细胞外囊泡从脂肪间充质干细胞/基质细胞加速人类角质细胞和成纤维细胞迁移和激活AKT通路mir - 205活动的独立

文摘

间充质干细胞/基质细胞在细胞疗法(msc)是有前途的工具。他们分泌细胞外囊泡(EVs)携带不同种类的分子,能促进肌肤修复,但机制知之甚少。皮肤伤口愈合是一个复杂的过程,需要几个信号通路和细胞类型的活动,包括角化细胞和成纤维细胞。在这项研究中,我们研究了脂肪组织MSC-derived电动汽车能否加速角质细胞和成纤维细胞的迁移和增殖,激活AKT通路,促进伤口愈合在活的有机体内。此外,我们评估如果电动汽车影响mir - 205相关的。我们发现,MSC EVs平均直径135纳米。角化细胞和成纤维细胞暴露于电动汽车表现出更高水平的增殖,迁移和AKT激活。局部EVs加速皮肤伤口闭合管理。击倒mir - 205减少一种蛋白激酶磷酸化在成纤维细胞和角质细胞,而只在角化细胞迁移是减少。此外,击倒mir - 205未能抑制一种蛋白激酶磷酸化在成纤维细胞和角质细胞暴露于电动汽车。EV影响的机制,我们发现孵化与EVs阻止AKT激活的抑制mir - 205击倒,这表明EVs AKT激活mir - 205的独立。总之,我们表明,伤口愈合的电动汽车是一种很有前途的工具。

1。介绍

间充质干细胞/基质细胞(msc)可以分离出许多成人组织(1]。人类脂肪组织被选为干细胞的来源在这项研究中,由于其便利和高间充质干细胞群。这些细胞的非凡的可塑性最初被认为有助于他们建立的治疗效果在各种各样的疾病模型,以及在人类临床试验。然而,最近的研究结果表明,msc对微环境的影响通过分泌多种生物活性因子。这种能力可能比他们更有助于组织修复能力分化转移(2]。

检查参与组成分泌腺MSC包含各种各样的生物分子,包括细胞因子、生长因子和rna。这些分子可以调节微环境,从而负责大部分的有益作用的干细胞在组织修复3]。最近的研究也表明,msc分泌细胞外囊泡(EVs),导致信息交流。内化后,电动汽车可以改变受体细胞的命运通过提供转录因子能够调节细胞属性(4,5]。

另一方面,许多分泌伤口修复是一个复杂的过程控制因素,包括可溶性蛋白质和rna (6]。许多临床前和临床研究表明,政府的msc加速伤口关闭,减少疤痕,促进胶原蛋白合成和血管生成(7,8]。然而,负责的机制和因素的改善伤口愈合过程干细胞疗法仍知之甚少。

几个生化途径协调皮肤完整性恢复(9]。mir - 205规定的途径参与细胞的迁移和增殖能力。缺乏mir - 205结果表皮缺陷引起的受损的增殖,而mir - 205的基因缺失导致新生儿死亡率在老鼠10]。这个微rna调节AKT激活,因此增加上皮细胞的迁移和促进伤口愈合11]。

在这项研究中,我们评估能力的脂肪MSC EVs增加细胞增殖,迁移和AKT激活人类角质细胞和成纤维细胞,促进伤口愈合在活的有机体内。此外,我们研究了电动汽车对AKT的迁移和活化的影响是否依赖mir - 205。在这里,我们表明,电动汽车及其分子有前途的工具,用于伤口愈合。

2。材料和方法

2.1。MSC隔离和文化

msc被lipoplasty自由与皮下脂肪组织捐赠手术患者根据批准的规定大学联邦•德•米纳斯吉拉斯的研究伦理委员会(348/2016)。细胞提取进行了描述祖克et al。12]。简单地说,组织样本洗两次磷酸盐(PBS, pH值7.4;热费希尔科学、沃尔瑟姆,美国马)移除血细胞和孵化0.1%胶原酶溶液(热费希尔科学)45分钟37°C。孵化后,样本离心机在300×7分钟,上层清液被丢弃,剩下的小球在杜尔贝科resuspended修改鹰的介质(DMEM;猫。号:12800 - 017,热费希尔科学)含10%胎牛血清(的边后卫;青霉素、链霉素热费希尔科学)和1% (PS;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。细胞转移到培养瓶,继续在湿润的气氛中95%的空气和5%的有限公司₂在37°C。培养基是改变每3天。

