文摘

背景。免疫治疗宫颈癌的I型干扰素(IFN)是有限的,因为伴随的高剂量的细胞毒性。在这项研究中,我们研究了利用羊膜fluid-derived间充质干细胞(AF-MSCs)提供干扰素α当地肿瘤抑制宫颈癌的网站在使用海拉细胞异种移植小鼠模型。方法。的肿瘤趋向性能力AF-MSCs AF-MSCs转基因过多表达干扰素α(干扰素α-AF-MSCs)检查通过Transwell体外和在小鼠模型和免疫荧光图像。观察肿瘤大小和肿瘤细胞凋亡对靶向治疗的疗效进行评估。从力学上看,肿瘤细胞凋亡检测血细胞计数和TUNEL和致癌蛋白原癌基因,p53、bcl - 2以及通过免疫组织化学方法观察微血管密度。结果。在这个模型中,通过静脉注射AF-MSCs选择性肿瘤迁移到网站,参与肿瘤的建设,促进了肿瘤的生长。在转基因过度表现干扰素α,干扰素α-AF-MSCs维护他们的肿瘤趋向性但可以显著抑制肿瘤的生长。干扰素的限制性的功效α-AF-MSCs与血管生成的抑制,抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞的凋亡。无论是AF-MSCs还是干扰素α-AF-MSCs引发肿瘤的形成。结论。干扰素α-AF-MSC-based治疗是可行的,显示了潜在的治疗宫颈癌,这表明AF-MSCs可能是有前途的车辆提供有针对性的抗癌治疗。

1。介绍

宫颈癌是女性生殖系统恶性肿瘤死亡率的主要原因,全球重大危害女性健康。虽然可以有效治疗宫颈癌胆囊切除术在早期阶段,晚期癌症的治疗似乎是低效率导致患病率高。新的分子治疗发展迅速1]。因为人类乳头状瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌的一个已知的原因(2),干扰素α抗病毒药物以及抗肿瘤细胞因子,已广泛应用于临床治疗宫颈癌的3,4]。干扰素α不仅被认为是免疫调节,也可以抑制肿瘤的生长,诱导细胞凋亡(5]。然而,由于高剂量的系统性管理的干扰素α,细胞毒性是不可避免的副作用,这种蛋白质的短半衰期也阻碍着它达到所需的浓度在肿瘤网站(6]。目前,正在探索干细胞作为靶向治疗的一种有前景的候选车辆。

间充质干细胞(msc),一个细胞群,可以发现在不同的组织,能够自我更新,可以很容易地分离和培养,因为他们可以坚持塑料(7,8]。他们不仅是低免疫原性和致肿瘤性,但他们也可以选择性地迁移到肿瘤的网站(2,3,9,10]。曾有一些报道说的使用有效cytotherapy msc在不同肿瘤模型(11- - - - - -15]。一项研究表明,骨髓(BM) msc修改表达干扰素β也可以专门招募到肿瘤部位,导致肿瘤抑制12]。此外,Rachakatla等人表明,在乳腺癌的典范,msc从脐带分离矩阵(ucm细胞)表现出同样的特定迁移到肿瘤的基因工程细胞分泌干扰素β显著降低肿瘤负荷(16]。尽管研究msc BM和其他来源的抗肿瘤作用已被广泛报道,很少有人关注羊膜fluid-derived msc (AF-MSCs)。AF-MSCs可以通过羊膜穿刺术,比骨髓穿刺微创、安全。AF-MSCs有类似特征的人类BM-MSCs但分化较低(17]。由于他们有利的特性,包括稳定的特点,nontumorigenicity、低免疫原性(18),AF-MSCs正在成为一个新的候选人在再生医学和抗癌治疗17,19]。大多数现有研究AF-MSCs与再生医学领域的应用,特别是在组织修复急性损伤模型(20.- - - - - -23]。重要的是,这些研究利用msc的先天能力迁移到炎症信号网站。因此,研究人员推断,AF-MSCs应该能够灌输肿瘤站点,无论组织起源,在损伤模型,作为抗肿瘤分子[运载工具3,13,24,25]。

基于上述的研究msc在抗肿瘤应用程序中,在这项研究中,我们进行调查的能力AF-MSCs迁移到宫颈癌细胞在体外和体内。此外,我们探讨AF-MSCs的功效,尤其是工程表达干扰素α宫颈癌的治疗。

2。方法

2.1。AF-MSCs隔离和表征

人类AF-MSCs孤立的羊水在怀孕中期妊娠。所有临床调查根据表达的原则进行了《赫尔辛基宣言》。羊水样本(5 - 15毫升)通过羊膜穿刺术超声控制吸气与知情同意。每个样本在1000转离心10分钟,和细胞颗粒resuspendedα修改鹰的介质(αmem)(美国Hyclone)包含谷酰胺补充15%胎牛血清(美国Gibco的边后卫)和1%的penicillin-streptomycin混合物6-well盘子和孵化在37°C调湿有限公司5%2室。7天后,不依从细胞被移除和媒介被丢弃。附着在新鲜培养基培养细胞,直到克隆出现了。随后,每3天中被改变,贴壁细胞使胰蛋白酶化和亚文化达到80%时-90%的融合。

