文摘

众所周知,肌原性的监管因素的编码Myod1家族的基因在肌细胞生成关键角色,与部分重叠的功能,展示了老鼠胚胎。Myogenin然而,突变的小鼠表现出严重的肌原性的缺陷无偿由其他肌原性的因素。MYOGENIN可能有类似的功能在人类肌原性的细胞。为了验证这个假设,我们生成的MYOGENIN突变的人类“诱导多能性”细胞利用CRISPR / Cas9基因编辑技术。我们的研究结果表明,MYOD1-independent或MYOD1-dependent机制可以弥补的损失MYOGENIN,这些机制可能是调节骨骼肌分化和形成的关键。

1。介绍

在脊椎动物的胚胎,骨骼肌的躯干和四肢来源于体节,从dermomyotome引起骨骼肌肌原性的祖细胞,直接到项目由四个肌原性的bHLH转录因子,Myf5, Myod1, Mrf4, Myogenin (Myog) [1- - - - - -3]。脊椎动物胚胎的肌原性的分化过程是由这些因素导致的形成多核肌管,随后骨骼肌再生的肌原性的干细胞在成人的储备4,5]。

单一或复合基因敲除小鼠的基因编码创建了这些肌原性的因素来确定其功能在肌细胞生成3]。单Myf5——或者Myod1有缺陷的小鼠并没有发现显著的骨骼肌表型(6- - - - - -8),指向重叠这些肌原性的决定因素之间的函数(9- - - - - -11]。Mrf4,这是coexpressedMyf5在肌细胞生成的发病,也作为一个早期肌原性的决定因素(11]。这些基因突变体的两倍和三倍的展示他们的角色在决定肌细胞的命运。这个基因家族的第四个成员,Myog表达,出现肌肉细胞分化。单Myog骨骼肌形成的缺陷的小鼠表现出严重缺陷在开发期间,当Myod1和在一个阶段,在许多肌肉,Mrf4也存在。需要这样证明Myog胚胎肌肉分化,没有冗余或补偿机制取代它的功能,不像其他的肌原性的监管因素(10,12- - - - - -15]。

在这项研究中,我们已经解决的问题是否这些肌原性的因素在人类肌细胞生成和类似的相互关系,特别是,是否人类MYOGENIN (MYOG)也是必不可少的肌细胞肌原性的细胞分化和肌肉纤维的形成源于人类诱导多能干细胞(臀部)细胞。执行功能的实验中,我们使用多功能基因编辑技术,与CRISPR / Cas9系统(16,17]。

2。材料和方法

2.1。基因定位和人类“诱导多能性”细胞

的hMYOG目标质粒向量,pX458 -hMYOG+ 189,使用pX458向量构造(美国剑桥Addgene # 48138)17与切断寡核苷酸(表)1)所述,质粒DNA引入HEK293——或者Hu5 / KD3-immortalized人类肌原性的细胞(18),与ViaFect试剂(美国麦迪逊Promega)。的electroporator NEPA21 (NEPA基因、千叶、日本)是用于将质粒引入臀部细胞(19]。

表1
候选人和寡核苷酸MYOGENINCRISPR / Cas9 exon1目标位置。
2.2。细胞培养和肌原性的分化

臀部细胞保持在SNL馈线细胞,治疗10μ克/毫升的丝裂霉素(美国圣路易斯σ)DMEM (Wako,大阪,日本)补充10%的胎牛血清(美国大岛屿GIBCO),或扩大在灵长类动物ES细胞培养基(ReproCELL、神奈川、日本)补充10 ng / ml的重组人类FGF2 (bFGF;Wako,日本大阪)和100年μ克/毫升的G418 (Nacalai Tesque,京都,日本)。MYOG缺乏“诱导多能性”细胞保持在SNL馈线细胞或imatrix - 511 (Nippi、东京、日本)涂层板StemFit AK03N(味之素、东京、日本)feeder-free文化制度下(20.]。

从臀部肌原性的细胞来源的细胞,田中等人的详细协议基于MYOD1感应(21),之后。总之,单一的“诱导多能性”细胞携带一个诱导MYOD1激活系统扩展在灵长类动物的ES细胞中没有bFGF和10μM的y - 27632 (Nacalai Tesque,京都,日本)24小时,然后诱导成肌原性的细胞通过添加500 ng / ml的强力霉素(阿霉素;Tocris,英国布里斯托尔)。24小时后,培养基变成alpha-MEM组成的肌原性的分化培养基(Nacalai Tesque,京都,日本)5%的KSR(美国大岛屿GIBCO)和强力霉素500 ng / ml。6天后,培养基是变成肌肉成熟中,DMEM / F12 (Nacalai Tesque,京都,日本),5%的马血清(美国圣路易斯σ),10 ng / ml的重组人胰岛素样生长因子1 (igf - 1;美国哈特福德郡PeproTech), 200年μM 2-mercaptoethanol(我;美国圣路易斯σ)。