2.2。描述msc的血细胞计数

msc (10⁶细胞/样本)与0.4孵化μ克主CD73抗体(热费希尔科学、猫。数量:41 - 0200),CD90(热费希尔科学、猫。号码:14-0909-82)、CD105(热费希尔科学、猫。数量:12 - 105742)(传统膜干细胞标记),CD19(热费希尔科学、猫。数量:11-0199-42)和CD45(热费希尔科学、猫。号码:11-9459-42)(造血细胞标记)在4°C(30分钟13]。洗后,细胞被孵化二级抗体在4°C为30分钟,再次清洗,悬浮在PBS。Alexa萤石488山羊anti-mouse(热费希尔科学)主要用于非结合的抗体。在控制实验中,细胞被孵化只有二级抗体排除非特异性结合。血细胞计数进行了使用一个番石榴®EasyCyte™6 - 2 L(美国微孔,泰梅库拉,CA)。对于每一个样品,至少5000事件。结果分析与FlowJo 7.6.5软件(LLC),亚什兰,或者,美国)。

2.3。分化的软骨细胞、脂肪细胞和骨细胞

msc在特定分化孵化21天媒体,如前所述[12]。孵化后,细胞被冯Kossa固定和染色,油红O,和阿尔新蓝染色可视化成骨、脂肪形成的,分别和chondrogenic分化。尽管其他策略可以用来验证成骨和chondrogenic分化,冯Kossa和阿尔新蓝染色仍被视为的好方法。接下来,使用QIClick细胞成像相机(公元前打印大师,萨里,加拿大)耦合到一个IX70奥林巴斯显微镜由Image-Pro + 7.0.1(媒体控制论,罗克维尔市,医学博士,美国)。

2.4。EV隔离

电动汽车是孤立如前所述14]。简单地说,干细胞与血清DMEM培养48 h在37°C,在大气中95%的空气和5%的有限公司₂。这个步骤是必要的,以确保从干细胞中收集到的只有电动车,血清DMEM不包含电动汽车。潜伏期后,介质进行了连续离心步骤。第一次离心300 g×7分钟;然后,上层清液离心机15分钟在1000×g,紧随其后的是另一个上层清液离心40分钟10000×g。然后,上层清液离心器(100000 g×70分钟)。最后,上层清液进行了最后的超速离心法g(100000×70分钟),以及由此产生的颗粒组成的电动汽车。所有离心步骤进行了在4°C。电池用于电动汽车提取在第四或第五段。对于每一个完整的实验,EVs从三个不同的患者干细胞分离和使用,总计45个样本48个不同的病人在这个研究。

2.5。电动汽车特性和浓度

EVs分离血清DMEM如上所述resuspended在PBS和分析使用10 NanoSight LM系统和纳米粒子跟踪分析软件(英国莫尔文莫尔文仪器有限公司)。我们使用1.9×10⁸囊泡在每个实验。

2.6。隔离和文化人类角质细胞和成纤维细胞

人类角质细胞提取所描述的Zonari et al。8]。人类皮肤样本捐赠同意从腹壁整形术手术的患者按照规定大学指定的联邦德·米纳斯吉拉斯研究伦理委员会(55698116.2.0000.5149)。皮肤与剪刀分离脂肪皮下组织,脂肪组织是丢弃。然后,皮肤样本分散成5毫米²件和孵化dispase解决方案(2.5 UI) 16 h在4°C。在这之后,真皮和表皮分离镊子(真皮成纤维细胞提取和keratinocytes-from表皮)。真皮是孵化在0.1%胶原酶溶液(热费希尔科学)3 h 37°C,和表皮碎片孵化与0.05%胰蛋白酶溶液5分钟37°C。潜伏期后,细胞刮板被用来去除表皮角化细胞释放的碎片。由此产生的材料会通过一个100μm过滤器只收集的细胞无血清培养系统被放置在与角化细胞培养瓶(KSFM)和培养在37°C在大气中95%的空气和5%的有限公司₂。3 h孵化后胶原酶解,真皮碎片,仍未消化的丢弃,上层清液进行离心g在300×7分钟。由此产生的颗粒在DMEM resuspended含有10%的边后卫和1% PS和转移到培养瓶。细胞被保存在一个湿润的气氛95%的空气和5%的有限公司₂在37°C,媒介改变了每三天。

