诱导多能干细胞的磁性靶向传递促进关节软骨修复

摘要

使用干细胞进行软骨再生治疗与细胞来源和将细胞输送到软骨缺损的困难有关。我们认为标记诱导多能干细胞(iPS)是组织再生的理想细胞来源，如果iPS细胞只能被输送到软骨缺陷中，就有可能修复关节软骨。因此，我们研究了磁标记iPS (m-iPS)细胞通过磁场进入骨软骨缺损对关节软骨修复的影响。诱导多能干细胞被磁性标记，并通过其形成胚状体的能力来评估其维持多能性在体外并在裸鼠皮下注射后形成畸胎瘤。这些细胞在磁场作用下被特异性地注入裸大鼠的软骨缺陷中。根据软骨再生的组织学分级评分对标本进行分级．m-iPS细胞分化为三个胚层，在皮下组织中形成畸胎瘤。治疗组的组织学评分明显优于对照组。m-iPS细胞保持了多能性，并且磁传递系统被证明对使用iPS细胞修复软骨有效且安全。

1.介绍

众所周知，关节软骨的再生和修复能力较差，由于创伤、骨关节炎或类风湿性关节炎等损伤，使其难以修复。目前软骨损伤的治疗包括保守治疗，如康复治疗、抗炎镇痛药物治疗、关节内注射或手术治疗，如骨髓刺激技术(钻孔和微骨折)和自体骨软骨移植[1，2]．但是，存在与这些方法相关的问题。骨髓刺激技术和自体骨质色神经移植不能完全恢复透明软骨。软骨再生是遗骸仍未解决的主要目标之一[1，3.]．

最近，使用干细胞存在许多软骨再生处理的报道。最近报道的关于软骨再生的研究使用了MSCs，以及来自脂肪组织，滑膜组织和外周血的干细胞[4- - - - - -6]．Vega和合作者报告了关节内注射MSCs治疗骨关节炎患者的功能和软骨质量显著改善[7]．但是，MSC的主要缺点包括限制在体外增殖潜能，其增殖能力和合成能力随着年龄的增长而下降[8]．

胚胎茎（ES）细胞和诱导多能干（IPS）细胞被认为是组织再生的理想细胞源。我们报道，ES细胞可以分化为软骨并用于在软骨缺损中进行修复缺陷[9]．然而，这些细胞的使用引起了伦理问题，因为胚胎干细胞来源于受精卵。另一方面，使用“诱导多能性”细胞不存在伦理问题，因为它们是从成熟的体细胞中诱导出来的，而且可以很容易地收集到大量的细胞。Ko等人的一篇论文．据报道，使用植入软骨缺陷的人体IPS细胞并显示缺陷充满了优质的软骨[10]．

我们报道了当ES细胞被移植到SCID小鼠的膝关节时，它们形成了肿瘤并破坏了膝关节[11]．然而，当它们移植到骨质色盲缺陷中时，它们没有产生畸胎瘤。这些结果表明，将ES细胞限制在缺陷中很重要。可以想到，一些生长因子从骨髓释放，促进ES细胞的软骨组织[9]．另一方面，Kamei等人．据报道，利用磁场将磁性标记的间充质干细胞导入骨软骨缺损，导致缺损的良好修复[12]．因此，我们假设如果磁标记的IPS细胞可以专门用磁场递送到软骨缺陷中，则可以防止畸胎瘤的形成并修复关节软骨。本研究的目的是探讨IPS细胞磁性靶向用于关节软骨修复的功效和安全性。

2.材料和方法

2．1．“诱导多能性”细胞的准备

人iPS细胞来源于人胎肺细胞(MRC-5)，并被表达四种重编程因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)的重组逆转录病毒感染，这些细胞购自美国国家生物医学创新、健康与营养研究所。小区号是JCRB1331 [13]．

以丝裂霉素c灭活的小鼠原代胚胎成纤维细胞(MEF)为供体细胞，在供体细胞上培养iPS细胞。培养基(无血清精华8培养基;生活科技公司，加利福尼亚，美国)每天都在改变。

２．2.动物

9 - 10周龄裸鼠(F344/NJcl-rnu/rnu)购自日本CLEA公司(东京，日本)。本研究得到了实验动物科学研究设施委员会(广岛大学生物医学研究生院)的批准，并按照动物实验指南对大鼠进行护理。

