法。进行验证CBMSC,通过产品的研究,它代表了“最坏情况”的内毒素限制对选民的矩阵的存在是resuspended(如微生物检查验证所述)。

综述了国内外近年来验证协议表1在本质上,由三个阶段:(1)保证标准曲线的标准:CSE包含在墨盒,这个测试是由供应商和提供的墨盒是每一批证书包含标准曲线测试的结果分析。根据博士欧元。,the standard curve has been performed on each batch of CSE, with three endotoxin concentrations within specified range on three replicates for each concentration. The linearity of the standard curve, given by the absolute value of ,必须≥0.980。(2)研究产品的:计算内毒素限制(EL)和最大有效稀释(MDV):根据博士欧元。,EL (EU/mL) was calculated by the formula ,在那里火成的阈剂量的内毒素是每公斤体重(静脉管理5.0欧盟/公斤)和产品的最大推荐剂量是每公斤体重。MVD值的计算使用公式: ,在那里对应的浓度测试的解决方案。由于我们正在处理一个细胞悬液而不是化学解决方案,这是不切实际的测量我们的产品的质量浓度,生物活性,或体积。因此,的价值是固定的,因此这意味着每个体积单元的测试解决方案对应于一个单位的产品。初步测试干扰因素:这一步是执行在不同的稀释的产品(MVD)为了找到最好的稀释不激活和/或抑制酶的反应。细胞产品是在水中稀释LAL最小体积为100μl .一次性墨盒包含四个channels-two渠道CSE和拉尔,作为积极的控制通道和两个渠道只有拉尔。对于每个稀释,25岁μL 4井的测试样本被指控的墨盒。消极的控制是由LAL试剂水(Charles River)至少两个复制。仪器给这样一个报告以下结果表明:起始时间(时间必须达到预定的吸光度的可检测水平);变异系数(CV)的两个复制的积极控制和样品;和回收率,允许检查任何干扰抑制和刺激,可以确定一个变更的内毒素复苏。为了有一个有效的结果,负控制和飙升的发病时间必须大于起始时间的样品 ,简历必须的百分比≤10%,复苏率飙升直接计算了仪器的测量精度必须在50 - 200%之间。(3)使用选择稀释测试干扰因素在三个批次产品确认初步测试。

2.7。外源病毒分析验证

验证设计,目的是为了演示试验检测的能力,在我们的生物样本中,病毒可能会意外的运营商在处理过程中引入文化。特别是,披露属于疱疹病毒家族即病毒。,cytomegalovirus (CMV) and Epstein-Barr virus (EBV), CMV ELITe MGB® Kit and EBV ELITe MGB Kit (both ELITechGroup, Torino, Italy) were used. They represented quantitative real-time methods for diagnostic use in DNA extracted from whole blood samples, plasma, and cerebrospinal fluid (CSF). To detect simultaneously the presence of fifteen respiratory viruses (Table2),Seeplex RV15 OneStep ACE检测(Seegene说,首尔,韩国),定性的方法基于实时一步法rt - pcr分析,旨在检测鼻咽吸入呼吸道病毒,鼻咽拭子,和支气管肺泡灌洗,是选择。总结如表1,第一阶段的验证旨在定义所需细胞的数量优化DNA / RNA提取和放大,也考虑到可能的DMSO的抑制效应和基因组DNA,显然是存在于样品。三个批次的参考低温贮藏CBMSC解冻,统计,准备在三个不同的细胞剂量(0.1、0.5和1×10⁶细胞)。颗粒在裂解resuspended缓冲ATL(试剂盒、希尔登,德国),并使用一个自动提取DNA和RNA提取器EZ1(试剂盒)在120年的最后一卷μl . MGB工具包,PCR混合添加1:1体积的基因组提取和提取的消极控制。对于每一个样品,两个放大反应进行thermocycler(7300实时PCR系统,应用生物系统公司,促进城市、钙、美国):第一个是旨在检测MIEA基因(外显子4)、巨细胞病毒、或EBNA1基因编码的蛋白质,对EBV和第二个是针对人类β球蛋白基因,验证提取和放大都成功执行,没有压抑。病毒的头衔的决心,一组标准曲线是使用四个标量的质粒浓度(1×10²1×10³1×10⁴,1×10⁵两种病毒的副本),根据设备的指令。只有一个标准曲线 被接受。

