分离技术和定位对人角膜基质来源细胞表型的影响

摘要

目的．目的探讨分离技术和定位对人角膜基质来源细胞表型的影响。方法．采用外植体或酶消化技术从角膜基质中心和周围分离CSCs。用流式细胞仪对培养的细胞进行分析。用PCR法测定培养细胞和天然细胞中的基因表达。结果．原生间质阳性α.-肌动蛋白、ALDH1A1、CD31、CD34、I型胶原蛋白和波形蛋白。培养细胞表达CD73、CD90、CD105、CD51、Nestin、CD49a、CD49d、ABCG2和CD47。PCR结果显示，天然组织中ALDH1A1、AQP1、ITGB4、KLF4、CD31、CD34、CXCR4表达显著上调，而培养细胞中ABCG2、ITGAV、Nestin、CD73、CD90、CD105、Vimentin表达显著上调。GPC没有变化。结论．本研究发现基质中心和外围的外植体和酶解技术产生的CSCs的表型无显著差异。细胞的分离可以在不考虑用于研究的位置和分离技术的情况下进行。与原位状态相比，培养的CSCs经历了完全的表面标记和基因型谱变化。

1.介绍

人的角膜基质负责眼睛的屈光力的三分之二，占角膜厚度的90％。当受疾病或创伤的影响时，稳健性和因此组织的透明度受到损害。这部分是由于局部水肿的存在和常驻角膜细胞的激活 - 角膜织物。这些静态细胞假设树突细胞形态体内并合成形成组织骨干的胶原蛋白和蛋白多糖[1];当被激活时，角质形成细胞可转化为肌成纤维细胞，并与瘢痕形成和最终角膜透明度的丧失相关[2，3.］．此类病例的治疗通常包括板层或穿透性角膜移植，但由于全球供体短缺，寻求其他来源，如生物工程或脱细胞角膜或假体[4，5］．

已经显示出从人角膜基质衍生的细胞具有特异性分化势和特定标记物的存在或不存在（例如，CD73⁺, CD90⁺，CD105⁺，CD34⁻，CD45⁻，CD14⁻, CD11b⁻，CD79α.⁻，CD19⁻, HLA-DR⁻)，而黏附塑料和暴露于血清可使这些细胞等同于间充质干细胞(MSCs) [6，7］．此外，CSCs的免疫抑制潜能已被证实[8，9，以及它们在动物研究中的细胞治疗潜力[10］．

CSC文化的建立相对容易。然而，许多国家在角膜移植手术后只能获得未使用的角膜环中残留的外周组织。利用酶消化将CSCs从紧密的胶原层中分离出来似乎也很简单[11，12]，同时已经建立了分离角膜组织块体外培养细胞的外植体培养方法。关于从体外角膜基质中生长出来的细胞的真正来源仍有许多推测[9，12］．最有可能的是，在分离和可能不同的副群体后激活的角膜基质的常驻细胞变得显着，最终产生显示肌细胞的细胞培养物[9，13，14］．

各种类型的培养基也被评估，以阐明诱导的最佳可能条件体外这些细胞的干细胞表型[15];然而，到目前为止，还没有进行比较，以确定从不同位置分离的细胞(角膜中心和角膜周围)是否显示出任何差异。本研究旨在通过角膜中心和外周部分的外植体和酶消化方法建立角膜基质培养，并比较其表型和基因典型特性，为这些细胞在角膜研究或细胞治疗方面的未来应用提供依据。

2。材料和方法

2.1。隔离程序和培养

尸体组织收集符合《赫尔辛基宣言》的指示，并得到国家医学研究理事会的批准(14387/2013/EKU-182/2013)。样本在死亡后24小时内获得。用聚维酮碘消毒(Egis，匈牙利)，用人眼球的PBS冲洗后，用剪刀解剖角膜纽扣。角膜上皮、Descemet膜、角膜内皮脱落。为了获得同等大小的基质移植体，在环钻的帮助下，从角膜钮扣上从被定义为外周基质和中央基质的区域钻出直径为3mm的组织块，如图所示1．以上述相同的方法从中心和外围区域产生相同数量的打孔，并在37℃下搅拌，用3mg /mL (>125 CDU/mg)混合胶原酶溶液(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)处理3小时。