确定这些细胞AF-MSCs,几个特定的细胞表面标记这种类型的干细胞(CD90、CD105 CD73, HLA-ABC, CD34, CD14、CD45、和HLA-DR)通过流式细胞术进行评估。此外,AF-MSCs分化成骨细胞的能力评估。在1×10 AF-MSCs被播种5/厘米26-well盘子和培养的成骨的介质(αmem补充10%的边后卫,0.1 l更易与地塞米松,10 l更易与磷酸甘油,50更易与l抗坏血酸盐)。每3天中被改变,细胞染色茜素红21天来评估的存在钙化结节。

2.2。海拉细胞

海拉细胞,来自人类宫颈癌,郑博士的礼物(妇科、哈尔滨医科大学第一附属医院)。1640年细胞培养介质(美国Hyclone)补充10%的边后卫和1% penicillin-streptomycin混合物。

2.3。制备干扰素α-Overexpressing AF-MSCs

干扰素α信使核糖核酸的互补脱氧核糖核酸是reverse-transcribed和放大从外周血单核细胞中提取(PBMCs)获得中国志愿者。pTY-CMV-eGFP HIV-1-based慢病毒质粒转移,包含了增强型绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因,是由博士提供的CMV启动子,c·李(南方医科大学,中国)。表达干扰素α使用这个慢病毒载体,eGFP基因替换为干扰素αcDNA、和结果转移质粒被任命为pTY-CMV-IFNα。质粒转移,pTY-CMV-IFNα包装质粒,psPAX2 pMD2。G(美国Addgene)被用来使转染293 t细胞,脂质体2000(美国英杰公司)生产VSV-G准型,干扰素α第慢病毒。转染细胞培养48 h,允许生产的重组病毒。重组病毒收获,滴定,然后用来感染AF-MSCs感染复数(moi) 0.75 pg / ml(定义为病毒逆转录酶的活性)48 h。retrovirus-infected,干扰素α第细胞(干扰素α-AF-MSCs)选择由于嘌呤霉素的耐药性。为进一步识别、干扰素α-AF-MSCs也受到干细胞表面标记测试(CD90、CD105 CD73, HLA-ABC, CD34, CD14、CD45、和HLA-DR)流式细胞术。干扰素的水平α干扰素表达的α-AF-MSCs和msc被ELISA检测(Pbl生物医学实验室,美国)。

2.4。AF-MSCs贴上CM-DIL

评价的取向msc对癌症细胞体内,AF-MSCs和干扰素α-AF-MSCs用荧光标记细胞表面标记,CM-Dil(表达载体),通过孵化工作解决方案5μg / ml CM-Dil 5分钟在室温下,紧随其后的是20分钟的孵化在4°C。标签后,细胞被洗PBS和栽培的新媒介注入老鼠之前,发生在24 h。

2.5。体外Transwell迁移试验

确定AF-MSCs的取向和干扰素α-AF-MSCs海拉细胞体外,Transwell迁移试验进行了如前所述[13]。1640年海拉细胞被培养24小时中含有10%的边后卫;使胰蛋白酶化后,海拉细胞被resuspended和镀1×106/ 2毫升的下井Transwell钱伯斯和允许坚持24 h。培养后在αmem(0.5%的边后卫)24 h, AF-MSCs和干扰素α-AF-MSCs被镀上的钱伯斯和8μm毛孔(美国康宁合演)1×10的密度5/ 800μl。HSF,之前在DMEM培养+ 10%的边后卫,被用作控制。这些房间在37°C孵化24小时允许msc迁移。然后,没有迁移的细胞从参议院用湿棉拭子,和细胞迁移是固定的,用台盼蓝染色。图像的彩色细胞迁移到Transwell室的底部通过上层膜获得使用徕卡DMI4000B倒置相差显微镜(德国徕卡)。细胞的数量在4大功率领域每个膜(×200)为手工计算。

2.6。分析凋亡海拉细胞的干扰素α-AF-MSCs体外

干扰素α产生的干扰素α-AF-MSCs测量通过ELISA在CM P1-P5干扰素α-AF-MSCs。CM收集48小时后转导从三个随机的井。

msc及干扰素α-AF-MSCs从段落5、10、15、20人收获和resuspended a-MEM含有10%(卷/期)的边后卫的浓度为1×104细胞/毫升,镀成24-well板块在5000细胞(500μl)好,湿润37°C孵化器孵化24小时5%以下有限公司2允许细胞坚持盘子。细胞从三个随机的井数为8天,情节和平均值用于细胞。

AF-MSCs和干扰素α-AF-MSCs与海拉细胞cocultured探讨msc在宫颈癌细胞的细胞病变效应。海拉细胞被镀在较低的12-well Transwell板块5×105细胞/毫升的边后卫(10%),1640年在msc镀上井(0.4μ米多孔插入)αmem的边后卫(10%),然后培养24小时。然后,上井AF-MSCs或干扰素α-AF-MSCs插入底部包含海拉细胞,和两层细胞cocultured Transwell室72 h。海拉细胞培养没有msc被用作消极的控制。海拉细胞被使胰蛋白酶化和彩色FITC-labeled膜联蛋白V凋亡检测装备II(美国BD)根据制造商的说明进行流式细胞仪使用前BD流式细胞仪咏叹调流式细胞分析仪。