呼吸道病毒,放大了添加8μL(提取到17μL混合不同的大师根据制造商的指示。工具包包含两个不同的控制:第一个是PCR控制(PCRC),允许验证如果放大进行了正确没有抑制物质包含在样品和第二个是整个过程控制(WPC)目标与核糖核酸酶,允许验证如果整个过程,从提取到放大,发生了正确没有抑制作用。为了评估特异性测试MSC,细胞(BMMSC和CBMSC)注射两种病毒载量的已知阳性标准,根据外部质量程序的结果的报告。因为它是不可能使用的所有15呼吸道病毒接种的细胞,我们决定使用积极的标准代表DNA病毒(腺病毒)和RNA病毒(肠病毒)。所使用的病毒数量飙升的细胞类似的低和高病毒载量以积极的病人样本:359年和1436年对巨细胞病毒复制,656年和1313年对EBV副本,362和723份为腺病毒(副词),和1500年和3000年对肠道病毒(HEV)副本。

掺入了戊肝病毒样本进行有或没有蛋白酶K治疗,排除抑制RNA提取由于治疗56°C(所需蛋白酶K)。

评估敏感性、准确性和精度,三个不同批次的CBMSC被控一个病毒载量敏感性截止制造商声明的10倍,200年和1000年对副词和戊肝病毒副本,分别与85年和95年对巨细胞病毒和EBV副本,分别。复苏的计算等效(组)的基因组复制在示例中,它是不可能应用的公式表示数据表(建立血浆样品),所以结果表示为巨细胞病毒的数量和目标EBV DNA (gEqu /反应),存在于样本的反应和积极控制(单独病毒核酸组成的)。量参数计算每个样本的比较Ct值和标准曲线。呼吸道病毒,装备定性,它是不可能证明定量恢复。两个消极的控制进行:消极控制提取,通过处理水提取条件下,为放大和消极的控制,通过将水混合的放大。精度评估技术复制和内内CBMSC的三个批次。

2.8。细胞计数验证

协议旨在为MSC计数验证一个自动化的方法“NucleoCounter®”系统(ChemoMetec、Allerod、丹麦)的精度,精度和线性度相比,人工细胞计数方法的血细胞计数器(伯克室)。Nucleocounter便携设备基于集成荧光显微镜原理,允许计算总和可行的细胞染色propidium碘(π),在充电器NucleoCassette固定化。参考样品MSC(三批CBMSC三批BMMSC) resuspended在PBS的卷1 - 20毫升,为了测试不同浓度的细胞。如图1对于每个细胞悬液,两个不同的量为总在重复计算和死细胞。第一,裂解的细胞使用缓冲区(ChemoMetec),为了让PI染色细胞悬液。细胞原液就连续稀释(1:2 - 1:4 - 1:8 - 1:16)和统计两种方法。

伯克的计数室是由两个合格的操作员:10μL细胞悬液的加载和五个字段被数。

以下参数和验收标准设置:(1)准确性:计算精度血细胞计数器计数和测量值之间的误差(nucleocounter和至关重要的总数)和验收标准是固定−5≤E_一个E≤+ 5;(2)线性:对于每个稀释串行数计算的方法0.9至1和(3)精度:估计的可重复性(intra-assay)和中间精密度(interassay)简历不到20%。

2.9。Immunophenotyping验证

验证设计immunophenotyping分析(图2)之前是组成的初步阶段,首先,然后使用每个抗体的滴定仪器设置(包括荧光电压和补偿的设置)。验证阶段包括评估的参数符合我Q2。我们使用了血细胞计数器流式细胞仪第二章(加利福尼亚州圣何塞,正欲BD生物科学、,美国),其可再生产地设置与CS&T珠子(BD)检查在每次收购之前,根据制造商的指示。