四种类型的CSC培养物分别被定义为来自同一供体的中央外植体(CE)和外围外植体(PE)与中央消化体(CD)和外围消化体(PD)，分别参照酶消化的位置和有无酶消化。使用24孔板(Corning Costar, Sigma-Aldrich)扩大细胞。添加10%胎牛血清(FBS) (Sigma-Aldrich)和1%青霉素链霉素(PS) (Sigma-Aldrich)的Dulbecco 's Modified Eagle Medium (DMEM) (Sigma-Aldrich)应用于细胞。文化媒介每隔一天更换一次。实验用的是第4代之前的细胞。

2.2。培养CSC中增殖标志物Ki-67的免疫荧光染色

CD、PD、CE和PE在24孔培养板中扩增(Corning Costar)。细胞在4%多聚甲醛(Sigma-Aldrich)中固定，并使用0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich)进行渗透。将1% (Sigma-Aldrich)稀释的牛血清白蛋白(BSA)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中作为封闭溶液，在室温下封闭1小时。样品与Ki-67 (Sigma-Aldrich)抗体在室温下孵育1小时。用藻红蛋白偶联的二抗显示蛋白，最后用4 '，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI, Sigma-Aldrich)反染色染色细胞核。照片由EVOS FL显微镜(Thermo Fisher Scientific)拍摄。

2．3.自体角膜组织的免疫荧光染色

为了研究蛋白的原位表达，我们从石蜡包埋的组织中制备角膜切片，并对由祖细胞和/或干细胞表达的标记物(ABCG2, CXCR4和Nestin)进行染色。增殖- (Ki-67)、功能相关(ALDH1A1、I型胶原和CD34)、MSC标记物(CD73、CD90、CD105和Vimentin)、细胞外基质和细胞粘附成分(纤维连接蛋白、IV型胶原和VE-Cadherin)和其他分子(α.染色-Actinin，ABCG5和抗丝细胞标记物。有关所用抗体的更多信息如表S所示在线提供https://doi.org/10.1155/2017/9275248．

简而言之，切片脱链，在室温下用1% BSA (Sigma-Aldrich)封闭非特异性部位1小时。一抗在4°C下过夜。用含1%吐温-20 (PBST)的PBS洗涤3次，5分钟后，Alexa Fluor 488标记的二抗在室温下孵育1小时。DAPI反染色显示细胞核。照片由蔡司Axio观察家Z1(卡尔蔡司)显微镜拍摄。

２.４.荧光激活细胞分选

CSC在150厘米中转移²用于FACS分析的烧瓶(TPP, Sigma Aldrich)。通过胰蛋白酶收集细胞(Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, Logan, Utah, USA)进行表面蛋白表达分析。1000 RPM离心10分钟后，用FACS缓冲液(0.05%钠叠氮，0.5%牛血清白蛋白在DPBS中)重悬。三色染色-异硫氰酸荧光素、藻红蛋白和别藻蓝蛋白结合的抗ABCG2、CD31、CD34、CD44、CD47、CD49a、CD49d、CD51、CD73、CD90、CD105和nestin的一抗在4℃下应用30分钟。采用FACS Calibur流式细胞仪(BD Biosciences, Immunocytometry Systems)检测样品。最后，使用flow Software 2.5 (Perttu Terho, Turku Centre for Biotechnology, University of Turku, Finland)和FCS Express 6 (De Novo Software, California, USA)对数据进行分析。有关抗体的更多信息见表S ．

2．5．逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)分析

取3例无上皮和内皮的角膜基质组织。供体组织均质化并汇集。用Qiazol试剂(Qiagen)和RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)按照制造商的方案分离总RNA。同样，RNeasy迷你试剂盒从培养的细胞中分离出4种条件下的总RNA，并从3名供体中汇集。

通过纳米玻璃分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测定核酸浓度。随机六甲虫和上标III逆转录酶（Life Technologies，Waltham，MA，USA）用于转录1 μ.g RNA转化为cDNA。采用StepOnePlus RT-PCR系统(Applied Biosystems)和Taqman基因表达法测定基因的相对表达量。基因ALDH1A1(Hs00605167_g1),ABCG2（HS01053790_M1），AQP1（HS01028916_M1），CD31(Hs01065279_m1),CD34.(Hs00990732_m1),CD73.（HS01573922_M1），CD90/THY1（HS00174816_M1），CXCR4.(Hs00607978_s1),英格（CD105)(Hs00923996_m1),GPC4.（HS00155059_M1），ITGAV.(Hs00233808_m1),ITGB4.（HS00236216_M1），KLF4（HS00358836_m1），巢蛋白(Hs00707120_s1),波形蛋白(Hs 00185584_m1)用于分析。在95°C下10分钟，然后在95°C (15 s)和60°C下1分钟设置40个循环。数据分析由2^−ΔΔCt方法。相对于天然基质组织的表达水平，测定Fold change(相对数量)。18 s RNA（HS03003630_G1）用作管家基因。所有样品均以三份酸盐进行。

