小鼠皮下和内脏脂肪源性基质细胞(ASCs)的单细胞基因表达分析和治疗功能评价

摘要

介绍．脂肪源性基质细胞(ASCs)由于其多能特性和细胞因子的分泌而成为伤口愈合和组织再生的一种有前途的资源。ASCs通常是从皮下脂肪腔中分离出来的，但也可以从内脏脂肪组织中获得。关于它们等价性的数据是不一致的。本研究分析了皮下(S-ASCs)和内脏(V-ASCs)来源的ASCs的细胞特异性基因表达谱和功能差异。材料和方法．皮下和内脏ASCs取自小鼠腹股沟脂肪和大网膜。在单细胞水平上比较ASCs的转录谱。然后在小鼠伤口愈合模型中比较S-ASCs和V-ASCs，以评估它们的再生功能。结果．在单细胞水平上，S-ASCs和V-ASCs表现出不同的转录谱。具体来说，在与新血管生成和组织重塑相关的基因(例如，Ccl2, Hif1)中检测到显著差异α此外，通过聚类模型可以确定不同的亚群生态。然而，在小鼠伤口愈合模型中，S-ASCs和V-ASCs均诱导加速愈合率和新生血管生成。结论．ASCs在体内具有相似的治疗潜力，但皮下和内脏区ASCs的基因表达模式明显不同，表明其疗效背后存在不同的信号通路。这项研究清楚地表明，回顾体内的转录结果是确定细胞治疗的初步效果的可取之处。

1.介绍

干细胞在再生医学中的广泛应用已经被科学描述了几十年[1]。仅2018年春季，PubMed上就将列出超过25万篇关于干细胞的参考文献。特别是，来自脂肪组织的脂肪基质细胞（ASCs）的巨大潜力被广泛描述[2]由于ASCs具有多种治疗功能，尤其是其旁分泌活性，越来越受到人们的关注[3.以及它们的分化能力和在组织工程中应用的潜力[4］.频谱范围从梗塞后的心脏再生[5]通过伤口的新生血管[6，神经再生[7]，以及神经系统疾病的治愈[8]以治疗骨关节炎[9］.ASCs也是辅助放疗后组织再生的一种选择[10］.

(重新)植入细胞的功能受到各种因素的影响，这些因素的确切相互作用是许多研究的主题[4］.在细胞辅助脂肪移植的背景下，应该注意到引入细胞的剂量对移植细胞的存活有重大影响[11］.此外，已有研究表明，细胞异质性对干细胞治疗的愈合潜力有影响[12］.患者的年龄、性别和既往状况也会影响再生潜能的程度[13]提取技术也是如此[14，15以及单元格应用程序的类型。从不同角度讨论了用于治疗的细胞的来源[16］.一般来说，ASCs是从皮下脂肪室获得的，但也可以从内脏组织中分离这些细胞。以往的研究表明，S-ASCs和V-ASCs具有不同的性质[17］.先前的文献对于来自皮下和内脏的干细胞群的治疗潜力以及供体依赖性的差异是不一致的[18］.例如，在软骨再生潜力方面，使用皮下组织作为ASCs的来源显示了更好的功能[9］.

有必要澄清不同的干细胞群体作为不同适应症的治疗方法的适用性。因此，本研究在单细胞水平分析了来自皮下(S-ASCs)和内脏(V-ASCs)的小鼠ASCs基因表达谱，并比较了这些细胞在建立的小鼠创伤愈合模型中的治疗潜力[19］.

2.材料和方法

2．1．资金

这项工作是由德国研究基金会（DFG）和慕尼黑工业大学（TUM）在开放存取出版计划的框架内支持的。

2．2.单细胞基因表达分析

如前所述，S-ASCs和V-ASCs取自6只小鼠（C57BL/6，3个月大，雄性）的腹股沟脂肪和网膜[6]，所有的实验都按照相关的指南和规定进行。使用CD34+/CD73+/CD90+/CD105+和CD45−/CD31−(排除造血细胞和内皮细胞污染)表面标记谱从SVF(间质血管部分)分离S-ASCs和V-ASCs。使用Becton Dickinson FACSAria流式细胞仪将细胞分类为单个细胞，放入96孔板(每孔1个细胞)，每孔6个细胞μ每孔中加入裂解缓冲液。逆转录和低周期预扩增使用CellsDirect (Invitrogen)和制造商规定的TaqMan引物集(Applied Biosystems)进行。将cDNA加载到96.96 Dynamic Arrays (Fluidigm, South San Francisco, CA)上，使用Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)进行qPCR扩增，使用特定的TaqMan检测引物集[20.］.