2.7。动物主题

女性裸体小鼠(Balb / c裸)购自上海Slac实验动物有限公司,他们被安置在动物中心哈尔滨兽医研究所特定病原体免费(SPF)条件。5天之后举行的老鼠到来之前让他们适应实验进行。所有动物和人类研究进行符合美国卫生和人类服务部指导的护理和使用实验动物,科学研究办公室批准哈尔滨医科大学第一附属医院。

2.8。体内迁移分析

eGFP-HeLa细胞注射皮下注射1×10的浓度7/毫升到6周大的雌性Balb / c裸小鼠(第0天)。10天后,老鼠肿瘤明显时,得到了三个剂量的5×106/毫升CM-Dil-dyed AF-MSCs ( )或干扰素α-AF-MSCs ( 每5天),牺牲了msc的最后注射后4天。荧光信号的跟踪、肿瘤和器官(肝、肺、脾、肾)收集和制成cryosections和石蜡的部分。在cryosections荧光图像是通过激光共焦显微镜获得的(德国徕卡)。

另一组老鼠( )静脉给AF-MSC(注射),和三个老鼠从每组牺牲了1天,第三天,第七天,13天。肿瘤收集分析AF-MSCs在肿瘤的分布。免疫组织化学(包含IHC)与一个反人类的CD90抗体进行跟踪的msc石蜡切片。

2.9。肿瘤的分析

建立肿瘤,200μl(海拉细胞悬液(悬浮在盐水)皮下注射1×10的浓度7/毫升到6周大的雌性Balb / c裸小鼠。10天之后,肿瘤明显时,1×106AF-MSCs ( )或干扰素α-AF-MSCs ( )管理输液成交量为200尾静脉μl。MSC注射三次进行7天的间隔。肿瘤小鼠注射用生理盐水被指定为控件( )。所有活老鼠的肿瘤被卡尺测量整个观察期。

一个星期最后一次注射后,每组随机选择只老鼠( 为对照组 AF-MSC和干扰素α-AF-MSC组)被牺牲,肿瘤被收集。分泌干扰素α从干扰素α-AF-MSC肿瘤网站和其他器官被免疫组织化学检测。探索体内细胞凋亡的程度,TUNEL染色进行使用原位细胞死亡检测装备舱(美国罗氏公司)根据制造商的指示。TUNEL-positive随机选择的10个领域里的细胞数×400放大每个肿瘤。此外,包含IHC致癌蛋白原癌基因,研究p53、bcl - 2被用来确定其表达式。提出了这些凋亡蛋白的表达水平的平均密度Image-Pro + 6.0 (IPP)。

此外,微血管密度(MVD)也在这些肿瘤评估。MVD与抗体进行染色对CD34抗原(Dako、丹麦),和积极性是由光学显微镜使用计算方法引入了魏德et al。26]。短暂的地区包含的最大数量的幻灯片micro-blood船只被选择在低功耗领域;个人微血管数×200放大。孤立的免疫反应性的内皮细胞和细胞腔的微血管结构都视为可数的船只。

2.10。免疫组织化学

样品在10%多聚甲醛固定,脱水,嵌入在石蜡,分段在4μm。部分deparaffinized在二甲苯为30分钟,100%的酒精为2分钟,10分钟的过氧化氢,酒精1分钟每洗。幻灯片是沉浸在相应的检索解决方案和加热。冷却后,部分与相应的主要抗体染色1 h在室温下(反CD90(美国Bioworld 1: 200),反干扰素α(bios、中国、1:300),anti-c-Myc (Ebioscience,中国,1:200),anti-P53 (Ebioscience, 1: 300), anti-Bcl-2 (Abcam,香港,1:200),和anti-CD34 (Dako、丹麦、1:250)),在运行自来水冲洗,沾染了二级antibody-1(美国GBI) 20分钟和二级antibody-2 30分钟,清洗与民建联和发展,并与苏木精复染色,盐酸和氢氧化铵。

2.11。评价AF-MSC致瘤性

雌性Balb / c裸小鼠4周大被随机分配到实验组。AF-MSCs隔绝一个羊水样本,提出了大扩散能力在段落13日至15日,用于注入。干扰素α-AF-MSCs和AF-MSCs致瘤性进行评估。1×10的移植小鼠皮下注射7AF-MSCs ( )或干扰素α-AF-MSCs ( 200年)暂停μl盐水右侧的背上,等量的生理盐水就另一方面的管理控制。所有的老鼠都牺牲了移植后50天。注射部位的皮下组织、肺、肾、肝、脾、收集和固定在10%多聚甲醛。他染色进行病理诊断。

2.12。统计分析

组之间的差异是使用参数或非参数评估学生的t以及或单向方差分析。所有报告 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。AF-MSCs被孤立和干扰素的准备α超表达