2.6。统计分析

单因素方差分析和学生t- 最低用于揭示不同组之间的统计差异。意义程度设定为0.95。值小于0.05 ( ； ）被认为是显着的。

3.结果

3.1。细胞形态和增殖活性

由酶法（CD，PD）建立的培养物立即产生CSC，这些细胞快速增殖（图2(一个)），在10-12天内达到汇合（图2 (b)）.从中心和外围区域(CE, PE)的外植体培养物在显微镜下没有显示出增殖活性，直到12-14天，当CSCs开始实际迁移和增殖在外植体的边缘(图)2(一个)）.分离后20 ~ 25天，外植体培养达到一致(图2 (b)）.在不同地点（中枢与周边）和分离技术（外甲术与酶消化）产生的CSC之间没有观察到明显的形态学差异。

ki-67染色揭示了从角膜基质的中央和周围区域分离的外植体和消化培养物中细胞的强烈增殖能力（图3（a））.所有染色细胞中Ki-67阳性分别为4.21±1.53%、7.87±4.73%、8.60±4.58%、10.95±4.42%(图1)3（b）)，分别为CD、CE、PD和PE ( ）.

3.2。原生角膜基质的免疫荧光染色

为了首先证明培养的角膜培养的常驻细胞的差异表达模式，在天然角膜中进行茎秆，间充质，上皮，内皮细胞来源和细胞外基质组分和细胞外基质组分和粘附蛋白的表达（图4和表1，以查阅研究结果摘要)。前基质定义为角膜上皮近端角膜前1/3厚度，后基质定义为角膜内皮近端角膜前2/3厚度(图S)）.

无法在任何角膜层或区域原位检测ABCG2和ABCG5的表达。ALDH1A1和ALDH1A1的强烈染色α.-肌动蛋白出现在间质中央和周围区域。CD34的存在被来自基质原位各部分的强烈信号所证实，同时也检测到了CD31。(图4）.

主要基质成分，胶原I的表达表明，在整个基质中可以检测到强烈的阳性，同时可以在整个基质中检测胶原蛋白。MSC标记的三合会：CD73，CD90和CD105在本地角膜中为阴性，并且在组织中不能检测到KI-67，CXCR4和Nestin等标记。可以在基质中证实皮蛋白的存在，而纤连蛋白在本地角膜基质中似乎是阴性的。在该组织中也发现了抗细胞细胞，成纤维细胞标记物和Ve-cadherin的表达（图4）.

3．3.培养的CSCs表面蛋白表达谱

FACS分析显示MSC标记的高表达：CD73，CD90和CD105，培养条件下没有显着差异（图5和表S.）.粘附分子CD51、CD49a、CD49d和整合素相关CD47的表达增加，在不同条件下无显著差异。假定的干细胞标记ABCG2和Nestin也呈阳性，而CD34和CD31呈阴性。统计分析显示，在不同的分离条件下，后一种蛋白的表达没有显著差异。

3.4。培养的CSC和天然角膜基质中的基因表达模式

与天然基质（14-，95-和25倍，培养的CSCs中CD73，CD90和CD105 / endoglin显着表达较高; ， ， 和 、职责)。在两种方法分离的不同区域中，后一种基因的表达没有差异。Vimentin的表达在培养的CSCs中似乎比原生间质高18倍( ）各种培养条件之间没有差异。与在天然组织中发现的表达相比，CD34的表达在培养的细胞中显着下调，如5倍，如 ）.与天然细胞相比，培养的CSCs中CD31显著下调( ）.与天然角膜基质相比，可以在培养条件下检测Aldh1a1的显着降低（ )(图6）.

与天然基质细胞相比，ABCG2在原代CSCs中的表达增加了60倍( ）.与天然组织相比，培养的CSCs中AQP1、CXCR4、ITGB4和KLF4的表达显著降低( ， ， ， 和 ，resp。），而Itgav和Nestin在文化中显着上调（ ， ）.GPC4的表达不受培养影响( ）.

