文摘

背景。间充质基质细胞(MSC)呈多功能细胞组织修复能力的属性。鉴于紧密连接的重要性(TJ)在上皮的完整性,我们假设MSC调节TJ的形成,通过活化激酶(AMPK)的途径。肝脏激酶,β1 (LKB1)和Ca^{2 +}-calmodulin-dependent蛋白激酶激酶(CaMKK)代表的主要激酶激活AMPK。方法。体外Ca^{2 +}开关从5μM 1.8毫米都使用上皮Madin-Darby狗肾细胞(MDCK)培养独自或与大鼠骨骨髓来源cocultured MSC或preexposed MSC-conditioned媒介。TJ装配测量通过评估ZO-1搬迁和信息联系。实验用MDCK稳定表达short-hairpin-RNA(成分)对LKB1或荧光素酶(LUC,控制)。复合sto - 609 (50μ米)是用作CaMKK抑制剂。结果。Ca后^{2 +}开关,ZO-1搬迁和磷酸化/激活AMPK明显高于MDCK / MSC MDCK相比。没有区别AMPK磷酸化LKB1-shRNA至Luc-shRNA MDCK Ca^{2 +}开关。相反,孵化和sto - 609 Ca之前^{2 +}开关防止AMPK磷酸化和ZO-1搬迁。MSC-conditioned中等略但显著增加AMPK活化和加速TJ-associated ZO-1 post Ca的分布^{2 +}开关相比,常规的媒介。结论。MSC调节上皮TJ的大会,通过独立于LKB1 CaMKK / AMPK途径。

1。介绍

上皮紧密连接(TJ)上形成一个密封的外质膜在细胞分化和获得极性1]。TJ调节离子和小分子的通道通过paracellular通路(2还]和限制的扩散基底膜蛋白在顶端和隔间。TJ的至少40个不同的蛋白质,包括跨膜蛋白,如claudins occludins,和适配器蛋白质,如成员MAGUK(膜相关鸟苷激酶)的家庭,ZO-1, ZO-2, ZO-3 [3,4]。TJ组装的时候,ZO-1 ZO-2组织TJ组件中都有重要的角色和定位他们适当的位置(5]。许多因素已经被确认为调节器TJ装配/拆卸,包括细胞外钙^{2 +}(6]。细胞外钙^{2 +}对新连接的发展至关重要7)和稳定成熟的连接(8,9)在上皮细胞(10]。TJ组装在Ca的依赖^{2 +}可能是归因于稳定的细胞粘附分子钙粘蛋白的粘附状态。众多通路TJ的规定,涉及包括活化蛋白激酶(1,11- - - - - -16]。

AMPK是一个无处不在的heterotrimeric复杂的1催化α子单元和2监管β- - -γ子单元(17]。AMPK活性是由细胞内AMP-to-ATP调制比,以及上游AMPK激酶的活性,如肝脏激酶-β1 (LKB1)和Ca^{2 +}-calmodulin-dependent蛋白激酶激酶(CaMKK) [18- - - - - -20.]。AMP / ATP的比率增加诱发AMP绑定的γ亚基,从而促进AMPK在苏氨酸残基磷酸化(刺- 172)及其激活(21]。此外,能源压力,LKB1磷酸化,激活AMPK通过一个复杂的形成与pseudokinase副和支架蛋白MO25 [22]。CaMKK AMP-independent地激活AMPK在胞质钙离子浓度增加(23,24]。请注意,AMPK auto-phosphorylationβ亚基刺- 148据报道(25]。激活AMPK促进ATP生产有利于分解代谢和关闭合成代谢途径。有趣的是,药物的AMPK激活爱卡诱发TJ大会,独立于细胞外的Ca^{2 +}或能量不足(11,18]。这种效应可能是通过加强反式相互作用介导的细胞粘附分子参与nectin-I-afadin系统[12,26)和/或通过调节细胞骨架动力学在细胞膜附近(12]。此外,preactivation AMPK二甲双胍或爱卡有助于保持上皮细胞的功能完整性的缺血和能源损耗,证明在体外和体内27- - - - - -29日]。TJ中断确实认为是最早的标志之一上皮损伤,导致细胞极性和组织无序的损失。