２．３．体内伤口模型

12周龄雄性C57Bl/6小鼠随机分为3组:S-ASCs和V-ASCs种子水凝胶(2 × 105 ASCs)和1只未吸收水凝胶对照( 每组)。如前所述[21]，在每只老鼠的背部放置两个6毫米长的溃疡，每个伤口都通过缝合硅胶环来保持开放，以防止伤口收缩。所有伤口都被严密包扎(Tegaderm, 3M, St. Paul, MN)。数码照片是在第0、3、5、7、11和14天拍摄的。使用ImageJ软件(NIH, Bethesda, MD)测量创面面积。

2.4.免疫组织化学（IHC）

伤口闭合后获得组织学样本，并立即植入OCT (Sakura Finetek USA Inc.)。为了评价新血管生成，7微米薄切片进行CD31(1°-1:100 Rb)免疫组织化学染色αCD31、Ab28364 Abcam;2°-1:400 AF547 GtαRb,生活技术)。DAPI染色细胞核，ImageJ软件(NIH, Bethesda, MD)对图像二值化。强度障碍用于量化基于像素阳性区域的CD31染色。

2．5．统计分析

结果以平均值表示 ± 标准误差（SEM）。数据分析由学生的 -测试。结果被认为是重要的 ．对于单细胞表达分析，使用双样本Kolmogorov-Smirnov (K-S)检验来比较经验分布:在 根据Bonferroni对几个样品进行了校正。使用自适应模糊c均值聚类算法和标准欧氏距离度量来选择转录定义的亚种群，如前所述[20.］.每个单元根据其表达式配置文件的相似性给每个簇分配一个偏好，通过分层聚类对最优划分的簇进行平均和过滤，以简化簇内和跨簇数据模式的可视化。基于各自细胞亚群中显著过表达的基因，使用ingenious pathway Analysis (IPA, ingenious Systems, Redwood City, CA)进行典型通路计算和网络分析。

3.结果

３．１．单细胞基因表达分析

使用了以前研究中建立的基因表达分析[22]同时评估与细胞迁移、增殖和组织再生相关的96个基因的单细胞转录谱[17)(表S1)．在单细胞水平上，S-ASCs和V-ASCs表现出不同的转录指纹图谱。特别是，与新血管生成和组织重塑相关的基因(如Ccl2、Hif1)的显著差异说明了这一点α、Fgf7和Igf)(图1(一)和1 (b))．

通过聚类算法可以根据单个细胞的基因表达谱对其进行可靠分组[23]为了进一步研究S-ASCs和V-ASCs表达谱的差异，使用了一种识别特定细胞亚群的算法[22]结果，发现了四个不同的亚群体群（图1（c）)．S-ASCs主要分布在集群1和集群2,V-ASCs主要分布在集群3和集群4(图)1（d）)．

聚类分类进一步揭示了皮下或内脏隔室的起源如何影响细胞水平上的某些关键信号通路。使用高度过度表达的聚类基因作为来源，Ingenuity通路分析（IPA，QIAGEN，Redwood City，CA，http://www.qiagen.com/ingenuity)簇1和簇2的特征是负责细胞外基质重塑和细胞募集的基因显著过度表达（例如，基质金属蛋白酶3（Mmp3； )，胶原蛋白1 a2 (Col1a2; )，基质细胞因子1 (Cxcl12/Sdf1; ）(图2（a）T细胞和补体活化(二肽-肽4 (Dpp4/Cd26; ）和Cd55; ）(图2（b）)．相比之下，聚类3的特征是其他营养因子的表达显著增加，如胰岛素样生长因子1 (Igf1; ）(图2 (c))．Mmp3对集群4的定义相当不明确， (图2 (d))．