4。讨论

来自角膜基质的细胞是角膜研究、药物测试和未来眼睛或其他器官细胞治疗的良好来源[9，16］．来自人角膜基质中央部分的外植体的CSC最近被美国广泛表现了[6］．这些细胞显示出类似msc的特性体外，包括三龄分化潜能和免疫抑制特征。然而，这些特征似乎不是常驻细胞的特征体内．仍然讨论是否从基质干细胞获得的细胞实际上是经历形态和功能变化或存在不同的小祖细胞的基质角蛋白酶体内，它会在体外被激活。

世界范围内角膜供体短缺[17[全球许多研究组在角膜膜复位后剩余的角膜环的可用性证明了可以使用用于隔离角膜基质细胞的不同来源或技术的比较和澄清。手术后的大多数可用组织含有来自周边的基质，例如在穿透角膜术后剩余的，Dmek或Dsaek程序。

自体角膜组织的免疫染色显示，在角膜中央和周围部分，之前描述的标记物的表达没有显著差异。天然角膜基质没有显示假定的干细胞标记物——外排蛋白abcg2的表达，而在由两种分离技术(外植体和酶解)产生的中央和周围区域的培养中，观察到强烈的染色。这种在培养的CSCs与天然细胞中发现的表达差异也可以在基因表达水平上得到证实。ABCG2的上调可能导致培养细胞对外部应用治疗(如化疗)更强的抗性，而癌细胞已经知道利用这些分子在恶劣条件下生存[18，19］．Hoechst 33342染色的小鼠成体干细胞已被证明通过ABCG2排出染料，可被维拉帕米抑制[20.］．类似地，在人缘上皮细胞中鉴定了侧面群[21］．在天然角膜中，不能发现ATP结合盒式磁带转运蛋白超家族的另一种成员的表达，例如ABCG5。

ALDH1A1，角膜结晶的表达对于维持透明性至关重要，其下调与角膜雾霾相关[22］．角膜基质呈强染色，均匀分布于角膜中央和周围区域。有趣的是，与天然组织相比，其表达在培养条件下显著下调。

角膜的所有层表达α.-肌动蛋白，包括基质。由于角化细胞表达这种蛋白，因此不能单独使用该标记物来排除成纤维细胞的存在体内或体外[23］．

CD31通常由血管内皮细胞表达，并且可能参与白细胞迁移。CD31在角膜伤口愈合中多核细胞的吸引和粘附的作用已经证明[24];然而，它在诸如本地角膜之类的未遭受的和纯粹的缺血组织中的作用仍不清楚。有趣的是，前体内培养的CSCS通过此处施加的分离方式引发了CD31阳性。RT-QPCR分析证实了CD31在培养与天然细胞中的统计学显着下调。

关于CD34的抗血液功能众所周知，其通常被称为造血祖细胞的标志物，而证据表明该标记可能在免疫过程中的功能，例如调节嗜酸性粒细胞粒细胞和树突细胞的迁移和移动性，如下所示动物淘汰实验[25］．一些研究已经证明了CD34存在于角质形成细胞中，并随着体外培养时间的推移而丧失[16，26］．在天然角膜中确实可以检测到角膜基质的强染色，而在培养细胞中则不是这样。基因表达分析进一步支持了这一发现，与天然基质相比，培养的CSCs中CD34的表达减少了5倍。这也与其他人的发现相一致，这仍需要在角膜中进一步阐明这种蛋白质的功能[16］．Aquaporin-1是伤口愈合过程中角蛋白迁移的重要因素，体内，这是下调，但仍然表达体外在动物模型中[27］．

MSC的三种标志物——cd73、CD90和cd105在原位检测中呈阴性，而在体外培养的所有细胞中均呈强阳性。当比较培养细胞和天然细胞的基因表达时，也发现了同样的结果。这些发现得到了另一项独立研究的支持[28[显示出强潜在的角膜基质细胞，以及它们在培养后激活的能力。根据国际细胞疗法（ISCT）的国际社会，增加了后三种蛋白的表达，以及在离体培养期间的丧失CD34的丧失，是CSC的样本样表型。不同原点的其他类型的MSCs展示了类似的表面表型特征（CD90和CD105的高表达）[29- - - - - -32］．CD90被认为参与细胞与基质和其他细胞的粘附、炎症、纤维化、迁移和肿瘤生长，[33]虽然CD73可能对MSC的免疫抑制作用负责[34］．这个功能最近已经被我们演示过了，并且[6］．这些分子保留在细胞上的长期和多个通道，如美国和其他人所证明的同样[35］．