参考样品,三批MSC ( CBMSC, BMMSC)和K562细胞作为积极的和消极的标准(stMSC和stK562),分别。K562是骨髓造血细胞系阳性标记类似于MSC CD45和维度。由于这个特性,采集设置可以保持不变而MSC,从而允许同时可视化的细胞类型,可以歧视基于CD45的表达。

抗体滴定,1×10⁵MSC / 100μL是彩色20分钟在黑暗中在室温下用下面的抗体在不同浓度(0、1、2.5和5μL): CD90 PE-Cy7 (BD)、CD105 PerCP-Cy 5.5 (BD)和CD75 APC (BD)。孵化后,细胞与PBS洗,与女主角和分析软件(BD)。最少10000事件进行了分析。样品进行评估的阳性细胞百分比和平均荧光强度比(MFI-R),计算出的比率MFI的积极的细胞群的MFI -细胞群(无污点的细胞)。这些值是策划作为抗体量的函数,以确定哪些为每个抗体稀释是最好的用于以下步骤的验证。最优效价被确定为较低的数量允许最大的正面和负面的细胞之间的歧视,也就是说,第一个允许浓度达到高原。

仪器成立收购协议通过手动校准,是由准备工作标准溶液(wst)组成的50000 MSC (stMSC)混合50000 K562细胞(stK662)。七个管准备如下:无污点的wst, wst沾anti-CD90 FITC (BD) wst沾anti-CD105 PE (BD) wst沾anti-CD90 PE-Cy7, wst沾anti-CD105 PerCP-Cy 5.5,与anti-CD73 APC wst彩色,wst沾anti-CD45 APC-H7 (BD)。电压和补偿设置验证stMSC + stK562沾的组合选择抗体混合在一起(CD90 PE-Cy7, CD105 PerCP-Cy 5.5, CD75 APC,和CD45 APC-H7)。在这个分析,调整了确保没有错误的染色发生在既象限为任何单独的荧光染料。设置颜色补偿后,分析协议定义与精确直方图和控制方案。验证步骤的样本进行了分析在这个协议没有进一步的调整。

验证阶段,积极stMSC标准( )是结合-标准stK562 9不同的比例,各一式两份,根据图2。每个准备( 总管)是彩色CD90、CD105 CD73和CD45如上所述。方法参数评估(a)特异性:定义为纯洁,也就是说,能够检测到阳性标记在MSC,在我们的条件定义为CD90 + CD105 +事件的百分比和杂质,也就是说,能够探测到消极CD45标记;(b)准确性:计算协议预期的程度,测量结果百分比(−精度≤≤5 + 5);(c)线性稀释系列分析:每次运行的计算0.9和1之间纯度和杂质;(d)和精度:估计可重复性(intra-RUN)和中间精密度(inter-RUN)简历不到20%。

3所示。结果与讨论

3.1。微生物检验验证

不育性一直是一个主要的和最重要的测试ATMP释放。特别是,时间来完成的分析可能是一个问题ATMP产品保质期比较短的。在这方面,段落2.6.27博士欧元的包含在之前的版本。可能是不兼容的需要释放这种short-living ATMP产品,从而使这个问题适合被视为参数检验(16]。我们将在下面更广泛评论,同一段落2.6.27博士最近版本的欧元。旨在促进不育性分析方法的使用,包括替代方法和减少潜伏期,但时间仍然是一个问题对于那些产品必须立即释放完成后的生产流程(新产品)。在我们的经验中,一些产品,如CBMSC、低温贮藏在使用前,因此不育的结果发布前总是可用的。其他产品,如BMMSC,必须发布新产品,需要替代方法验证和测试。CBMSC以及其他低温贮藏产品的设计验证研究,目的是验证如果任何低温贮藏的解决方案组件(DMSO、生理盐水和白蛋白)可能会干扰微生物的检测。方法选择样本的直接接种到测试媒体博士描述了欧元。章2.6.27特别符合细胞产品膜过滤方法的描述博士欧元。2.6.1章。当应用于细胞可能存在困难。 The main challenge of this validation was to define the most representative sample of the final product, in terms of volume and conditions (fresh versus cryopreserved). Regarding the volume to be tested, we decided to assimilate our product to hematopoietic cell preparations for which the Ph. Eur. prescribes to inoculate 1% of the total volume for a final product volume greater than 10 mL. Considering that the number of cells/volume of each CBMSC batch will vary in our manufacturing process (from 300 to 1000 mL), we decided to fix the volume as the maximum one that can be obtained in a standard manufacturing process (1000 mL). For that reason, for validation purposes, we tested 10 mL of final product for each microorganism strain. Regarding the condition of the final product, since CBMSC are cryopreserved and must be thawed before clinical use, sterility testing was validated on a thawed retention sample contained in a cryopreservation bag as the final product. For routine quality controls, the retention sample must be thawed and tested for sterility within three weeks from the completion of manufacturing process and also in the validation study, the same time schedule was followed.

