SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2017/9514719 9514719 研究文章 磁靶向诱导多能干细胞促进关节软骨的修复 http://orcid.org/0000 - 0003 - 2466 - 4672 Kotaka 真嗣 1 Wakitani Shigeyuki 1 2 Shimamoto 阿基拉 3 http://orcid.org/0000 - 0001 - 5076 - 0145 龟井静香 Naosuke 1 Sawa Mikiya 1 足立 田中伸男(Nobuo 1 http://orcid.org/0000 - 0002 - 7363 - 873 x 人选 Mituo 1 Cucchiarini Magali 1 矫形外科学系 医学部门 生物医学科学专业 生物医学科学研究生院 广岛大学 霞公主1-2-3 Minami-ku 广岛734 - 8551 日本 hiroshima-u.ac.jp 2 健康和体育科学研究生院 Mukogawa女子大学 6-46 Ikebiraki 西宫 663 - 8558年兵库县 日本 mukogawa-u.ac.jp 3 细胞和分子生物学系 生物医学与健康科学学院 广岛大学 广岛734 - 8551 日本 hiroshima-u.ac.jp 2017年 26 12 2017年 2017年 21 09年 2017年 20. 11 2017年 26 12 2017年 2017年 版权©2017真嗣Kotaka et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

利用干细胞治疗软骨再生与问题由于细胞来源和相关的困难提供细胞软骨缺损。我们认为诱导多能干细胞(iPS)标记细胞的理想来源细胞组织再生,如果“诱导多能性”细胞只能被交付到软骨缺陷,有可能修复关节软骨。因此,我们调查的影响磁标记iPS细胞(m-iPS)交到磁场的骨软骨缺损的修复关节软骨。“诱导多能性”细胞标记磁和评估维持多能性的形式拟胚体的能力 在体外和老鼠皮下注入裸体时形成畸胎瘤。这些细胞是专门为软骨缺陷裸大鼠使用磁场。样本根据组织学分级评分分数为软骨再生 。m-iPS胚胎生殖细胞分化成三层和皮下组织形成畸胎瘤。组织学分级评分明显好于治疗组与对照组相比。m-iPS细胞维持多能性,磁性交付系统被证明是有效的和安全的软骨修复使用“诱导多能性”细胞。

 1。介绍

关节软骨再生和修复能力差而闻名,损伤后修复困难由于侮辱如创伤、骨关节炎、类风湿性关节炎。当前对软骨损伤的治疗包括保守治疗康复等抗炎镇痛药物治疗,关节内注射或手术治疗,如骨髓刺激技术(钻井和微裂缝)和自体骨软骨移植 1, 2]。然而,这些方法有问题。骨髓刺激技术和自体骨软骨移植无法完全恢复透明软骨。软骨再生的主要目标之一,基本上仍未解决的( 1, 3]。

最近,有很多使用干细胞软骨再生治疗的报道。最近报道研究软骨再生利用msc、以及干细胞来源于脂肪组织,滑膜组织和外周血 4- - - - - - 6]。织女星和合作者报道更好的功能和软骨质量与msc治疗骨关节炎患者关节内注射( 7]。然而,msc的主要缺点包括限制 在体外增殖的潜力,随着年龄增长,其增殖能力和合成能力下降( 8]。

胚胎干细胞(ES)细胞和诱导多能干细胞(iPS)细胞被认为是一个理想的组织再生的细胞来源。我们报道了胚胎干细胞可以分化成软骨和用于修复缺陷当放置在一个软骨缺陷( 9]。然而,这些细胞的使用引发了道德问题由于胚胎干细胞是来源于人类受精卵。另一方面,没有相关的伦理问题使用“诱导多能性”细胞,因为它们从成熟体细胞诱导,和大量的细胞很容易收集。一篇论文被Ko et al 。报道使用人类“诱导多能性”细胞植入软骨缺陷和显示缺陷充满了优质软骨( 10]。