分离、培养人类AF-MSCs在材料和方法部分,所述第一个克隆的贴壁细胞出现初始镀后7天。细胞出现一轮、纺锤形或多边形的主要文化,逐步改变与增加通道典型的呈纺锤形。细胞观察旋转或径向排列后培养14天,这是类似于msc报道的形态从其他来源(7,27]。定义msc、特定标记的干细胞被流式细胞仪检测。这些细胞阳性CD90、CD105 CD73,和CD34 HLA-ABC和消极,CD14、CD45、HLA-DR(图S1a)。此外,这些细胞分化成chondrogenic血统,因为之前报道(28)(图印地)。这些结果表明AF-MSCs被成功分离和培养。开发AF-MSCs,一直过表达正无穷α,这些细胞被感染HIV-1-based pseudovirus包含人类正无穷α互补脱氧核糖核酸。大约11000 pg / ml干扰素α是由1×10吗624小时IFN-MSCs postinfection (hpi),通过分析确定培养基使用干扰素α检测酶联免疫试剂盒。更重要的是,干细胞标记(CD90、CD105 CD73, HLA-ABC, CD34, CD14、CD45、和HLA-DR)干扰素的表达吗α-AF-MSCs MSC-alpha实际上是符合MSC空的,这证明了细胞的稳定性。这些干扰素α第msc(干扰素α-AF-MSCs)被用于随后的体外和鼠标实验。

3.2。AF-MSCs转向海拉细胞体外

AF-MSCs向癌细胞的取向是评估通过检查AF-MSCs海拉细胞的迁移,宫颈癌细胞系,使用一个体外Transwell系统。作为显示在图1,这些干细胞表现出显著更高的取向与HSF相比海拉细胞细胞的迁移对海拉(140倍增加, )。同样,msc感染了干扰素α表达慢病毒(干扰素α-AF-MSCs)显示一个伟大的海拉细胞趋向性。无显著差异的迁移AF-MSCs和干扰素α——AF-MSCs被观察到。

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图1
迁徙能力AF-MSCs和干扰素α-AF-MSCs向海拉细胞培养。(a)的图像AF-MSCs和干扰素α-AF-MSCs,转向海拉细胞,由Transwell迁移试验。海拉细胞被precultured Transwell的下井室24 h。AF-MSCs,干扰素α-AF-MSCs, HSF被镀上室的。24 h后,干细胞迁移到膜固定,用台盼蓝染色。显微镜的细胞数。酒吧,100μm。(b)图AF-MSCs的迁移能力和干扰素α-AF-MSCs。4大功率领域的细胞(×200)/膜是手工计算。代表三个独立实验的数据。误差线,标准差, 。
3.3。体内肿瘤移植AF-MSCs转向网站

免疫组织化学结果CD90跟踪(图2(一个))表明,在第一天AF-MSCs管理后,在AF-MSCs大多分布在肿瘤的边缘和几乎不能被发现在深部肿瘤区域。在第三天,一些cd - 90阳性细胞开始出现在肿瘤内部,尤其是在基质区域良性的肿瘤细胞组成。天7和13天,更发现AF-MSCs渗透到肿瘤。此外,除了外围和基质地区,许多AF-MSCs观察周围坏死的区域。几个AF-MSCs被确定在脾脏和肝脏perivessel地区整个研究。没有发现CD90-positive细胞在消极的控制。Cryosections表明,边缘有红色荧光和肿瘤内部质量,AF-MSCs(图2 (c))和干扰素α-AF-MSCs(图2 (d))主要是观察结缔组织区域的肿瘤,也有小红荧光在脾脏和肝脏,肾脏可以看到但没有荧光信号或肺组织(图2 (b))。

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图2
取向的管理AF-MSCs肿瘤小鼠模型。(一)免疫组织化学(包含IHC)显示AF-MSCs CD90表达式。肿瘤被收集和检查在第一天,第三天,第七天过去后注入。未经治疗的肿瘤染色CD90作为消极的控制。酒吧、25或50μm。(b)包含IHC AF-MSCs的肝脏和脾脏。很少观察msc。酒吧,25μm。(c, d)观察CM-Dil-labeled AF-MSCs和干扰素α-AF-MSCs(红色)eGFP-HeLa(绿色)肿瘤荧光显微镜。酒吧、10、25或50μm。海拉细胞表达eGFP (eGFP-HeLa)皮下注入裸体小鼠的支持( 在1×10)7/毫升/鼠标。AF-MSCs和干扰素α-AF-MSCs贴上红色荧光染料CM-Dil,和最初的海拉细胞接种后10天,5×106/毫升的msc、或干扰素α-AF-MSCs的尾静脉注入肿瘤小鼠每5天。包含IHC和荧光显微镜观察AF-MSCs的渗透。
3.4。干扰素α-AF-MSCs Cocultured海拉细胞的诱导细胞凋亡

在CM的干扰素α从P1-P5 -AF-MSCs,恒定的干扰素α表达式被ELISA测试监控。水平的表达干扰素α从P1-P5干扰素会稳定吗α-AF-MSCs(11490.5±107.5到11422±68.5 pg / ml, ,图3(一个)),几乎没有任何干扰素α表示测试在AF-MSCs厘米(911.5 pg / ml, ,图3(一个))。