累积证据上皮损伤领域的支持,骨髓基质细胞(MSC)是组织修复能力的属性(30.]。MSC代表一个异构的成年人口呈多功能细胞(31日]。除了他们的有益的免疫调节和抗炎能力(32],MSC可以帮助上皮细胞生存,增殖,分化后损伤(30.,33- - - - - -35]。因此,体外观察最近强调了气道上皮的MSC在伤口愈合中的作用,通过信息之间的直接接触和旁分泌激活表皮生长因子受体(36- - - - - -38]。同时,MSC被释放膜囊泡(MVs)各种大小和构成到细胞外环境中(39]。MSC-derived MVs有助于转移胞质组件,包括蛋白质、脂质、RNA,细胞器,MSC邻近细胞,加速组织修复(40,41]。

在目前的研究中,我们首先研究了AMPK激酶负责AMPK磷酸化,激活的Ca^{2 +}开关。接下来,我们质疑MSC对上皮的影响TJ coculture Ca系统监管^{2 +}全身TJ组装MDCK细胞。最后,我们研究了MSC-conditioned介质影响上皮TJ组装。本文提出了在MiSOT 2016 - 6 msc治疗专家会议免疫调制。

2。材料和方法

2.1。MDCK培养条件

MDCK细胞融合在增长αmem补充10%的边后卫,1%谷酰胺(Lonza),和1%青霉素(Lonza),在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司₂在37°C。MDCK成分为LKB1和荧光素酶(卢克,用作控制)生成使用pSUPER / retro-puro向量,如前所报道(24]。稳定的人口保持使用嘌呤霉素(2μg / mL;σ)为选择的代理。

2.2。隔离和表征骨骨髓来源MSC

骨髓细胞从股骨和胫骨的男性9-week-old刷新刘易斯Lonza老鼠使用磷酸盐(PBS)。均质化后,细胞悬液过滤和离心10分钟的1200 rpm。细胞被resuspended在αmem培养基(Lonza)和聚蔗糖轻轻筛分(医疗生命科学)。额外的1500转离心45分钟后在室温下(RT)、单核细胞从梯度界面和悬浮在删除αmem解决方案之前最后的1200转离心10分钟。细胞被镀在75厘米²培养瓶中αmem补充10%的边后卫,青霉素谷酰胺1%,和1%。MSC被维持在37°C湿润有限公司5%₂孵化器。补充αmem是改变了每周两次。在80%的融合细胞trypsinised最大8通道。在融合,新鲜培养基倒,收集在第三天,离心机在1.800转5分钟,储存在−80°C为进一步使用。MSC表型测试按照标准的国际社会的细胞疗法:(i)塑料的依从性,(2)(非)表达的常规表面标记使用流式细胞术;和(iii)分化成脂肪形成的,成骨,chondrogenic血统(42]。流式细胞术进行一个FACSCalibur流式细胞分析仪(BD生物科学),使用Alexa Fluor-conjugated anti-rat CD29抗体(BD Pharmingen) APC-conjugated anti-rat CD90抗体(BD Pharmingen) V450-conjugated anti-rat CD45抗体(BD地平线),FITC-conjugated anti-rat CD11b (BD Pharmingen)和PE-conjugated anti-CD79a抗体(Abcam)。

2.3。MSC / MDCK Coculture系统

细胞群在6-well板块涨跌互现,播种密度1.5×10⁵细胞/。MSC的播种比率:MDCK 1: 3。所有的实验都进行融合。另外,MDCK细胞孵育2毫升αmem培养基preexposed MSC为3天。

2.4。Ca^{2 +}开关的实验

稳定状态后,细胞被冲洗和孵化在Ca^{2 +}无S-MEM补充5%的透析的边后卫([Ca^{2 +}),5μ米)16 h在切换之前恢复正常介质(αmem;(Ca^{2 +}),1.8毫米)表示。化合物sto - 609 (50μM;σ)和dorsomorphin /复合C (50μM;σ)被用作CaMKK AMPK抑制剂,分别。浓度增加dorsomorphin /复合C测试为了充分块AMPK活化(补充图,面板,网上https://doi.org/10.1155/2017/9717353)。另外,MDCK细胞暴露于MSC-conditioned介质24 h,之前接触S-MEM 16 h。Ca^{2 +}开关使用MSC-conditioned被意识到αmem的表示。