我们报道了胚胎干细胞移植到膝关节时,他们形成肿瘤,破坏了膝关节在SCID小鼠( 11]。然而,当他们被移植到一个骨软骨缺损,他们没有产生畸胎瘤。这些结果证明是很重要的限制缺陷的胚胎干细胞。可想而知,一些生长因子从骨髓中释放促进软骨形成的胚胎干细胞( 9]。另一方面,龟井静香等 。报告交付磁标记间充质干细胞成一个骨软骨缺损使用磁场,导致好修复的缺陷 12]。因此,我们假设,如果磁贴上“诱导多能性”细胞可以交付具体到软骨缺陷磁场,它可能防止畸胎瘤和修复关节软骨的形成。本研究的目的是调查磁定位的有效性和安全性的“诱导多能性”细胞关节软骨修复。

 2。材料和方法 2.1。“诱导多能性”细胞的准备

人类“诱导多能性”细胞,来源于人类胎儿肺细胞(MRC-5)和感染重组逆转录病毒表达的四个重组因子(Oct3/4, Sox2 Klf4,和原癌基因),购买来自美国国立生物医学创新、健康和营养。细胞数量是JCRB1331 [ 13]。

馈线细胞从老鼠准备初级胚胎成纤维细胞(MEF)灭活与丝裂霉素c .馈线上的“诱导多能性”细胞培养细胞。无血清培养系统中(基本8介质;生命的技术,美国加州)每天都改变了。

 2.2。动物

9 - 12个裸大鼠(F344 / NJcl-rnu / rnu)用于本研究从克丽购买日本公司(日本东京)。本研究委员会批准的实验室动物科学研究设施(广岛大学生物医学研究生院),和老鼠照顾动物实验的指导。

 2.3。外部磁力

提供一个磁场中,我们使用一个钕磁铁(Sangyo供应Inc .、宫城、日本)。

 2.4。磁标记的“诱导多能性”细胞

无血清基本8中有15%胎牛血清(的边后卫)和1%的抗生素混合原液(Nacalai Tesque Inc .,京都,日本)有限公司平衡在37°C下5%2至少30分钟。纳米铁粒子(ferucarbotran;铁27.9毫克/毫升)(富士胶片RI制药有限公司、东京、日本)被添加到解决方案在一个铁98.2毫克/毫升的浓度。解决方案是由手动摇晃搅拌3 - 5分钟,然后添加到“诱导多能性”细胞培养皿,和培养过夜。第二天,盘子被洗两次与无菌磷酸盐(PBS)。

净化磁贴上“诱导多能性”细胞,外部磁铁放置在管的不依从磁贴上“诱导多能性”细胞放入培养基。这些细胞被分为那些吸引磁铁和那些跌至底部。iPS细胞吸引磁铁被表示为m-iPS细胞,而其他人则表示,non-m-iPS细胞。每组的细胞数量统计。

 2.5。评估m-iPS细胞 2.5.1。评估纳米铁粒子的捕捉到“诱导多能性”细胞

磁标签后,培养基是移除,这道菜是用PBS洗两次。细胞被固定在4%多聚甲醛磷酸盐溶液(Wako纯化学工业有限公司,日本大阪)在室温下10分钟。磷酸盐的多聚甲醛溶液被删除,这道菜是用PBS洗净,然后用100%的乙醇脱水10分钟,干后在空气中去除乙醇。这道菜和普鲁士蓝染色显示铁的存在。

 2.5.2。多能性的评估

(1)体外评价。拟胚体形成如下。m-iPS细胞是单独在灵长类动物的ES细胞分离和混合介质(ReproCELL Inc .、神奈川、日本)和10 μM Rho-associated蛋白激酶抑制剂4 - [(1 r) 1-aminoethyl] -N-4-pyridinyl-trans-cyclohexanecarboxamide盐酸盐(y - 27632;Wako纯化学物质,日本大阪)。m-iPS细胞被播种在1×10到96孔板4细胞/离心机3分钟。孵化后3周调湿大气中5%的股份有限公司2在37°C,形成球培养2周,每两天与介质的变化。球被应用如下:与4%多聚甲醛固定的球后磷酸盐溶液在4°C为15分钟,细胞permeabilized Triton x - 100, 0.1%用PBS包含2% BSA,和孵化主要包含2% BSA抗体在PBS稀释。主要的抗体 βIII-tubulin(默克密理博,达姆施塔特,德国),肌间线蛋白(热费希尔科学Inc .)、沃尔瑟姆,妈,美国),和 α胎蛋白(默克密理博)被发现使用二级抗体Alexa-fluor®488 -共轭anti-mouse免疫球蛋白和Alexa-fluor 488 -共轭anti-rabbit免疫球蛋白(从热费希尔科学Inc .)。细胞核染色有1 μ4克/毫升 ′ 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(热费希尔科学Inc .)。