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图3
诱导细胞凋亡的海拉细胞干扰素α-AF-MSCs体外。(一)分泌干扰素浓度α在CM的干扰素α-AF-MSCs连续的通道。干扰素-α产生的干扰素α-AF-MSCs AF-MSCs是衡量从P1-P5 ELISA在CM中。CM收集48小时后转导从三个随机的井。(b)干扰素分泌的生物活性α在干扰素α-AF-MSC增殖。msc及干扰素α-AF-MSCs从段落5、10、15和20被镀成24-well板块在5000细胞(500μ每口井的l),允许细胞坚持盘子。细胞从三个随机的井数为8天,和平均值用于评估细胞增殖。(c)的海拉细胞诱导凋亡coculture干扰素α-AF-MSCs。AF-MSCs或干扰素α-AF-MSCs与海拉细胞被cocultured 12-well Transwell板块72 h。海拉细胞单独培养的是消极的控制。coculture之后,海拉细胞的凋亡数量评估通过FITC-labeled膜联蛋白V / PI染色流式细胞术。凋亡的人群,包括早期(膜联蛋白V + /π−)和后期(PI膜联蛋白V + / +)凋亡细胞,在海拉细胞评估cocultured AF-MSCs和干扰素α-AF-MSCs。代表三个独立实验的数据。误差线,标准差 , 。

AF-MSCs和干扰素的增长曲线α-AF-MSCs大致形状的“S”(图3 (b)),在观察MSC增殖没有明显降低干扰素的存在α生产。细胞在拘留期间使后待了两天,然后转向对数期,不再增加7天之后。十代细胞的增殖是慢于第五代。

评估潜在的干扰素治疗效果α-AF-MSCs抑制肿瘤细胞增殖,干扰素α-overexpressing AF-MSCs cocultured了海拉细胞在Transwell系统中,人口和凋亡的肿瘤细胞,流式细胞术检测通过膜联蛋白/ propidium碘(π)染色。结果呈现在图3 (c)表明,coculture干扰素α月初-AF-MSCs造成大量增加(膜联蛋白V + /π−)和后期(PI膜联蛋白V + / +) apoptoses海拉细胞。凋亡的总百分比(早期和晚期apoptoses)海拉细胞从3.45±1.44%增加到84.57±1.67%的干扰素α-AF-MSCs ( )(图3 (c))。相比之下,海拉细胞的coculture AF-MSCs诱导宫颈癌细胞的凋亡更低(8.12±0.73%),这仍然凋亡率明显高于观察海拉细胞单独培养( )。

3.5。移植的干扰素α-AF-MSCs显著降低海拉异种移植小鼠的大小

探讨干扰素的细胞疗法的疗效α-AF-MSCs AF-MSCs ( )或干扰素α-AF-MSCs ( )静脉注射(注射)到尾静脉接种肿瘤的老鼠。肿瘤的老鼠没有收到msc被用作控制。静脉输液注射1×106msc是每周进行3轮,老鼠( 在对照组, 在其他两组)牺牲了msc的最后注射后7天内肿瘤及肿瘤细胞凋亡分析集合。肿瘤大小是衡量整个实验周期。

如图4msc管理之前,没有显著差异的大小肿瘤从小鼠获得的四组。3 msc隔开间隔注射后的7天内,肿瘤大小的老鼠接受干扰素α-AF-MSCs开始显示与对照组相比显著差异( 自20天。测量肿瘤大小32天(7天后最后注入),如图4 (b)干扰素、肿瘤α-AF-MSC集团( )分别为434.99±165.79毫米3明显小于对照组(653.89±227.84毫米3)( )。此外,肿瘤大小的差异之间的老鼠用干扰素治疗α-AF-MSCs和未经处理的小鼠是很有意义的,当完全通过观察期间(图52天4(一))。

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图4
干扰素的作用α-AF-MSCs AF-MSCs在老鼠模型中肿瘤的生长。(一)比较,肿瘤的生长与不同的msc的道,海拉细胞接种后36天。根据测量肿瘤大小在皮肤下。MSC注入时间点由箭头表示。误差线,标准差。(b, c)比较小鼠肿瘤体积的牺牲在32天(7天后的最后注入msc)。误差线,标准差。海拉细胞(1×107/毫升)皮下注入裸小鼠(第0天)。10天后,肿瘤明显时,1×106/毫升AF-MSCs ( )或干扰素α-AF-MSCs ( )的尾静脉输液注射到肿瘤小鼠每七天。这个过程进行了三次。十的老鼠没有管理与msc指定为对照组。一些老鼠( 在对照组和 在其他三组)牺牲七天过去注射后肿瘤干细胞的集合。(d)分泌干扰素α通过免疫组织化学方法检测肿瘤组织中小鼠接受干扰素吗α-AF-MSCs ( ),很少的干扰素α肝脏中发现,没有一个在脾、肾、肺。没有干扰素α被发现的老鼠AF-MSCs集团( )。组织收集最后注射干扰素后7天α-AF-MSCs ( )或AF-MSCs ( )。
3.6。AF-MSCs增强小鼠HeLa-Derived肿瘤的大小

与干扰素的抑制作用α-AF-MSCs希拉异种移植小鼠的生长,在untransfected AF-MSCs显著提高肿瘤的生长。对整个观察,平均肿瘤大小AF-MSC组(364.72±272.51)显著大于干扰素α-AF-MSC (260.93±189.12, )。特别是,当肿瘤对照组的增长率开始下降26天,AF-MSC-injected老鼠的肿瘤大小和持续增加成为了控制明显大于那些老鼠。