2.5。免疫印迹分析

细胞细胞溶解在冰里帕裂解缓冲包括蛋白酶和磷酸酶抑制剂(罗氏)。细胞溶解产物离心获得的13.000 rpm在4°C为30分钟。上层清液收集。蛋白质浓度测定用布拉德福德的方法。蛋白溶解产物与Laemmli混合缓冲(1:4)和加热2分钟在95°C。等量的蛋白质(30μg / lane)装上没有污点SDS电泳凝胶,在100 V (Bio-Rad)分离。凝胶被暴露于紫外线5分钟(ChemiDoc议员制度,Bio-Rad)。蛋白质被转移到PVDF膜(之前激活乙醇)使用Trans-Blot涡轮增压传输系统7分钟rt,屁股被封锁与Tris-buffered牛奶5%盐水渐变20 (TBS-T) 1 h和孵化一夜之间在4°C主要抗体:pAMPK (T172)(细胞信号),AMPK(细胞信号),和扣带皮层部位(细胞信号)抗体。墨迹是冲洗5次与TBS-T 5分钟和孵化HRP-conjugated anti-rabbit二级抗体(1/4000)为90分钟rt,冲洗后,化学发光信号被捕获ChemiDoc议员系统在应用化学发光底物(毫微微Thermoscientific)的屁股。图像数据进行了分析和量化(每个实验条件)使用图像实验室4.1软件。代表样本然后运行在同一个没有污点SDS凝胶为了出版,同意ASBMB政策。

2.6。免疫荧光和量化ZO-1存款

细胞生长在盖玻片和PBS和固定在寒冷的甲醇冲洗两次12分钟。与PBS / BSA 5%稀释封锁后60分钟RT和孵化与anti-ZO-1 90分钟(ThermoFisher科学),其次是60分钟的孵化和Alexa萤石488 -共轭anti-rabbit免疫球蛋白(分子探针),细胞可视化在fsx - 100(奥林巴斯生命科学)。对比度、亮度和焦点设置选择所有像素的线性范围。量化的平均ZO-1每单元长度,4个字段是随机挑选的,每个字段和ZO-1的总长度是概述了手动在Photoshop,紧随其后的是测量使用图像J软件(NIH) (11- - - - - -13]。细胞的人数统计每个字段与DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech)滑动安装。

2.7。统计分析

数据表示为平均值±1标准偏差(SD)。单向方差分析、Mann-Whitney和学生t以及被适当的执行,意义重大值设置为0.05 (MedCalc软件)。

3所示。结果

3.1。的磷酸化和激活AMPK Ca^{2 +}开关取决于CaMKK MDCK细胞,LKB1的独立

Ca后^{2 +}开关,我们观察到相比平均提高1.75倍pAMPK S-MEM介质(,)总AMPK保持不变,而之前报道(11)(图1(一)和1 (b))。平均水平的扣带皮层部位,一个典型的衬底AMPK,遵循类似的模式,Ca后增加了5.3倍^{2 +}开关(,)。LKB1和CaMKK视为两个主要AMPK激酶(23]。在LKB1-shRNA MDCK细胞,意思是pAMPK水平和扣带皮层部位的1.4倍和4.7倍的增加,分别相比S-MEM (,),与控制Luc-shRNA(无显著差异不显著(ns))(数据1(一)和1 (b))。重要的注意,Luc-shRNA MDCK细胞的行为同样关于AMPK MDCK细胞磷酸化/激活和ZO-1搬迁后Ca^{2 +}开关(数据未显示)。相反,药物抑制CaMKK使用sto - 609 Ca后阻止了AMPK磷酸化和激活^{2 +}开关,意味着pAMPK水平和扣带皮层部位类似S-MEM条件(ns)。孵化的MDCK AMPK抑制剂,dorsomorphin /复合C (50μ米)阻止AMPK自身磷酸化经典引起Ca^{2 +}开关(图1(一)和1 (b))。这些观察表明,在Ca CaMKK起着作用^{2 +}全身的AMPK激活MDCK细胞,LKB1的独立。

(一)

(b)

(c)

(d)

(一)
(b)
(c)
(d)