描述构成角膜脊梁的细胞外基质对阐明角膜基质细胞之间的差异也非常重要体内，而在它们的生态位，和体外。角膜基质的主要成分I型胶原在天然基质中大量存在，而IV型胶原则不存在。整合素α.发现V（CD51）在培养细胞上表达，在基因水平上观察到上调，而整合素β与原位相比，4是显着下调的离体。

这些发现进一步加强了培养的细胞对它们周围的环境利基的变化进行了响应，这可能通过沉积Novo合成的胶原蛋白（数据未显示）来补偿。

天然完整的角膜中也不存在纤维连接蛋白，这证实了这种细胞外基质成分的角膜伤口愈合特性。纤维连接蛋白的沉积在穿透性创伤后不久就出现在上皮细胞和基质中，尽管它在两周内消失[36］．

Ki-67在角膜切片中也未检测到。这进一步证实了没有损伤影响对照组、天然上皮或角膜的其他层，因此表明存在诱导细胞增殖，尽管外植体和酶促技术产生的培养物从不同的角膜区域显示出积极增殖的ki -67阳性细胞。

间质标记Vimentin在间质中表达。这与其他人的发现是一致的。在击倒研究中也显示波形蛋白会导致角膜混浊[37］．神经茎标记物巢蛋白不能在本地角膜基质中检测到。已知该蛋白质在鼠角膜产生的球形培养物中表达，而预防前体巢蛋白阳性群体已在兔子的外周角膜中显示[38，39］．与天然组织相比，发现在培养的细胞中被发现在培养的细胞中进行上调。蛋白质在增殖细胞中表达，并且被认为在中间细丝的重组中具有作用。

KLF4是一个重要的茎秆标记，与暴露于外界的组织有关[40］．角膜是眼睛第一个也是最重要的机械屏障。我们在此表明，与天然基质相比，培养的CSCs中KLF4基因表达降低。假定的干细胞迁移/归巢标记物CXCR4 [41.，42.]免疫染色未检测到，PCR检测到低水平。其他人也报道了类似的情况，在培养的MSCs中有少量功能性CXCR4，但阻断该分子导致骨髓归巢反应降低[43.］．CXCR4也与恶性细胞的侵袭和上皮-间充质转化(EMT)有关[44.］．

总之，在体外培养的CSCs中，干细胞和间充质细胞标记物普遍上调，功能相关分子下调，这些都是在处理此类细胞时应考虑的。角膜基质细胞的潜力已经在动物研究中多次得到证实;然而，当使用这些单元格作为部分时，似乎需要做出某些妥协体外研究模型，由于惊人的差异体内和体外．

本研究表明，来自角膜的中央或外周区域的消化或消化蛋白方法产生的CSC之间没有表型或基因型差异。然而，与离体扩增的CSC相比，天然角膜基质细胞的基因表达和蛋白质谱表明后者可能适应体内细胞外基质Niche在培养基中采用的环境和血清存在。表达谱的这种变化表明，动态的角膜基质细胞如何是对环境的基础，并且可能对眼睛表面和鞘内缠绕或炎症。是否仍有待进一步检查这些变化是否是可逆的，或者如果在用于治疗角膜，眼睛或人细胞疗法中的其他条件下，细胞改变其基因和蛋白质表达是有益的。尽管是侵入性的程序，但最有可能从任何健康的现场捐赠者中取出的未来活检，可能会产生可行的，扩大的基质细胞的群体表现出间充质干细胞样特性。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

Richárd Nagymihály和Zoltán Veréb对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

RichárdNagymihály已得到欧盟成本行动BM1302旅行授权的支持，以在挪威眼科学院挪威科学研究/眼科研究中心的主机网站上进行各种实验。Goran Petrovski和匈牙利大学医学院，医学院，匈牙利大学的眼科和眼科研究实验室（Ktia_nap_13-A_III / 9和Ginop-2.3.2-15-2016）得到了支持-00006）（匈牙利），由欧盟和欧洲区域开发基金委同。此外，该项目还通过了眼科研究中心，眼科，奥斯陆大学医院和奥斯陆大学和2009 - 2014年项目合约的财务机制，挪威金融机制。MSMT-28477/2014，项目7F14156。

补充材料

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