3.7。分泌干扰素α集中在肿瘤站点在干扰素吗α-AF-MSC-Treated模型小鼠

确认干扰素的治疗效果α-AF-MSCs是干扰素的结果α集中在当地的肿瘤,分泌干扰素α通过免疫组织化学方法检测肿瘤组织,肝、脾、肾、肺肿瘤的老鼠。组织收集最后注射干扰素后7天α-AF-MSCs ( )或AF-MSCs ( )。老鼠接受干扰素α-AF-MSCs,大量分泌的干扰素α肿瘤中发现了网站,特别是perivessel和基质区域(图4 (d))。一个小干扰素α在肝脏中发现,没有干扰素吗α被发现在脾脏、肾脏或肺(图4 (d))。更重要的是,没有干扰素吗α在老鼠身上发现了接收AF-MSCs,无论是在肿瘤中,还是在器官(图4 (d))。

3.8。干扰素α-AF-MSCs和AF-MSCs增强小鼠的肿瘤细胞凋亡模型

探讨干扰素抑制作用的机制α-AF-MSCs希拉异种移植的肿瘤生长,TUNEL检测凋亡细胞和包含IHC致癌蛋白(原癌基因、p53、bcl - 2)进行。从小鼠肿瘤接受干扰素α-AF-MSCs ( )或AF-MSCs ( )被移除后7天的最后注入msc、和石蜡部分被用于原位TUNEL分析,包含IHC。肿瘤的肿瘤的老鼠没有收到msc ( )进行分析控制。

如数据所示5(一个)和5 (b)干扰素的移植α-AF-MSCs诱导凋亡细胞的比例明显高于(32.76±4.67%)比未经处理的小鼠肿瘤的肿瘤(7.51±2.67%, )和MSC-treated老鼠(17.63±3.69%, )。有趣的是,尽管政府AF-MSCs很大程度上增强了肿瘤的生长,也诱导高水平的细胞凋亡在肿瘤细胞(17.63±3.69%)。与此同时,msc或干扰素的效果α-overexpressing msc三种蛋白质的表达水平与个体发育(原癌基因、p53、bcl - 2)被包含IHC检测。这些蛋白的表达水平进行分析,量化积极使用Image-Pro +染色细胞的密度(IPP) 6.0软件。结果表明,平均密度的原癌基因在肿瘤部分准备干扰素α-AF-MSC-engrafted老鼠(0.0223±0.0101, )明显低于对照组(0.0374±0.0064, , ),但没有观察到显著差异之间的其他两组。没有明显差异在p53、bcl - 2的表达水平(数字5 (d)和5(e))。

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图5
增加细胞凋亡和减少原癌基因表达在肿瘤小鼠与干扰素的道α-AF-MSCs。(一)TUNEL检测肿瘤的收获后7天持续静脉输液管理msc。酒吧、25μm。(b)比较肿瘤从每组凋亡细胞的老鼠。对于每一个肿瘤,TUNEL-positive细胞数在5×400放大随机选择的区域。误差线,标准差。(c)原癌基因的表达,p53、bcl - 2在肿瘤。发达的实体肿瘤从1×107/毫升海拉细胞皮下接种裸小鼠删除并加工成石蜡切片进行进一步分析。肿瘤收集一周后的三周注射1×106AF-MSCs或干扰素α-AF-MSCs ( 每组)。从三个未经处理的小鼠肿瘤控制进行了分析。肿瘤并行准备部分都用于包含IHC使用相应的特定的抗体和同形像控制抗体。酒吧,25μ原癌基因m。(d)量化结果,p53、bcl - 2表达的平均密度。彩色部分是读通过显微镜和量化使用Image-Pro + (IPP) 6.0软件。10个随机选择的字段的平均密度×400放大每个肿瘤。所有收获肿瘤进行了分析。误差线,标准差 ,
3.9。干扰素α-AF-MSCs显著降低小鼠的肿瘤血管生成模型

调查是否限制血管生成与肿瘤生长的抑制干扰素α-AF-MSCs,血管在肿瘤的部分从MSC-engrafted和纽曼老鼠被检查。微血管密度(MVD)评估肿瘤血管生成分析利用CD34抗体。在这个实验中使用的石蜡切片获得来自同一肿瘤被用于细胞凋亡分析。计算方法引入了魏德et al。26)是利用。如图6在×200放大在光学显微镜下,有可数的肿瘤血管明显减少干扰素α-AF-MSC-engrafted老鼠(25±6)与未经处理的小鼠(35±2, )。然而,无显著差异在MVD AF-MSC-engrafted组(38±3)相比,在未经处理的控制( )。

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(b)
图6
减少肿瘤血管生成的干扰素α-AF-MSCs小鼠模型。(一)代表的图像每组微血管密度最高的地区。酒吧,25μm。(b)比较不同实验之间的MVD组。误差线,标准差。实体肿瘤的裸鼠由1×107/毫升的皮下注射海拉细胞被移除,加工成石蜡切片测量微血管密度(MVD)。肿瘤收集一周后的三周注射1×106AF-MSCs和干扰素α-AF-MSCs ( 每组),从三个未经处理的小鼠肿瘤控制进行了分析。CD34 Micro-blood船只被包含IHC染色显示,和个人在至少五个字段在每个肿瘤微血管数×200放大。孤立的内皮细胞和细胞腔的微血管结构被认为是可数的船只。 。
3.10。移植的AF-MSCs没有导致模型小鼠肿瘤形成