图1

AMPK激酶的作用,LKB1 CaMKK, AMPK活化和ZO-1搬迁后Ca^{2 +}开关在MDCK细胞。代表免疫印迹(a)和量化的(b) phospho-acetyl-Coa羧化酶(扣带皮层部位),phospho-AMP-activated蛋白激酶(pAMPK)和总AMPK Ca (AMPKt)低^{2 +}条件(S-MEM)和Ca^{2 +}开关用MDCK细胞或LKB1-shRNA MDCK细胞。化合物sto - 609和C被用作CaMKK AMPK抑制剂,分别。没有污点方法量化免疫反应性的信号进行归一化后的总蛋白质含量每车道。量化的phospho-ACC、phospho-AMPK AMPKt Ca后的信号^{2 +}计算和表达的比转向SMEM条件的免疫反应性的信号在每个实验中(a)。为了直方图清晰(b), SMEM值的实验规范化1为了代表平均比率phospho-ACC /总蛋白质含量和phospho-AMPK AMPKt在不同的实验条件(b)。数据提出了平均数±标准差;ns:不重要, , 。代表免疫荧光(c)和量化(d) ZO-1存款增加Ca后时间点^{2 +}开关在类似的条件(a)和(b)(比例尺:16μ米)。没有统计上的显著差异和MDCK之间观察到LKB1-shRNA MDCK (ns:不重要)。MDCK暴露于复合C ()或sto - 609 (^§ )显示显著减少控制MDCK ZO-1搬迁相比。数据是平均数±标准差。

3.2。AMPK药理禁忌或CaMKK防止Ca^{2 +}全身TJ ZO-1搬迁

在Ca^{2 +}开关,TJ-associated蛋白质的易位ZO-1从细胞胞质信息结点代表一个关键和TJ的早期步骤组装(5]。因此,我们监控ZO-1膜后存款Ca的长度^{2 +}开关在MDCK细胞暴露于不同的实验条件(11- - - - - -13]。在正常情况下,readdition Ca^{2 +}造成4倍增加ZO-1 S-MEM相比条件(数据长度1 (c)和1 (d))。2 h后的Ca^{2 +}开关,TJ主要是组装作为古典网状网络。在LKB1-shRNA MDCK细胞,ZO-1搬迁后一个模式类似于控制MDCK (,不重要)。相比之下,药物抑制CaMKK(使用sto - 609) (,)或AMPK (dorsomorphin /复合C) (,)防止ZO-1搬迁引起的Ca^{2 +}开关(图1 (c)和1 (d))。这些观察表明,AMPK和CaMKK激酶活性参与Ca^{2 +}全身ZO-1存款MDCK细胞,LKB1的独立。

3.3。的磷酸化和激活AMPK在MDCK细胞增强MSC的存在,这与更快的ZO-1搬迁相关信息联系

TJ大会由nonepithelial细胞在上皮细胞可能调制(43,44]。作为一个例子,淋巴细胞已被证明提高Ca^{2 +}全身的激活AMPK和加速TJ形成(43]。同样,我们假定MSC可能参与TJ的形成,我们调查了AMPK是否卷入这样一个过程。独自MDCK相比,磷酸化,激活AMPK在MDCK / MSC coculture显著增加,意味着pAMPK / AMPK水平提出来的比率(,)和扣带皮层部位(,)(数据2(一个)和2 (b))。重要的注意,AMPK活化和扣带皮层部位的免疫反应性的信号探测不到仅在MSC,这只表明MDCK AMPK活化通路测试在我们的模型中(45(补充图,面板B)。这些观察,我们的时间进程监控ZO-1 Ca后搬迁到信息的联系人^{2 +}开关在MSC(人物的存在与否2 (c)和2 (d))。16小时后剥夺Ca^{2 +}的长度,TJ-associated ZO-1每个在MDCK细胞高出3 x / MSC coculture相比单独MDCK细胞(,)(数据2 (c)和2 (d))。后1 h Ca^{2 +}开关,ZO-1搬迁和信息联系高出两倍比仅在MDCK MDCK / MSC (,)。不过,在2个小时后^{2 +}开关,膜相关的长度ZO-1每两组细胞相似(ns)数据2 (c)和2 (d))。值得注意的是,免疫荧光信号ZO-1无法仅在MSC培养,这表明ZO-1量化只反映了MDCK细胞ZO-1存款在我们的模型中(补充图,面板C)。作为一个整体,这些结果表明,MSC可能加速ZO-1沉积信息接触的时候TJ组装MDCK细胞。