2.7。增长曲线

角化细胞和成纤维细胞的生长曲线进行播种24-well板块(5×10⁴每口井的细胞)和暴露在有或没有MSC EVs媒介。囊泡的浓度为3.16×10使用⁷每毫升,每被暴露在一毫升的增菌培养基。细胞数在纽鲍尔室每日连续八天。细胞计数是用来绘制生长曲线。

2.8。免疫印迹

对于电动汽车的实验,细胞暴露于富集培养基和囊泡的浓度分别为3.16×10⁷每毫升。最初,总蛋白质样本分离细胞暴露于电动汽车使用无菌细胞刮刀和裂解缓冲(150毫米生理盐水1毫米EDTA 20 mM Tris-HCl, pH值8.0,0.5%诺乃清洁剂p 40)。总蛋白浓度由布拉德福德量化方法(布拉德福德,1973),然后,样品进行电泳。蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯膜使用Trans-Blot®SD半干的传递细胞(BioRad、大力神、钙、美国)。免疫印迹是由标准的方法,如前所述[15]。主要抗体总AKT(细胞信号技术,丹弗斯、马、美国;猫。数量9272,1:1000),phospho-AKT(细胞信号技术;猫。4060号,1:500),phospho-histone 3 (Sigma-Aldrich;猫。MFCD01633984数量,1:500),全组蛋白H3 (Sigma-Aldrich;猫MFCD01322157数量,1:2000),阿历克斯(细胞信号技术,猫。号:2171),CD9(猫。 number: MA1 80-307) were used. Band density analysis was performed using ImageJ software (https://imagej.nih.gov/ij/)。

2.9。抓伤口愈合试验

人类角质细胞和真皮成纤维细胞被播种在6-well板块融合80%。后接触KSFM或DMEM(根据细胞类型)48 h,擦伤了细胞单层无菌200μL吸管小费。井与PBS洗然后暴露于MSC电动汽车。囊泡是3.16×10的浓度⁷每毫升每个。闭包是由成像监测(0,12和24小时。划痕区域被Image-Pro +测量软件。

2.10。切除Wound-Splinting模型

所有动物实验后获得一个大学研究伦理委员会的批准(168/2013)。切除wound-splinting模型被用来描述由王先生和他的同事(16]。这个模型可以促进之间的近似老鼠和人类皮肤伤口愈合,减少皮肤牵引。短暂,24岁的雄性Wistar鼠(220克)被分成两组:测试组和阴性对照组。动物组织进一步分为三个子组四个动物,评估在7、14、21天之后接触凝胶制剂。老鼠麻醉使用腹腔内注射氯胺酮和甲苯噻嗪。切除伤口(直径5毫米)在大鼠背侧皮肤迷你穿孔。无菌硅胶环与高性能胶水粘在伤口。动物被放置在单独的笼子里,阿斯匹林来止痛。在整个实验过程中,他们有免费的食物和水。

2.11。凝胶与电动汽车

羟乙基纤维素水凝胶(2%)是在无菌条件下,混在电动汽车悬架(1.9×10⁸囊泡)1:1的比例。结果1%羟乙基纤维素凝胶组成MSC-derived EVs无菌应用日常测试组伤口的动物,而动物与平原对照组治疗1%羟乙基纤维素凝胶没有电动汽车。伤口参数评估在7、14和21天之后伤口。图片每一天。