2．3．外部磁力

为了产生磁场，我们使用了钕磁铁(Sangyo Supply Inc.， Miyagi, Japan)。

2.4。IPS细胞的磁标

无血清的Essential 8培养基含有15%胎牛血清(FBS)和1%抗生素混合原液(Nacalai Tesque Inc.，日本京都)，在37°C, 5% CO下平衡₂至少30分钟。纳米级铁粒子(丙酮;将27.9 mg Fe/mL) (Fujifilm RI Pharma Co. Ltd, Tokyo, Japan)加入浓度为98.2 mg Fe/mL的溶液中。人工振荡搅拌3 ~ 5分钟，加入培养皿中iPS细胞，培养过夜。第二天，培养皿用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗两次。

为了纯化磁标记的IPS电池，将外部磁铁置于管旁边，因为将非抗磁标记的IPS细胞滴入培养基中。将细胞分成朝向磁体的那些，落在底部。朝向磁体绘制的IPS细胞表示为M-IPS细胞，而其他IPS细胞表示为非M-IPS细胞。计算每组中的细胞数。

2.5。m-iPS细胞的评估

2.5.1。评估纳米级铁颗粒捕获到IPS细胞中

磁性标记后，除去培养基，用PBS洗两次。将电池固定在4%多聚甲醛磷酸盐缓冲溶液(日本大阪Wako Pure Chemical Industries Ltd.， Osaka)中，室温下固定10分钟。去除磷酸盐缓冲的多聚甲醛溶液，用PBS洗涤，然后用100%乙醇脱水10分钟，去除乙醇后在空气中干燥。盘子上染有柏林蓝色，表明有铁的存在。

2.5.2。多能性的评估

（1）体外评估．胚状体形成如下。单独解离M-IPS细胞和混合在10份灵长类动物ES细胞培养基（Reprocell Inc.，Kanagawa，Japan）中混合10 μ.M rho相关蛋白激酶抑制剂4-[(1R)-1-氨基乙基]- n -4-吡啶基-反式环己烷酰胺，二盐酸盐(Y-27632;日本大阪和子纯化学公司)。然后将m-iPS细胞以1 × 10的比例接种到96孔板上⁴细胞/匀离心3分钟。在5% CO的加湿气氛下孵育3周后₂在37℃下，将形成的颗粒培养2周，每天两天培养基。然后如下免疫沉淀：在4％的多聚甲醛磷酸盐缓冲溶液固定在4℃下将粒料与4％的磷酸盐缓冲溶液固定，用0.1％Triton X-100透露细胞，用含有2％BSA的PBS洗涤，并孵育用含有2％BSA的PBS稀释的原发性抗体。原发性抗体βIII-TIMULIN（Merck Millipore，Darmstadt，德国），Desmin（Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，Ma，USA），和α.-甲蛋白(Merck Millipore)检测使用二抗Alexa-fluor®488偶联抗小鼠IgG和Alexa-fluor 488偶联抗兔IgG(均来自Thermo Fisher Scientific Inc.)。细胞核染1μ.4克/毫升 ，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（Thermo Fisher Scientific Inc.）。

（2）体内评估．畸胎瘤形成如下评价。在本研究中使用裸鼠作为植入受者。等分试样1×10⁸将M-IPS细胞经细胞植入皮下区域。一旦形成肿瘤，大鼠就会人道地杀死，并切除肿瘤以在组织学上评估肿瘤形成。将肿瘤固定在4％多聚甲醛磷酸盐缓冲溶液中48小时，然后嵌入石蜡嵌段中。将样品切成5 μ.M切片，苏木精和伊红染色进行组织学评估。

2.6。手术

为了准备移植，制备单个细胞悬浮液，并在10中在3％的Atelocollagen（Koken，Tokyo，日本）中混合。⁷细胞/毫升。本研究采用裸鼠。术前分别腹腔给予氯胺酮(100 mg/kg)和噻嗪(12 mg/kg)足够麻醉。采用内侧髌旁入路显露膝关节，使用2mm钢圆毛刺在双膝髌骨沟内制造缺陷。缺损的宽度和深度均为2mm。大鼠随机分为三组。在磁力组(M组; )，膝关节缺损填充m-iPS细胞(10⁵用外部磁力吸入软骨缺陷10分钟。磁铁位于popliteal fossa上，用于绘制缺陷。在非磁力组（NM组; )，膝关节缺损处充满iPS细胞(10⁵电池)不使用外部磁力10分钟。为对照组(C组; )，只用胶原蛋白填充缺损。手术完成后，髌骨被重新定位，伤口被闭合。术后4周、6周、8周各时间点，每组处死6只大鼠。