(一)

(b)

(c)

(d)

(一)
(b)
(c)
(d)

图2

间充质基质细胞的影响(MSC)的AMPK激活和ZO-1搬迁后Ca^{2 +}开关在MDCK细胞。代表免疫印迹(a)和量化的(b) phospho-acetyl-Coa羧化酶(扣带皮层部位),phospho-AMP-activated蛋白激酶(pAMPK)和总AMPK Ca (AMPKt)低^{2 +}条件(S-MEM)和Ca^{2 +}开关用MDCK细胞或LKB1-shRNA MDCK细胞,有与没有MSC。化合物sto - 609和C被用作CaMKK AMPK抑制剂,分别。没有污点方法量化免疫反应性的信号进行归一化后的总蛋白质含量每车道。数据提出了平均数±标准差;ns:不重要,,。代表免疫荧光(c)和量化(d) ZO-1存款增加Ca后时间点^{2 +}开关在类似的条件(a)和(b)(比例尺:16μ米)。MSC / MDCK(即。MDCK (^§ )或MDCK LKB1-shRNA ()cocultures显示显著增加ZO-1在小时后Ca的存款^{2 +}开关相比MDCK孤单。在2个小时后^{2 +}开关,ZO-1长度差异不显著(ns)是观察MDCK和MSC / MDCKs之间。数据是平均数±标准差。

3.4。MSC-Associated AMPK活化和ZO-1搬迁后MDCK细胞Ca^{2 +}开关由AMPK和CaMKK抑制剂预防LKB1的独立

使用LKB1-shRNA和Luc-shRNA MDCK细胞cocultured MSC,我们评估了角色MSC-enhanced LKB1的AMPK激活和ZO-1搬迁。在LKB1-shRNA MDCK细胞,意味着pAMPK / AMPK水平比(,)和扣带皮层部位(,)分别增加1.5倍和2倍的存在与缺乏MSC,类似程度Luc-shRNA MDCK细胞(数字2(一个)和2 (b))。此外,16个小时后剥夺Ca^{2 +},ZO-1剩余的长度在TJ网站每个细胞高出4 x在MSC cocultured LKB1-shRNA MDCK相比单独MDCK (,)(数据2 (c)和2 (d))。后1 h Ca^{2 +}开关,ZO-1膜存款每个细胞的长度长两倍的存在与缺乏MSC (,)。在强烈的对比中,孵化的MSC / MDCK或MDCK细胞单独与CaMKK (sto - 609)或AMPK (dorsomorphin / C)复合抑制剂预防MSC对AMPK活化和ZO-1分布的影响,在Ca^{2 +}贫困和Ca^{2 +}开关(图2(一个)和2 (d))。这些数据表明,在coculture系统中,MSC调节Ca^{2 +}全身CaMKK-mediated AMPK活化的时候TJ组装上皮细胞,LKB1的独立。

3.5。MSC-Conditioned培养基轻微但显著增强AMPK活化和ZO-1搬迁后Ca^{2 +}开关在MDCK细胞

MSC属性机制涉及通过旁分泌和信息之间的直接接触和间接影响因素(46]。评估是否MSC在Ca的影响^{2 +}全身TJ MDCK细胞组装需要直接和信息交互,我们执行Ca^{2 +}开关使用αmem培养基preexposed MSC为3天。因此,我们观察到MSC-conditioned中等略(1.14倍),但明显(,AMPK磷酸化)增加。因此,扣带皮层部位coculture也增加了1.7倍(,)。ZO-1的搬迁是1.7倍加速在小时Ca^{2 +}开关相比,未经处理的αmem (,)(数据3(一个)和3 (d))。没有MSC-conditioned和未经处理的区别αmem在2小时后^{2 +}开关(图3 (b)和3 (c))。

(一)

(b)

(c)

(d)

(一)
(b)
(c)
(d)