(2)体内评价。畸胎瘤的形成是评估如下。裸大鼠被用作移植接受者在这项研究。1×10的整除8m-iPS细胞经皮植入皮下。一旦肿瘤形成,老鼠人道地死亡,肿瘤切除评估肿瘤组织学检查形成。肿瘤被固定在4%多聚甲醛磷酸盐溶液48小时,然后嵌入在石蜡块。样本切成5 μ米部分和苏木精和伊红染色组织学评估。

 2.6。手术

准备移植,m-iPS细胞的单个细胞悬液制备和混合3% atelocollagen (Koken、东京、日本)107细胞/毫升。裸大鼠被用于这项研究。在手术之前,克他命的老鼠被给予足够的麻醉(100毫克/公斤)和甲苯噻嗪(12毫克/公斤),腹腔内管理。内侧parapatellar方法被用来使膝关节,创建一个缺陷在膝使用2毫米钢轮槽毛刺在两个膝盖。缺陷的大小是2毫米的宽度和深度。老鼠被随机分为三组。磁力组(M组; n = 18 ),膝盖缺陷满心m-iPS细胞(105软骨细胞),被吸引到缺陷使用外部磁力10分钟。磁铁位于腘窝的缺陷。在非磁性力集团(NM组; n = 18 ),膝盖缺陷满心iPS细胞(105细胞)不使用外部磁力10分钟。对照组(C组; n = 18 ),缺陷满心atelocollagen孤单。在完成手术,髌骨重新定位,伤口被关闭。六大鼠每组人道被炸死在每个时间点的4,6,8周后手术。

 2.7。组织学分析

远端股骨被切除和固定在4%多聚甲醛磷酸盐溶液48小时。样本脱钙与乙二胺四乙酸(EDTA)解决方案和嵌入在石蜡块,切成5 μ米部分沿轴向平面、deparaffinized和水化。组织学评估,部分被苏木精和伊红染色和红色染料o . immunohistological评估的部分与II型胶原蛋白抗体染色和人类线粒体。与抗体II型胶原免疫组织化学染色和人类线粒体immunoactive孵化与10%的部分(Matsunami玻璃。有限公司、日本大阪)在PBS。幻灯片被封锁在过氧化氢溶液(3% H2O2)10分钟,其次是与PBS洗涤。初级抗体应用和孵化一夜之间在4°C。抗体反应过程是紧随其后的是一个治疗avidin-conjugated过氧化物酶(Vectastain ABC-Elite点燃,向量实验室,伯林盖姆,加利福尼亚,美国),然后执行可视化使用3,3 ′ -diaminobenzidine (DAB)衬底工具包(向量实验室)。每个样本都沾染了II型胶原抗体是根据组织学分级评分分数为软骨再生所描述的美国和皮等 。

 2.8。统计分析

所有结果都表示为平均值±标准偏差。统计比较在多个团体被克鲁斯卡尔-沃利斯检验评估,并使用Mann-Whitney进行成对比较测试。被设定为一个重要的区别 P < 0.05 。

 3所示。结果 3.1。磁标记的“诱导多能性”细胞

染色显示,大多数“诱导多能性”细胞已经成为磁标记m-iPS细胞因为纳米铁粒子是在几乎所有的iPS细胞(图 1)。细胞计数显示m-iPS细胞由93.1±2.2%的人口而non-m-iPS细胞由6.9±2.2% ( P < 0001年 )。

微观研究(普鲁士蓝染色)的“诱导多能性”细胞标记磁。纳米铁粒子是位于m-iPS细胞内。比例尺= 200 μm。

 3.2。多能性的评估 3.2.1之上。体外<斜体> < /斜体>评估

免疫荧光染色显示,外胚层甲胎蛋白标志(图 2 (b)),中胚层标记肌间线蛋白(图 2 (c)),内胚层标记βIII-tubulin(图 2 (d)球团矿)表示。这证实了拟胚体成功源自m-iPS细胞。这些发现表明,他们有能力分化成三个胚胎胚芽层和m-iPS细胞维持多能性。