2.12。实时聚合酶链反应

人类角质细胞和真皮成纤维细胞被播种在6-well板块(5×10⁵细胞每)。RNA提取与mirVana®RNA提取工具包(热费希尔科学)和用于逆转录酶反应。我们使用TaqMan探针工具包(热费希尔科学、猫。号4427975);大量的RNA和cDNA制造商推荐的。快速反应是阅读使用7900 ht与SDS 2.4软件实时PCR系统和分析(热费希尔科学)。2相对基因表达进行了计算^−(ΔΔCt)方法(17]。

2.13。转染的核

转染是按照制造商的建议进行的。人类皮肤成纤维细胞和角质细胞被播种在60 - 70%汇合,然后接触悬挂Lipofectamine 2000(热费希尔科学)和25 nM siRNA Opti-MEM(热费希尔科学)5 h。siRNAs使用都购自热费希尔科学:mirVana microrna的抑制剂,hsa - mir - 205 - 5 - p(化验ID: MH11015;产品目录号:4464084);mirVana microrna的模仿,hsa - mir - 205 - 5 - p(化验ID: MC11015,产品目录号:4464066);和mirVana microrna的抑制剂-控制编号1(产品目录号:4464076)。孵化后,转染中被抛弃,取而代之的是DMEM或KSFM根据细胞类型。测试执行后48 h。

2.14。统计分析

显示的数据代表至少有三个独立的实验,用平均值±标准偏差表示。GraphPad的统计分析软件。实验与两个以上的数据组比较采用单向方差分析和Bonferroni期末测验。至少值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果与讨论

3.1。对msc

最初,msc是根据三个标准提出的间充质干细胞和组织委员会国际社会的细胞治疗(18]。首先,细胞表面抗原的概要文件是确定通过与特定单克隆抗体染色的细胞,血细胞计数分析(图紧随其后1)。我们研究了细胞标记的表达水平CD90 (91.4%±0.1%), CD73 (92.9%±0.1%), CD105 (92%±0.1%), CD19(4.9%±0.1%),和CD45 (1.3%±0.1%)。这些标记细胞的百分比表示可接受的文化纯洁根据Bourin等提出的标准。18]。msc粘塑性材料的盘子和显示呈形态(polygon-like或spindle-like过程图1 (b))。最后,msc能够分化为脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞(图1 (b))。经过21天的暴露在分化中紧随其后的是油红O·冯·Kossa或阿尔新蓝染色,可以观察干细胞分化成不同类型的细胞,细胞质显示脂肪滴,矿藏,分别和蛋白聚糖包裹体。这些结果表明,细胞群与皮下脂肪组织在这项研究确实由真正的msc、分类的标准组织干细胞委员会国际社会的细胞治疗(18]。

3.2。EVs分离msc的表征

接下来,EVs NanoSight LM 10系统进行了分析,利用纳米粒子跟踪分析(NTA)软件。这些实验结果如表所示1并在图2。囊泡的平均直径在我们的准备是135海里。我们还确定他们的密度,传播速度和样品粘度。如图2,曲线的基础是广泛的,这表明在人口规模的变化。积累数据支持的概念内容、大小、和膜组成的电动汽车是高度异构和动态,根据细胞来源,状态和环境条件(19,20.]。同时,我们进行免疫印迹CD9和阿历克斯,两种蛋白质出现在电动汽车。许多工作已经由科学界隔离EV亚型,但结果是不确定的。因此,在这项工作中,我们假定我们处理不同的电动汽车数量的混合物(19]。

3.3。EVs增加成纤维细胞和角质细胞的增殖

评估MSC EVs能否诱导成纤维细胞和角质细胞的增殖在体外,这两种类型的细胞暴露于MSC EVs和两种实验。如图3(一个)成纤维细胞与角质形成细胞直接接触的,生长曲线表明,MSC EVs增加细胞增殖,这将是一个有益的因素对伤口愈合9,21]。免疫印迹分析显示更大的组蛋白H3磷酸化,有丝分裂标记(22),这两种类型的细胞暴露在MSC EVs(数字3 (b)和3 (c))。这些结果表明,EVs修改上皮细胞增殖。此前,据报道,EVs干细胞诱导细胞增殖的调节微环境,促进有丝分裂(23,24]。细胞增殖是皮肤伤口愈合的关键一步,及其损伤与慢性伤口的形成直接相关,干细胞EVs加速这个过程的能力可能是一个有用的治疗功能。