图3

间充质基质细胞的影响- (MSC)条件培养液(CM)的AMPK激活和ZO-1搬迁后Ca^{2 +}开关在MDCK细胞。代表免疫印迹(a)和量化的(b) phospho-AMP-activated蛋白激酶(pAMPK)和总AMPK Ca (AMPKt)低^{2 +}条件(S-MEM)和Ca^{2 +}开关用MDCK细胞暴露于定期与MSC-preexposed媒介。没有污点方法量化免疫反应性的信号进行归一化后的总蛋白质含量每车道。代表免疫荧光(c)和量化(d) ZO-1存款增加Ca后时间点^{2 +}开关在类似的条件(a)和(b)(比例尺:16μ米)。数据提出了平均数±标准差;

4所示。讨论

目前体外观察表明,骨骨髓来源MSC调节上皮TJ的Ca^{2 +}全身的组装。TJ-associated适配器蛋白质的搬迁,ZO-1 MDCK信息联系确实明显加速在MSC。此外,AMPK磷酸化和激活的Ca^{2 +}全身的上皮TJ组装时显著增强MDCK细胞cocultured MSC,可以预防的药物抑制CaMKK。相反,LKB1的损耗并不显著影响AMPK磷酸化Ca^{2 +}开关,有或没有MSC coculture。

AMPK活性是由两个主要的上游激酶调制,即LKB1和CaMKK [18- - - - - -20.,47]。不过,这些AMPK激酶的各自贡献的AMPK激活的Ca^{2 +}开关是未知的(11,18]。LKB1提供基底AMPK磷酸化水平高,调制的AMP的AMPK的绑定γ亚基。AMP绑定到γ亚基变构激活AMPK,使它更容易的磷酸化α亚基活化循环(由LKB1残留Thr172) (48]。注意,AMPK活化与Ca^{2 +}全身TJ大会是独立AMP / ATP比率的变化或能源贫困11,18]。相反,CaMKK激酶可以触发AMPK在Thr172磷酸化反应增加细胞内钙^{2 +}浓度与AMP没有必要的更改或ADP水平(21,49]。我们目前的体外观察进一步支持角色的CaMKK激活AMPK在Ca^{2 +}独立开关,LKB1的活动。因此,药物抑制CaMKK阻碍了AMPK磷酸化和ZO-1搬迁培养条件改变时从低到高^{2 +}浓度,而LKB1的失活并没有显著影响这些过程。

循环因素和细胞已被证明调节TJ形成和维护上皮细胞(50,51]。因此,淋巴细胞加速TJ组装coculture体外模型相比单独上皮细胞(43]。这个加速度被发现由AMPK,独立于细胞ATP水平的变化。此外,它被发现由促炎细胞因子激活tnf (43]。符合这些观察,coculturing子宫内膜上皮细胞和外周血白细胞提高白细胞的生存和上皮屏障功能,所反映的4倍增加transepithelial阻力相比单独上皮细胞(44]。在这项研究中,所需的信息之间的直接接触是有益的免疫细胞的影响。在我们的模型中,我们假设MSC也可能影响TJ的上皮细胞之前报告的组织修复性能在各种器官和组织31日,32,52,53]。MSC效果都是由信息之间的直接接触和旁分泌分泌MVs [54,55]。使用Ca的经典模型^{2 +}全身TJ大会(8),我们发现存在的MSC与显著加速沉积ZO-1信息联系。此外,MSC被废除,以防影响细胞孵化CaMKK或AMPK抑制剂,暗示AMPK途径的关键作用在这样一个过程。重要的注意,AMPK-dependent复合C和独立的角色已报告在一个上下文相关的方式(56]。

这些观察可以部分通过与MSC-conditioned孵化上皮细胞中复制,支持部分角色MSC-derived MVs上皮TJ监管。

5。结论

作为一个整体,我们报告的作用CaMKK AMPK激酶在Ca^{2 +}全身的上皮TJ, LKB1的独立。此外,我们强调的影响MSC AMPK-mediated上皮TJ的监管,通过信息之间的直接接触和MSC-derivated粒子和MSC-derived MVs。这些发现打开小说研究途径MSC修复破译的属性。

的利益冲突

所有的作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

p . Erpicum和f . Jouret昏聩的同伴国家de la任职(FNRS)和接收支持列日大学的(昏聩Speciaux说是和溺爱莱昂Fredericq)和FNRS(研究学分2013年和2016年)。

补充材料