调查是否道msc可以形成肿瘤或接受者造成严重的副作用,还是裸小鼠皮下接种1×107AF-MSCs或干扰素α-AF-MSCs ( 为每个组)。小而硬肿胀像非特异性炎症在第一个移植后3天,但这个逐渐消失了。老鼠保持50天前被牺牲了。明显的减肥和其他健康状况不佳的症状观察实验期间。在注射部位没有发现可见的实体肿瘤或其他器官的三组老鼠。病理诊断通过hematoxylin-eosin -(他)彩色幻灯片证实肿瘤形成的缺失(图S2)。这些结果表明,hAF-MSCs和那些设计来表达干扰素α潜在安全用于移植治疗。

4所示。讨论

虽然干扰素α是有效治疗宫颈上皮内瘤(CIN)和宫颈癌的临床试验1,29日),其细胞毒性副作用,由于高剂量的管理,是不可避免的。因此,cell-based-targeted治疗探索。由于他们天生能力的肿瘤趋向性,msc来自各种来源,如大英博物馆和脐带,广泛研究作为药物运载工具在各种类型的癌症的治疗11,12,16,30.]。因为AF-MSCs很容易获得稳定的自我更新和增殖特性,他们有很大的潜在的治疗应用。我们的研究显示,修改AF-MSCs表达干扰素α颈是有效地抑制肿瘤的生长。

因为宫颈癌大多是由HPV感染引起的,我们选择了海拉细胞,这是源于人类乳头状瘤病毒18-affected宫颈细胞,作为我们的研究对象。我们的研究表明,AF-MSCs选择性迁移到肿瘤部位后移植,这种取向能力保留即使在msc是转基因表达干扰素α。此外,我们发现AF-MSCs和干扰素α-AF-MSCs特别在肿瘤周边,发现基质区域内部,坏死及周边地区。这一发现与先前的许多协议研究msc的归巢能力(11- - - - - -13]。道的msc在肿瘤部位被认为导致间质成纤维细胞的数量和参与肿瘤形成3]。固体肿瘤环境由恶性肿瘤细胞和基质成分和msc有可能转变成激活myofibroblasts或分化成纤维细胞,产生ECM组件和血管周的或血管结构。肿瘤微环境是一个网站,趋化因子和细胞因子,如VEGF、尿激酶纤溶酶原激活物(uPA),引发,转化生长因子beta 1 (TGF-b1)和单核细胞趋化蛋白1,大量分泌,这些分子可以诱导msc的归航13,31日]。

因为msc能够选择性地嫁接和参与肿瘤基质的发展,这种招聘工作在cell-based-targeted“特洛伊木马”的方法治疗。我们的研究表明,AF-MSCs工程表达干扰素α是有效的肿瘤抑制小鼠模型的子宫颈癌。当海拉细胞被cocultured干扰素α-AF-MSCs,大量的干扰素α产生的干扰素α-AF-MSCs诱导肿瘤细胞凋亡。在干扰素α-AF-MSC-treated老鼠分泌干扰素α才发现聚集在肿瘤站点,甚至呈现类似分布AF-MSCs显示在前面的取向的调查。与此同时,显著降低肿瘤大小也观察干扰素α-AF-MSC组。总的来说,干扰素α-AF-MSCs明显疗效证实肿瘤抑制干扰素的目标交付α通过干扰素α-AF-MSCs是有效的,即使在复杂的体内环境组成的代谢和细胞因子的相互作用。更重要的是,我们还发现更大的区域内的坏死肿瘤IFN-MSC-treated老鼠的质量比其他群体这意味着IFN-MSC治疗的功效不仅仅是通过显示或判断肿瘤的视觉外观质量。

干扰素的肿瘤抑制作用α-overexpressing msc可能是由于一个诱导损伤肿瘤细胞(如更高的细胞凋亡,在体外和体内实验)和/或抑制肿瘤细胞的增殖(如减少供应营养和缺氧环境)。肿瘤抑制基因p53基因bcl - 2是两个重要的基因和细胞凋亡控制细胞的生存。他们被报道参与宫颈癌的致癌作用(32]。P53表达检测在宫颈癌的早期阶段致癌作用和在发展为宫颈癌的发病中扮演重要角色32]。Protooncogenes如原癌基因直接代谢和蛋白质合成的变化支持增强的扩散率。原癌基因的基因拷贝数获得显著提高宫颈病变的先进组织学评分(33,34]。在我们的研究中,原癌基因表达下降在宫颈癌细胞的干扰素α-overexpressing MSC治疗,而p53和bcl - 2有关。它也知道,增强血管生成对肿瘤的生长至关重要。之前的研究评估潜在的骨骨髓来源间充质干细胞(MSC),转基因表达干扰素(IFN) - alpha,治疗肺转移的免疫活性的转移性黑色素瘤小鼠模型,表明抗肿瘤效应可能与潜在的血管生成减少和/或诱导肿瘤细胞凋亡(35]。因此,我们评价干扰素的效果α-AF-MSCs在异种移植模型通过检查血管生成在肿瘤MVD,发现显著减少血管的价格相比对照组。反过来,这种减少血管生成可能促进肿瘤细胞的凋亡诱导干扰素α-AF-MSCs。我们发现的血管生成抑制符合一项研究[13使用膀胱肿瘤模型),证明干扰素β-AF-MSC治疗导致减少血管化。