3.4。EVs诱导成纤维细胞和角质细胞的迁移

表皮角化细胞和真皮成纤维细胞用于伤口愈合化验,在材料和方法描述。如图4培养基,电动汽车的出现是与更快速的减少在该地区受到最初的伤口,表明增加迁移后24小时的暴露在MSC EVs两种类型的细胞。细胞迁移在伤口床对皮肤伤口愈合至关重要,它是影响在一些慢性疾病,例如,在糖尿病慢性伤口(25]。有人建议,皮肤细胞迁移的障碍的原因之一在慢性伤口的损耗是干细胞在那些领域,产生了不平衡的微环境和减慢伤口愈合过程。这将是有趣的在更直接的实验证实MSC EVs和信号是否确实可以调节细胞迁移,建议由我们的结果(图4)和其他组的数据23,24]。

3.5。电动汽车加速伤口愈合

雄性Wistar鼠受到切除wound-splinting程序然后暴露于水羟乙基纤维素凝胶有或没有MSC EVs 7、14、21天。我们发现,对待动物的伤口迅速关闭超过控制伤口(图5(a))。此外,我们观察到的老鼠接受凝胶富含MSC EVs,伤口关闭发生速度比动物对待EV-free凝胶(图5(b))。加速伤口愈合的EVs干细胞已经被报道。然而,在这些实验中,更多侵入性治疗,也就是说,皮内注射干细胞电动车准备使用(26]。在这项工作中,我们展示了类似加速伤口愈合的局部应用MSC的电动汽车,这是一个更有利的环境,导致更少的治疗不适。我们的结果似乎是按照建议的其他作者有潜力的MSC EVs皮肤伤口愈合(26,27]。

3.6。电动汽车推广一种蛋白激酶磷酸化在成纤维细胞和角质细胞

AKT通路被认为是主要的生化途径调节上皮细胞的迁移。评估是否MSC EVs诱导AKT激活,免疫印迹分析进行成纤维细胞和角质细胞。如图6接触角化细胞和成纤维细胞,MSC EVs与更高水平的磷酸化AKT,这会增加AKT通路的整体活动。有时候,有一些双乐队为总AKT在西方墨迹。最重的乐队是用于量化乐队总是出现在磷酸化形式。最近,其他作者发现一种蛋白激酶磷酸化在皮肤细胞暴露于更高的MSC EVs [10,11]。这些结果很有意思,从治疗的角度来看,作为一种蛋白激酶的调节途径活性可能是一个前途的伤口愈合过程的小说研究刺激器。

3.7。成纤维细胞与角质形成细胞直接接触的接触EVs增加mir - 205的表达

它已经表明,皮肤最丰富的小分子核糖核酸之一,mir - 205,是一个重要的调制器AKT通路活动(11]。此外,我们发现存在mir - 205 EV msc、样本通过下一代测序实验(数据未显示)。评估是否MSC EVs调制mir - 205表达,qPCR实验后,成纤维细胞和角质细胞暴露于EVs 24 h。我们发现用MSC治疗EVs导致mir - 205 ~三倍增加(图表达水平7(一))。尽管mir - 205是目前在电动汽车从干细胞,我们不能假定此时增加表达式是严格qPCR实验所观察到由于电动车转让与这里描述的实验细胞。广为人知,microRNA生物学很复杂,可以调制的几个因素,包括其他小分子核糖核酸(10,11]。

接下来,我们进行了qPCR实验来验证预期的变化在细胞过度或击倒后mir - 205年的水平。转染的25 nM mir - 205微rna序列的表达水平增加~翻成纤维细胞和角质细胞(mir - 205模拟)。我们也检查了mir - 205的后果可拆卸的细胞中核集团)之前和之后的接触EVs核+电动汽车)。我们达到100%击倒两组细胞转染核。表达水平的mir - 205细胞只接触转染试剂lipofectamine (lipofectamine组)或lipofectamine加上争夺序列(集团)的争夺并未改变,如预期(图7 (b))。