微观发现m-iPS细胞颗粒的(a),球被immunofluorescent评估染色(b, c和d)。外胚层制造商甲胎蛋白(b),中胚层制造商肌间线蛋白(c)和内胚层制造商βIII-tubulin丸(d)表示。我们成功地形成胚状体的身体来自m-iPS细胞。比例尺= 500。

 3.2.2。体外<斜体> < /斜体>评估

七个老鼠经皮植入m-iPS细胞进入皮下组织,和两个老鼠显示肿瘤形成7周后植入。宏观上,每个肿瘤囊性和固体组织(人物的混合物 3(一个)和 3 (b))。组织学检查肿瘤归类为一个未成熟畸胎瘤,因为它包含神经管(图 3 (c)(图),腺体结构 3 (d)),和肌肉(图 3 (e))。

肿瘤形成的裸体鼠m-iPS细胞移植(a和b)。m-iPS细胞移植的裸体老鼠显示肿瘤形成在移植后7周(a),宏观上,肿瘤是固体和囊性和压周围组织向外(b)。组织病理学结果(苏木精和伊红染色)的肿瘤(c, d, e)。肿瘤包含不成熟的神经管(c),不成熟的腺体结构(d)和不成熟的肌肉(e)。我们认为,肿瘤是未成熟畸胎瘤。比例尺= 300 μm。

 3.3。评估关节软骨修复

移植后“诱导多能性”细胞嵌入在胶原蛋白水凝胶的骨软骨缺损老鼠,没有看到M组的肿瘤。宏观检验纳米组的老鼠显示膝关节肿瘤形成和皮下空间在移植后4周(图 4(一))。组织学上,从膝关节肿瘤挤压,被认为是一个畸胎瘤(图 4 (b))。

肿瘤形成的膝关节和皮下空间纳米组移植后4周。宏观上,肿瘤是固体和囊性(a)。组织病理学发现的肿瘤(苏木精和伊红染色,b和c)。肿瘤包含未成熟的神经上皮( ∗ ),不成熟的软骨( ∗ ∗ ),和不成熟的间充质元素( ∗ ∗ ∗ )。我们得出这样的结论:肿瘤是未成熟畸胎瘤。比例尺= 2毫米(b)和500年 μ在(c m)。

在M组移植后4周,股骨骨骨软骨缺损的膝沟是由hyaline-like软骨;然而,表面的软骨不规则(图 5(a))。在6 - 8周,所有缺陷都被hyaline-like软骨覆盖,表面是光滑的(数据 5(b)和 5(c))。相比之下,在海里和C组,骨软骨缺损8周(图没有显示出再生软骨 5(c))。此外,组织学分级评分,根据Wakitani的方法,是更好比C组(M组4周: P = 0.011 ;在8周: P = 0.005 )(图 6(a))。皮的方法,使用M组得分显著优于其他组(M和纳米,在4周: P = 0.05 ;M和C,在4周: P = 0.002 ;M和纳米,在8周: P = 0.04 ;M和C,在8周: P = 0.008 )(图 6(b))。在M组,immunofluorescent染色显示人类线粒体存在于软骨细胞。这些发现表明,m-iPS细胞分化成软骨细胞(图 7)。

体内软骨修复在4、6和8周后移植。在M组移植后4周,股骨骨骨软骨缺损的膝沟是由hyaline-like软骨;然而,软骨表面的不规则(a)。在6和8周,缺陷也被hyaline-like软骨覆盖,表面是光滑的(b和c)。另一方面,纳米组和c组,骨软骨缺陷可以通过8周不再生软骨(c)条= 500规模 μm。

组织学分级评分均值Wakitani和皮内。Wakitani组织学分级评分的均值显著更好比C组(M组4周: P = 0.011 ;在8周: P = 0.005 )。由皮M组得分显著优于其他组(M和纳米,在4周: P = 0.05 ;M和C,在4周: P = 0.002 ;M和纳米,在8周: P = 0.04 ;M和C,在8周: P = 0.008 )。 ∗ P < 0.05 。