2.7。组织学分析

切除股骨远端并在4%多聚甲醛磷酸盐缓冲溶液中固定48小时。样品用乙二胺四乙酸(EDTA)溶液脱钙，包埋石蜡块，切成5μ.沿轴向平面，脱烷化和水合的M部分。对于组织学评估，将该部分用苏木精和曙红染色并用Safranin O.进行免疫组织学评估，将该部分用针对II型胶原和人体线粒体的抗体染色。对于用II型胶原和人体线粒体的抗体免疫组织化学染色，将这些部分与PBS的10％免疫（Matsunami玻璃Ind.Ltd.，大阪，日本）孵育。将载玻片堵塞在过氧化氢溶液中（3％H.₂O₂）10分钟，然后用PBS洗涤。施用一抗原发性抗体并在4℃下孵育过夜。然后用抗生物素蛋白缀合的过氧化物酶（Vectastain Abc-Elite Lit，Vector Laboratories，Burlingame，California，USA）治疗，然后使用3,3进行可视化- - 胺棉（DAB）衬底试剂盒（矢量实验室）。与II型胶原蛋白的抗体染色的每种样品根据软骨再生的组织学分级评分，如美国和Pineda等人所述．

2.8。统计分析

所有结果均以均数±标准差表示。多组间统计学比较采用Kruskal-Wallis检验，两两比较采用Mann-Whitney检验。一个显著的差异被设定在 ．

3.结果

3.1。IPS细胞的磁标

染色结果显示，由于纳米级铁粒子位于几乎所有iPS细胞内，大多数iPS细胞已成为磁性标记的m-iPS细胞(图)1)．细胞计数显示，m-iPS细胞占总数的93.1±2.2%，而非m-iPS细胞占总数的6.9±2.2% ( )．

3．2．多能性的评估

3.2.1之上。在体外评估

免疫荧光染色表明，期外胚标记物α-胎儿（图2 (b))，中胚层标记结蛋白(desmin)(图2 (c))和内胚层标志物β iii -微管蛋白(图2 (d))均在微球中表达。这证实了m-iPS细胞成功地衍生出了胚状体。这些发现表明，m-iPS细胞具有分化为三个胚胎胚层的能力，并保持多能性。

3.2.2。在体外评估

7只大鼠经皮植入m-iPS细胞，2只大鼠在植入7周后出现肿瘤形成。从宏观上看，每个肿瘤都是囊性和实性组织的混合物3(一个)和3 (b))．组织学上，该肿瘤被归类为未成熟畸胎瘤，因为它包含神经管(图3 (c)），腺结构（图3 (d))和肌肉(图3 (e))．

3．3．关节软骨修复的评估

将胶原水凝胶包埋的iPS细胞移植到大鼠骨软骨缺损处，M组未见肿瘤。肉眼观察NM组大鼠，可见移植后4周膝关节和皮下间隙内肿瘤形成(图)4(一))．组织学上，肿瘤从膝关节突出，认为是畸胎瘤(图4 (b))．

M组移植后4周，股骨髌骨沟骨软骨缺损被透明状软骨覆盖;然而，软骨的表面是不规则的(图5(a))。6周和8周时，所有缺损均被透明样软骨覆盖，表面光滑(图)5（乐队5(c))。相比之下，在NM和C组，骨软骨缺损到8周时没有软骨再生(图5(c))。另外，根据Wakitani方法，M组的平均组织学评分明显好于C组(第4周: ;在8周: )(图6(a))。采用Pineda方法，第4周时M组的评分明显优于其他组(M组和NM组): ;M和C，4周： ;M和NM, 8周时: ;m和c，8周： )(图6（b））。在M组中，免疫荧光染色表明，软骨细胞中存在人体线粒体。这些发现表明M-IPS细胞分化为软骨细胞（图7)．