BMMSC,发布新产品,测试样本进行验证是由纯BMMSC用生理盐水和白蛋白的解决方案。量选择与每个微生物接种菌株0.1毫升,10毫升的总量的1%。

CBMSC和BMMSC,验证研究中获得的结果满足了预先制定可接受性标准和具体(i)接种微生物的生长是观察到细胞的存在和没有产品(积极控制)的所有三个验证运行,从而表明该产品不具备内在的抗菌活性;(2)没有观察到微生物增长负控制在产品的存在和文化媒体只(特异性);(3)检测极限是1 - 10 CFU,按照要求,有或没有产品。特别是,可以检测到微生物接种量最低的2 CFU和微生物的生长是观察到七天的孵化;及(iv)样品分析在不同的两天分别由两个不同的运营商有同样的增长(中间精密度)。

最近修订博士欧元。2.6.27章题为“细胞制剂的微生物检查”(14)考虑的特点和限制这些准备工作,作为他们的保质期,如果不是低温贮藏,范围从几个小时到几天(17),以及样品成分(在某些情况下,细胞制备本身可以灭活微生物污染导致假阴性)和/或样本大小(一批的总量可能小于50毫升,因此限额是否样本大小)。在这方面,以前版本的主要变化关注的更大的灵活性孵化温度(s),改变微生物测试的列表(鼠疫enterocolitica取而代之的是微球菌危害更合适,因为它是一种常见的污染物细胞制剂),和信息的敏感性达到验证期间也被包括在内。一些作者已经证明,例如,自动化无菌测试能够迅速检测到低水平的污染,平均2.5天(18在48小时内]和[19)为不同生物制药和移植产品(例如,胰岛细胞)。我们也验证快速不育性测试,目的是证明它是准确的,敏感的,和特定的(结果未显示)。