Immunofluorescent染色与人类线粒体抗体(a、b和c)和红色染料O染色(d)的软骨细胞。软骨细胞表达的人类线粒体抗体。这些发现表明,m-iPS细胞分化成软骨细胞。酒吧= 50 μm。

 4所示。讨论

在这项研究中,我们发现使用m-iPS细胞软骨缺损的修复与应用程序的外部磁力明显比没有外部磁力。此外,我们发现没有证据表明肿瘤形成与m-iPS膝关节移植细胞与外部磁力,而移植没有外部磁力确实显示肿瘤的形成。结果表明这个系统交付的“诱导多能性”细胞使软骨再生,防止形成畸胎瘤。

我们已经表明,“诱导多能性”细胞可以与纳米铁粒子和磁标记仍然维持多能性,证明了拟胚体的形成和畸胎瘤m-iPS细胞。有几个以前的报告“诱导多能性”细胞标记磁。卡斯塔涅达和合作者报道,“诱导多能性”细胞标记磁使用ferumoxytol先生和可视化成像( 14]。此外,阮和合作者报道,拟胚体是由“诱导多能性”细胞标记磁并维持这些细胞多能性和分化为三个胚芽层 在体外( 15]。

然而,还没有报告的软骨再生利用iPS细胞标记磁。这项研究是第一个评估软骨缺损的修复使用“诱导多能性”细胞标记磁结合外部磁力。m-iPS细胞被交付给膝关节软骨缺损由外部磁场,缺陷是由hyaline-like软骨。相反,当m-iPS细胞被移植到缺陷不使用一个外部的磁场,缺陷没有被hyaline-like软骨覆盖。此外,软骨再生的组织学分级评分是在前者比后者更好。Uto和合作者报道移植“诱导多能性”细胞结合胶原水凝胶成osteocartilage缺陷,发现的缺陷修复( 3]。他们得出的结论是,“诱导多能性”细胞混合胶原水凝胶可能导致这些细胞进行信息联系,迫使“诱导多能性”细胞失去多能性和经历分化。在这项研究中,嵌入atelocollagen m-iPS细胞是由外部磁场和成软骨缺损修复软骨显示良好的水平。然而,当嵌入atelocollagen m-iPS细胞移植没有外部磁场,软骨修复没有那么好。我们相信,没有总结出m-iPS细胞向缺陷没有外部磁场;因此,减少细胞内存在缺陷和软骨修复并不是那么有效。

山下式和合作者报道,“诱导多能性”细胞的分化成透明软骨粒子和粒子植入联合免疫缺陷鼠阻止畸胎瘤形成表面缺陷。因此,软骨缺陷被修复,观察肿瘤和异位组织形成( 16]。然而, 在活的有机体内文化扩张的软骨干细胞与缺点包括劳动力,成本高,需要昂贵的生长因子,和感染的风险 17, 18]。我们报道了胚胎干细胞注入时的膝关节SCID小鼠,细胞形成畸胎瘤。然而,当胚胎干细胞被移植到骨软骨缺损在免疫抑制大鼠膝沟与环孢霉素治疗,没有观察到肿瘤生长的迹象或nonchondrocyte组织移植受者和缺陷与hyaline-like软骨修复。原因可能是细胞在关节空间是由关节液不是血缘,而另一方面,那些在一个骨软骨缺损都由关节液和血液。一些生长因子从骨髓中释放促进软骨形成的胚胎干细胞( 9]。在这项研究中,m-iPS细胞被送到在膝关节软骨缺损由外部磁场和搬到软骨缺损的底部,并没有观察到肿瘤形成。相比之下,当m-iPS细胞被移植到缺陷不使用一个外部的磁场,观察畸胎瘤的形成在移植后7周。肿瘤似乎是一个不成熟畸胎瘤,根据组织学分析。我们相信“诱导多能性”细胞分化成hyaline-like软骨或畸胎瘤与胚胎干细胞相同的机制。

 5。结论

本研究表明,磁标记“诱导多能性”细胞维持多能性,当他们交付给一个软骨缺陷由外部磁场,他们可以再生软骨。此外,M组的组织学分级评分明显优于纳米组或C组,并没有观察到肿瘤形成。这种方法将有助于软骨修复使用“诱导多能性”细胞。

 信息披露

早期版本的工作提出了海报在口服补液盐2017年会,2017年3月19日至22日。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

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