实验结果对msc是否促进或抑制肿瘤的生长一直存有争议。msc在一些模型显示抑制肿瘤生长的肿瘤,如神经胶质瘤,卡波西氏肉瘤,恶性黑色素瘤,Lewis肺癌和结肠癌癌(15,30.,36]。这些研究表明,抑制肿瘤生长的机制不同,包括抑制某些酶的蛋白质和浓度抑制血管生成。然而,很少有研究报道,msc可以促进肿瘤的生长37- - - - - -39]。李斯等人表明卵巢癌细胞的特性,即转移能力(粘附、迁移和入侵),增殖,可促进药物抗性,msc (37]。这种促进效应被认为是由于诱导细胞因子,包括血管内皮生长因子(VEGF)和碱性纤维母细胞生长因子(bFGF),引导部门和血管内皮细胞和间质细胞的形成在异常情况下,如伤口愈合或肿瘤发生[3]。事实上,肿瘤类型、模式、途径MSC移植,细胞的剂量和时间进程都倾向于影响实验结果(12]。我们的研究表明,AF-MSCs显著增加肿瘤的大小。然而,有趣的是,原位TUNEL分析表明AF-MSCs还显示诱导细胞凋亡。根据我们之前的MVD检测结果,AF-MSC组的肿瘤不享有更高标准内的血管生成,即使他们表现出最大的大小在所有组。因此,相对缺乏血液和营养供应可能发生和诱导凋亡细胞的比例增加实体肿瘤。不管怎么说,之后的AF-MSCs逆转肿瘤促进效应表达干扰素他们修改α证明,这些干细胞对肿瘤细胞生长抑制作用。

此外,考虑到潜在的肿瘤发生风险AF-MSCs和基因修饰干扰素α-AF-MSCs,我们进行进一步的实验来评估AF-MSCs可能形成肿瘤的可能性。1×107AF-MSCs和干扰素α-AF-MSCs裸小鼠皮下注射,而且没有明显的肿瘤发生的迹象被确定在注射部位在50天观察期;病理诊断进一步证实不存在肿瘤发生,在注入皮下组织或收集到的器官。因此,我们推断,即使AF-MSCs提升体内肿瘤的生长,它们不会导致肿瘤发生的地区非恶性的细胞。总的来说,我们认为干扰素α-AF-MSCs是安全的,有效地限制了宫颈癌细胞生长在短期内。

总之,我们的研究表明,干扰素α-AF-MSCs能够寻的肿瘤部位的海拉细胞异种移植模型和展览在抑制肿瘤治疗效果。我们还表明,尽管AF-MSCs仅可以选择性地嫁接到肿瘤部位,参与肿瘤建筑,他们是安全的和有效的在基因工程表达干扰素α,目标是治疗宫颈癌。我们的数据表明,肿瘤抑制干扰素的效果α-AF-MSCs是由于血管生成减少,以及诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖的肿瘤细胞由这些干扰素α-overexpressing干细胞。需要进一步调查以确定最佳的细胞剂量和管理路线,以及如何延长治疗效果的持续时间。此外,进一步引发的免疫抑制的长期风险AF-MSCs AF-MSCs时也应考虑接种免疫缺陷患者(18]。最终,在不同的肿瘤模型进一步研究利用其它治疗药物是必要的来验证AF-MSC-based-targeted疗法的疗效。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

大部分的实验进行兽医生物技术国家重点实验室,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本研究的资助支持中国国家重点基础研究和开发项目(2012 cb526700);国家科技支撑计划项目(2014 ba105b01);项目和科技头脑风暴科技办公室的哈尔滨(2017 ab9bs039)。

补充材料

图S1: AF-MSCs的识别。(a)为AF-MSCs识别特定的细胞表面标记流式细胞术。AF-MSCs 1号,3号,7号,15代是彩色CD90、CD105, CD73, HLA-ABC, CD34, CD14、CD45、HLA-DR被流式细胞术分析。AF-MSCs是CD90+CD105,+,CD73+,HLA-ABC+,CD34−,CD14−、CD45−,HLA-DR−。干扰素α-AF-MSCs符合MSC零的干细胞标记,证明了细胞的稳定性。代表的结果显示三个类似的实验之一。(b) AF-MSCs成骨分化。AF-MSCs都沾染了茜素红S在成骨的培养基培养后21天。成骨诱导显示了阳性染色(箭头所示),由于矿化发生分化。这张照片是一个代表图像的两个独立的实验。图S2:从接种AF-MSCs缺乏肿瘤形成。)染色组织的小鼠接受皮下注射1×107 AF-MSCs或干扰素α-AF-MSCs。样本来自四只老鼠注射后50天。图像显示代表字段注入的组织的网站,特别是肝、肾、脾和肺。酒吧:50μm。(补充材料)