3.2。细菌内毒素试验验证

LAL评估目前是最敏感的和具体的测试可以用来探测和测量细菌木糖醇,定义为“致热源”引起发烧和其他炎症介质引起的不良反应。

在博士欧元。(15),六种不同的方法来确定木糖醇在医药产品。在本文中,我们目前的结果验证使用动力学显色试验中样品的反应时间与控制标准类毒素(CSE)。样品的反应时间的定义是“开始时间”(时间达到一个给定水平的光密度)。验证设计的首要目标是验证试剂的适用性和专门CSE的敏感性。的显色方法,这一步是由标准曲线标准的保证。我们验证的三个值内毒素测试墨盒(0.5 -0.05 -0.005欧盟/毫升)和内毒素标准证书报告的分析包括内毒素的核心价值,与加载积极控制盒本身,最后一个值对应于敏感性()。此外,我们确认供应商提供的标准曲线线性值为0.998。其次,必须执行验证产品与几个目的:(1)由产品本身来识别可能的干扰,(2)显示所选的稀释不干涉,和(3)通过不同的手段消除干扰的可能来源(例如,加热)。开始前的验证研究,具体内毒素限制(EL)和最大有效稀释(MVD)必须为每个特定的产品材料和所述计算方法。EL的计算和MVD LAL试验ATMP产品是多么困难的一个很好的例子是compendial改编的方法,设置标准药物产品。事实上,博士欧元。州新药品,EL和MVD必须由用户计算基于政府路线和其他药理参数,但是还没有定义的指导方针,遵循理性的解释为ATMP定义这些值。此外,在文献中,一些作者只是显示的值没有给出任何理由的计算来确定他们(6),而另一些人则选择了EL值0.5欧盟/毫升(7),由美国食品和药物管理局要求一般医疗设备或个人药物产品的最大人体剂量10毫升/公斤(20.]。在我们的情况中,我们试图尽可能地尊重博士欧元的“灵魂”。通过计算标准的EL和MVD在考虑我们的产品的临床使用。具体地说,厄尔和MVD条件计算如下: 在哪里欧盟是5欧元/公斤(应博士。注射用)是最大的细胞剂量注入每公斤在一小时内,在我们条件是每公斤的最大注入体积。CBMSC,最大体积注入考虑标准的成人体重70公斤的小时段是80毫升,

因此,为CBMSC EL

BMMSC,最大体积注入考虑标准的成人体重70公斤的小时周期是10毫升,

因此,为BMMSC EL

考虑两个临床协议,在这里,我们报告的验证LAL CBMSC,代表了“最坏情况”EL最低和最复杂的细胞矩阵(包括DMSO)。

所以我们计算MVD:

为初步测试的干扰因素,产品测试在不同的稀释,以确定最合适的noninterfering稀释。所选样本稀释1:30;1:90;1:180。

获得的结果(表3)所有的三个稀释的产品满意。我们可以得出结论,该产品不是干扰和LAL试验是有效的。这是决定使用的最低稀释1:30在接下来的阶段。

为了确认选择稀释没有任何干扰,测试是由三个不同的运营商重复三个批次的产品,和所有的实验环节,验收标准得到满足。最后,我们计算特定测试的灵敏度(PSS)如下:

我们成功地执行LAL验证我们的电池产品使用一个敏感和快速定量方法,与令人鼓舞的结果,我们的测试的敏感性远高于EL自信的木糖醇的检测。内毒素测试为产品发布的规范是根据EL和选择的敏感性测试。

关于决定把产品去除干扰因素,我们决定不做任何操作,以测试公布的最具有代表性的最终产品与一个可接受的最终稀释。我们的结果是一贯支持这个选择,但它确实是可能的样本的干扰,采用替代的方法,这可能包括,例如,在加热样品或修改媒体的pH值。在这种情况下,它可能会测试也较低的稀释。

新领域的应用LAL ATMPs由开发复杂的组织工程产品或组合产品的替代方法(细胞与生物材料)。在这个领域,最近提出的替代方法,如基于单元的检测能够检测material-bound微生物污染物不与LAL试验检测(21]或immunofluorescent染色分析评价endotoxin-induced E-selectin的表情。后一种方法也可以提供信息关于细菌污染来源的本地化生产过程的所有步骤组织工程产品对人类使用(22]。

3.3。外源病毒分析验证

ATMP生产携带外源病毒污染的风险,如机载呼吸道病毒,可以在处理过程中引入的操作符。因此测试这些病毒是一个重要的生物药品制造业的质量控制步骤。compendial指南Q5我(23关注产品来源于体外细胞培养,如干扰素、单克隆抗体、和重组DNA-derived产品,包括重组亚单位疫苗,细胞库的生产特点。Gombold et al。24)强调Q5的极限我(在体内和体外实验)检测病毒的疫苗,在50多年前开发的,建议新检测方法的需要。而监管专著和文献覆盖评估外源病毒疫苗,没有特定的准则可用于我们的知识在ATMPs这些病毒的检测。大多数的商业工具,此外,针对特定诊断使用验证,在生物材料如血,鼻咽吸入,支气管肺泡灌洗。在我们的条件,我们验证了三种诊断工具,特别是定量方法citomegalovirus (CMV)与eb病毒(EBV)和定性检测呼吸道病毒在我们的电池产品。