我们还研究了mir - 205超表达的影响和击倒AKT激活通过执行免疫印迹分析磷酸化和总AKT(图的水平7 (c))。人类成纤维细胞和角质细胞,mir - 205超表达并没有引起显著的一种蛋白激酶磷酸化水平相比在细胞治疗中发现lipofectamine或RNA的争夺。这个结果与报道的数据于et al。11)表明,mir - 205可以在角化细胞诱导AKT激活。这可能归因于mir - 205的浓度。我们决定不增加核的浓度,因为我们已经有了一个3年来改变细胞转染和mir - 205模拟序列,在大约两倍的mir - 205细胞暴露在电动汽车中找到。然而,mir - 205降价导致低水平的磷酸化AKT在两种类型的细胞,如前所展示。

属性类似成纤维细胞和角质细胞暴露于MSC EVs mir - 205沉默的时候。他们比细胞表现出更高水平的一种蛋白激酶磷酸化处理lipofectamine。这些结果表明,AKT激活在暴露于MSC EVs mir - 205表达的可能是独立的。考虑电动汽车货运的复杂性,众所周知,其他分子囊泡可以集体工作中,调节微环境,有利于皮肤细胞的迁移。我们正在分析其他rna给电动车进一步研究其他潜在目标对伤口愈合的过程。此外,一些生长因子可能在电动汽车。也许许多分子可能参与本文中所描述的效果。

最后,我们调查的迁移影响mir - 205超表达和击倒在成纤维细胞和角质细胞(图8)。成纤维细胞的迁移是不受mir - 205超表达或降价,但降价细胞暴露于EVs显示更快地迁移。这个结果表明成纤维细胞的迁移是独立于mir - 205,电动汽车可以有其他分子负责增加纤维母细胞迁移。另一方面,角化细胞迁移是增加了mir - 205超表达。因此,mir - 205的可拆卸的角化细胞的迁移与对照组的水平相似,但击倒细胞暴露于电动汽车增加迁移。总的来说,这些结果表明,mir - 205角化细胞迁移很重要,但是,对于迁移效应引起的电动汽车,它的表达似乎并不重要。

许多研究显示一个复杂mir - 205的作用在许多模型(28]。例如,在HaCaT角质细胞,mir - 205降价可能促进迁移伤口愈合试验。这可能是由于使用的不同细胞或因为mir - 205的复杂网络29日]。在癌症中,它作为癌基因通过促进肿瘤增殖和起始或肿瘤抑制通过抑制入侵和扩散28]。

考虑电动汽车货运的复杂性,众所周知,等分子存在一些生长因子和mrna。也许许多分子可能参与本文中所描述的效果。是很重要的,充分说明的内容EVs mrna,小分子核糖核酸,蛋白质,和其他类的分子进一步解释观察到的影响在这工作。

4所示。结论

总之,我们的数据表明,细胞迁移和增殖,皮肤伤口愈合的关键流程,可以通过接触MSC-derived加强电动汽车,激活AKT通路mir - 205独立的方式。局部管理包含MSC EVs加速伤口愈合凝胶在动物模型中,这是一个有趣的发现,因为它打开的模型研究视角。为该方法的进一步发展,这将是有趣的,以确定电动汽车货物和调解有利影响的分子机制MSC-derived EVs观察在这个研究。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由美国国立卫生研究院拨款支持1 r03tw008709赠款从“INCT-Regenera”,“解开Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular (REMETTEC,红色- 00570 - 16),“FAPEMIG,斗篷,CNPq。作者还要感谢“Pro-Reitoria德尽管达大学联邦德·米纳斯吉拉斯”的金融赞助。作者要感谢Editage (http://www.editage.com)英语编辑和卡罗莱纳德安德拉德的免疫印迹援助。

补充材料

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