３.２．体内创面愈合模型

在证明S-ASCs和V-ASCs代表异质性细胞群，并且这些组织来源之间存在干细胞亚群分布的深刻差异后，我们接下来研究了ASCs的来源在多大程度上影响体内组织修复。尽管基因表达谱存在显著差异，但使用与对照组相比，在已建立的小鼠伤口愈合模型中，f-S-ASCs和V-ASCs均能加快愈合速度（伤口愈合前10.4天，伤口愈合后11.9天； ）治疗组之间无显著差异(图3.)．对愈合伤口诱导新血管生成的组织学评估也显示了两种细胞类型的相似结果，与没有细胞的对照组相比，新血管生成显著增加(图)4)．

4.讨论

干细胞治疗治疗过程的催化作用已经被广泛研究和描述为通往未来的途径[24，25］.特别是，使用基于脂肪组织的基质细胞来加速伤口愈合已经得到了广泛的研究[26，27］.关于成软骨潜能，文献显示使用皮下脂肪组织具有更好的功能[9］.在心肌梗死和随后皮下和内脏ASCs治疗中，心肌功能在增殖和集落形成能力方面存在差异，但在两组治疗中发现心肌收缩力有积极作用，但没有显著差异[5］.

V-ASCs表现出与脂质生物合成和代谢相关的基因簇表达增加。因此，这些差异取决于细胞的来源。与目前的研究相反，V-ASCs和S-ASCs之前通常通过微阵列或PCR进行批量检测，但其粒度低于粒度本文所述的单细胞方法的实施例[17］.

血管新生是ASCs促进创面愈合的重要机制。大量增加的旁分泌，从血液到伤口的祖细胞的募集和功能的增加，可以通过ASC治疗证明[6].用于评估细胞治疗效果的小鼠伤口模型早已建立[28]ASCs对伤口愈合的积极作用已经被多次证实。ASC治疗能够积极影响小鼠模型的伤口愈合，即使是在II型糖尿病和肥胖的情况下[29］.然而，到目前为止，仍然缺乏专门关注细胞采集位点对治疗成功的可能影响的研究[30］.

这里提供的数据表明，皮下和内脏ASC对伤口愈合都有积极的影响。尽管具有相当的治疗潜力，但V-ASCs和S-ASCs的基因表达是完全不同的。通过聚类模型，可以检测到不同的细胞亚群，这些细胞亚群的遗传指纹不同。簇2尤其包含选择的高效再生基因，其表面标记谱（CD26/CD55）可与已经描述的特定功能细胞群相媲美[12]。该簇主要与S-ASCs相关。有趣的是，伤口愈合的内脏储库也提供了一个相关的替代方案。这表明我们研究的96个以上基因可能影响伤口愈合。我们的结果还表明，从alo的遗传指纹中无法得出细胞功能的明确指示将基因表达结果与体内数据相关联对于验证各细胞的功能和效用至关重要。

基因表达在相互作用蛋白方面对伤口愈合的影响还有待进一步研究。进一步的研究必须详细分析特定的细胞因子及其对局部伤口环境的影响。虽然已经证明了软骨源性愈合的巨大差异[9]，我们无法显示S-ASCs和V-ASCs在伤口愈合方面的差异。这进一步表明，特定的细胞治疗适应症需要独立的临床前评估细胞治疗的有效性。

5.结论

目前的研究表明，与内脏腔室相比，皮下腔室ASCs的基因表达谱具有高度的异质性。ASCs在创面愈合模型中具有相似的治疗潜力，但其显著不同的基因表达模式提示不同的机制信号通路。这项研究清楚地表明，回顾体内转录结果有助于从功能上确认细胞治疗的潜在效果。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

利益冲突

Dominik Pförringer没有利益冲突。Matthias M. Aitzetmüller没有利益冲突。伊丽莎白·a·布雷特没有利益冲突。Khosrow S. Houschyar没有利益冲突。Richard Schäfer没有利益冲突。马丁·范·格林斯文没有利益冲突。多米尼克·杜舍尔没有利益冲突。

补充材料

表S1:微流控单细胞基因表达分析的基因名称和检测id。（补充材料）

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