为了评估的最佳提取条件和放大,在初步阶段,我们测试了三个解冻批CBMSC在不同细胞剂量(0.1、0.5和1×10⁶细胞)。内部积极控制的结果也表明,最低数量的细胞,提取和放大过程是成功的和没有抑制样品的组件。

为了评估测试的特异性,0.1×10⁶BMMSC和相同的CBMSC注射低剂量和高病毒载量的巨细胞病毒,巴尔病毒、肠道病毒(HEV),腺病毒(副词)。如图3(一个)呼吸道病毒,在所有的样品,乐队的内部控制(PCRC),整个过程控制(WPC)在场;有一个特定的信号副词和戊肝病毒,不仅积极控制,而且在像预期的那样上升与病毒载量和样品,没有特定的乐队导致消极的控制。此外,我们证明了治疗56°C与蛋白酶K不抑制RNA提取。

也有巨细胞病毒和EBV,结果实时PCR报告所提供的数据3 (b)和3 (c)显示,在所有的样品有特异性飙升和两个低和高病毒载量。获得的结果为呼吸道病毒、巨细胞病毒和EBV也符合制造商声明的敏感性。附近的细胞与病毒数量飙升截止每个设备的敏感性,我们可以检测存在的副词和戊肝病毒在所有样本(数据未显示)。特别是,巨细胞病毒和EBV的Ct飙升样本相关的Ct标准由质粒DNA和积极的控制,病毒没有细胞(数字3 (d)和3 (e))。它也可以计算精度误差()通过比较病毒“量”的每一批CBMSC和巨细胞病毒和EBV-positive控制和验收标准(≤精度误差≤20 + 20)满意。

此外,精密标准得到满足,因为内的变异系数间的技术复制(intra-assay)和三个不同批次的CBMSC≤20%,巨细胞病毒和EBV测试。

3.4。细胞计数验证

为了保证正确的细胞不同的临床试验,所需剂量细胞计数必须准确。手册与血细胞计数器计数是最常用的方法为细胞计数和欧元博士描述的参考方法。(章2.6.29)[25]。然而,市场上不同的自动化方法是可用的,允许获得operator-independent细胞计数,在GMP相关设置非常依赖一个意义明确的准确测试。Gunetti et al。26)详细解释一次性设备的验证与伯克室相比,虽然Radrizzani et al (5)执行验证的流式细胞术方法。

在我们的实验室,我们决定来验证一个自动化的方法,让全球和可行的总有核细胞计数(TNC)相比,伯克室的准确性、线性度和精确度(重复性精度和中间)。

精度计算精度误差值的均值(区别两个运营商的伯克室和平均值单nucleocassette Nucleocounter)范围内的验收标准−5 / + 5(0.07/0.36作为最小值和最大值自动化的细胞总数和−0.02/0.29自动活细胞计数)。特别是,我们获得最低的差异的手动方法和自动方法可行的细胞计数:平均精度误差为活菌计数细胞总数(图0.11和0.214(一)表)。这些结果表明,训练有素的操作员执行手动方法根据我们写SOP,并能区分视觉完好无损的细胞和那些“死亡的迹象”显示为细胞膜受损。

稀释实验(图4(一))表明,自动和手动方法即使在低浓度细胞保持良好的线性。手动方法的确似乎不如自动精确如简历所示的重复性和中间的精度。值得注意的是,高CV发现使用手工方法似乎并不依赖于运营商可变性;事实上,简历interoperators相对较低(图4 (b))。

这些数据表明,测试自动化方法是准确的,精确的,并确保结果的线性范围的细胞稀释。这些结果还允许定义最佳的细胞之间的细胞计数浓度范围0.2和0.75×10⁶细胞/毫升。