4。讨论

在本研究中，我们发现外磁场作用下m-iPS细胞修复软骨缺损的效果明显好于无外磁场作用的m-iPS细胞。此外，我们发现在受外磁场作用的m-iPS细胞移植的膝关节中没有肿瘤形成的证据，而未受外磁场作用的m-iPS细胞移植的膝关节中却有肿瘤形成的迹象。结果表明，这种诱导多能性细胞传递系统使软骨再生成为可能，并防止畸胎瘤的形成。

我们已经表明，IPS细胞可以用纳米级铁颗粒磁性标记，并且仍然保持多能性，通过形成胚状体和来自M-IPS细胞的畸胎瘤的形成。有几个关于磁性标记的IPS细胞的报告。Castaneda和合作者报告说，IPS细胞使用Ferumoxytol磁性地标记，并用MR成像显示[14]．此外，Ruan和合作者还报道了由磁性标记的iPS细胞形成的胚状体，这些细胞保持了多能性，并分化为三个胚层在体外[15]．

然而，使用磁性标记的IPS细胞没有报告软骨再生。本研究是第一个评估使用与外部磁力结合的IPS细胞使用磁力标记的IPS细胞修复软骨缺陷的修复。通过外部磁场将M-IPS细胞输送到膝关节的软骨缺陷，并且透明的软骨覆盖缺陷。相反，当在不使用外部磁场的情况下移植到缺陷中的M-IPS细胞时，透明软骨覆盖缺陷。此外，在前者比后者在前者中，软骨再生的组织学分级得分明显更好。UTO和合作者报告将移植IPS细胞与胶原水凝胶联合进入骨静脉缺损，发现修复了缺陷[3.]．他们得出的结论是，在胶原水凝胶中混合iPS细胞可能会导致这些细胞失去细胞间的接触，从而迫使iPS细胞失去多能性并发生分化。在本研究中，外磁场将包埋在胶原蛋白中的m-iPS细胞输送到软骨缺损处，软骨显示出良好的修复水平。然而，在没有外部磁场的情况下，植入胶原蛋白内的m-iPS细胞的软骨修复效果并不好。我们认为，在没有外部磁场的情况下，m-iPS细胞不会被吸引到缺陷处;因此，缺损内的细胞较少，软骨修复效果不佳。

Yamashita和合作者报告说，iPS细胞分化为透明软骨颗粒，并将这些颗粒植入免疫缺陷大鼠的关节表面缺陷中，阻止了畸胎瘤的形成。结果修复了软骨缺损，没有观察到肿瘤和异位组织形成[16]．然而,在活的有机体内软骨干细胞的培养膨胀与包括劳动力，高成本，昂贵的生长因子的必要性以及感染风险的缺点相关[17，18]．我们报道了将胚胎干细胞注射到SCID小鼠膝关节中，细胞形成了畸胎瘤。然而，将ES细胞移植到环孢霉素治疗的免疫抑制大鼠髌骨沟骨软骨缺损中，移植受者未发现肿瘤生长迹象和非软骨细胞组织，并用透明软骨样软骨修复缺损。原因可能是关节间隙的细胞是由关节液而不是血液喂养的，而另一方面，骨软骨缺损的细胞是由关节液和血液喂养的。骨髓中释放的一些生长因子能促进胚胎干细胞的软骨形成[9]．在该研究中，通过外部磁场将M-IPS细胞递送至膝关节中的软骨缺陷，并移动到软骨缺陷的底部，并且未观察到肿瘤形成。相反，当在不使用外部磁场的情况下移植到缺陷中的M-IPS细胞中时，移植后七周观察到畸胎瘤形成。基于组织学分析，肿瘤似乎是一种未成熟的畸胎瘤。我们认为，通过与ES细胞相同的机制，IPS细胞分化成透明的软骨或畸胎瘤。

5.结论

这项研究表明，磁性标记的iPS细胞能够保持多能性，当它们被外磁场输送到软骨缺陷处时，它们可以再生软骨。此外，M组组织学分级评分明显优于NM组和C组，未见肿瘤形成。该方法将有助于利用诱导多能干细胞修复软骨。

信息披露

这项工作的早期版本作为2017年3月19日至22日在2017年3月19日年度会议上作为海报展示。

利益冲突

作者声明本论文的发表不存在利益冲突。

参考

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