3.5。Immunophenotyping验证

MSC immunophenotypic特征是识别细胞的基本产品在临床应用。缺乏具体和独特的细胞表面标记的异质性特征研究,十多年前,国际社会细胞治疗(ISCT)发布的最小标准定义MSC (27]。除了塑料依从性和体外分化潜力,它被定义为MSC具有CD105的表达,CD73, CD90和缺乏造血和内皮细胞表面标记物的表达如CD14、CD34、CD45, CD11b, HLA-DR和CD31。目前,这些标准仍然是作为接受的标准来定义为临床应用MSC。流式细胞术是最广泛使用的方法immunophenotypic分析还在GMP设置,因为它允许一个快速、multiparametric分析细胞悬液。然而,一些作者已经突显出(28,29日),评估分析测量的灵敏度和线性度的验证此方法的影响缺乏细胞参考资料和难以获得足够的控制(例如,细胞株和不同程度的一个给定的标记表达式)。

作为我们验证过程的一个重要前提,我们首先定义和应用书面程序设置仪器,包括滴定MSC抗体的染色和建立一个特定的收购协议固定荧光设置和补偿(数据未显示)。为了评估我们的能力来检测阳性标记(MSC)确定纯度和造血标记(检测杂质),我们选择与不同浓度的峰值MSC造血线(K562)也有类似的尺寸/散射MSC。为了简化分析,我们决定考虑纯度的两个积极的标记(CD90和CD105)和消极的标记(CD45)杂质。

结果如图5表明,纯度和杂质,我们在所有的实验中获得了良好的线性集( ,数据5(一个)和5 (d))和准确性之间的值是−5 + 5。可重复性计算简历小于5%(数据5 (b)和5(e))和中间精密度小于10%(数据5 (c)和5 (d)),所以所有的验收标准得到满足。这个验证允许我们有一个标准化的协议MSC与确定性纯度能够检测不到5%的杂质。

4所示。结论

质量控制的ATMPs更危及问题:很少有段落的药典致力于细胞产品(例如,微生物控制),而ATMPs通常不代表官方文档。这就是为什么最苛刻的和具有挑战性的操作领域的人参与质量控制是compendial方法适应ATMP设置或验证noncompendial方法。

第一年我们医院GMP的活动设施,第一个批准于2007年在意大利,这是一个重大突破,找到对效率和理性的验证方法正在进行的和未来的临床应用。在这里,我们总结了一些最重要的验证方法来定义移动安全、身份和纯度在临床试验的早期阶段为了给其他GMP制造中心的有用的工具。

根据特定的GMP指南ATMPs [9),效力分析预计将关键的临床试验之前进行验证。效力方面相关的生物细胞功能,它可能会受到许多变量作为供体人口异质性变化和细胞免疫原性,衰老和抗低温贮藏,可能影响其疗效在活的有机体内(30.]。此外,这种可变性和不确定性的作用机制和缺乏参考标准,使得验证策略难以发展。一些团体已经解决这一重要问题(31日,32,他们的作品是非常宝贵的打开一个“竞技场”的讨论ATMPs为了提高档案质量,从而培养他们的可靠性,有效和创新的治疗工具。

数据可用性

生成的数据或分析结果提供了在这个研究和讨论。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突的存在。

确认

这项工作从欧盟第七部分基金支持的项目(CASCADE-Cultivated成人基质细胞替代受损组织,项目没有。223236;REBORNE-Regenerating骨缺陷使用新的生物医学工程方法,项目没有。241879)和欧盟地平线2020 (ORTHOUNION-ORTHOpedic随机临床试验和扩大骨髓MSC和生物陶瓷与自体移植物在长骨骨折不愈合,项目没有。733288;LSFM4LIFE-Production和表征的胰腺内分泌细胞来源于人类瀑样细胞治疗1型糖尿病,项目没有。668350)。作者感谢几个病人协会,帮助在过去或仍支持具体项目正在进行细胞工厂,而且所有作者想提醒基金会La Nuova Speranza-lotta真主安拉glomerulosclerosi focale, Associazione Italiana Parkinsoniani-Fondazione Grigioni / il morbo di帕金森和Associazione genitori alto rischio neonati广告。

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