获得肌原性的细胞来源于胚胎中胚层细胞,单一的“诱导多能性”细胞扩大在StemFit AK03N补充10μM的y - 27632。2天之后,变成了修改后的中胚层分化培养基培养基是所描述的Loh et al。22]。培养细胞通道12天后和在中胚层分化培养基培养10μy - 27632 M 2天。启动肌原性的分化、中SF-O3 (EIDIA、东京、日本),补充10 ng / ml bFGF, 10 ng / ml的igf - 1, 10 ng / ml的胶质瘤(美国哈特福德PeproTech),和200年μ使用M的我,变成了肌原性的分化培养基和igf - 1和igf - 1 4天,然后后和HGF后3天23]。获得更成熟的肌原性的分化,培养基是变成DMEM / F12补充2%的马血清,10 ng / ml的igf - 1, 200μ我2周后,诱导细胞收获在60天[23]。

2.3。细胞分类

培养细胞转染pX458 -hMYOG+ 189是分离TrypLE选择(美国大岛屿GIBCO) 37°C 5分钟检测转染细胞。分离细胞resuspended 1%牛血清白蛋白在PBS。细胞与细胞碎片被淘汰过滤器(35μm;BD,新泽西,美国),悬浮体沾propidium碘(美国尤金分子探针)排除死细胞。细胞分析和收集的细胞分选仪使用FACSJazz(美国新泽西州BD)。

2.4。定量PCR分析

从排序或培养细胞总rna提取使用RNeasy微工具包(试剂盒、希尔登,德国)。为定量PCR分析,单一链cDNA准备使用上标很工具包(美国卡尔斯巴德英杰公司)作为制造商的协议。所有RT-qPCR反应进行了一式三份使用雷鸟SYBR qPCR混合(TOYOBO,大阪,日本),规范化的信使rna表达水平核糖体蛋白L13A (RPL13A)。引物序列(5′,3′)表中列出2。

表2
引物序列T7核酸内切酶分析和定量rt - pcr。
2.5。免疫荧光分析

培养细胞固定在4%多聚甲醛在4°C, 10分钟permeabilized Triton和50毫米NH为0.2%4Cl。固定样本使用阻塞(Nacalai Tesque,京都,日本)为30分钟RT和孵化anti-MYOGENIN(稀释1:100年,圣克鲁斯生物技术,加利福尼亚,美国),anti-MYOSIN重链(MYHC稀释1:200年,圣克鲁斯生物技术,加利福尼亚,美国),反-运输- 1 - 81(稀释1:200年,细胞信号技术,麻萨诸塞州,美国),anti-SSEA4(稀释1:200年,细胞信号技术,麻萨诸塞州,美国),anti-OCT4A(稀释1:200年,细胞信号技术,麻萨诸塞州,美国),和anti-NANOG(稀释1:200年,细胞信号技术,麻萨诸塞州,美国)抗体在5%的阻塞一个在PBS Tween20 0.1% (PBST)一夜之间在4°C。与PBST三洗后,细胞与Alexa488孵化,Alexa594或Alexa647-conjugated二级抗体(稀释1:500年,分子探针,尤金,美国)。细胞被PBST三次清洗和安装在SlowFade钻石不变色与DAPI mountant(美国尤金分子探针)。荧光图像采集软件的BZ-X700(日本基恩士,大阪,日本)。培养细胞从一式三份的实验进行了分析。

3所示。结果

3.1。人类MYOGENIN基因组DNA与CRISPR / Cas9系统编辑

生成MYOG臀部突变细胞的双链断裂MYOGexon1包括编码序列(图1(a)),我们选择了几个序列绑定到单个指导RNA为目标核酸酶Cas9从CRISPRdirect网站作为候选人(http://crispr.dbcls.jp、表1)[24)和结扎成创建pX458 - pX458向量hMYOG+ 189 -编辑矢量,目标一个独特的20 bp序列hMYOGexon1(位置170 - 192;accaccaggctacgagcgga,图1(b))。双链断裂的影响hMYOG基因组序列被heteroduplex评价PCR片段,包括序列pX458——的目标hMYOG+ 189 -编辑矢量,监控在HEK293细胞和T7核酸内切酶(T7EI)。酶消化PCR乐队500个基点和300个基点T7EI-treated基因组DNA(图中观察到1(c))。数据表明,核酸酶Cas9和单指南RNA的目标hMYOGexon1的基因组序列。的表达MYOG开始在区分肌原性的细胞。检查的数量MYOG记录了从这个Cas9构造,永生的Hu5 / KD3,人类的成肌细胞,转染pX458——有或没有hMYOG+ 189矢量在中等分化和2%的马血清48小时。的转录水平MYOG在分化Hu5 / KD3减毒细胞(图1(d))。这个CRISPR / Cas9构造hMYOG序列可能不仅是有效的,因为它的基因组双链打破敲门了MYOG表达,但也会影响剩下的MYOG转录水平。

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(d)
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图1
单一引导序列的影响hMYOGENINCRISPR / Cas9系统。的示意图表示MYOG外显子和内含子。候选人Cas9为目标的位置MYOGexon1 pX458 - (a)hMYOG+ 189,驾驶单指导RNA结合的构造MYOGexon1和bicistronic Cas9和GFP的表达(b)。T7核酸内切酶我化验Cas9-mediated劈理(箭头,500个基点和300个基点)琼脂糖凝胶,显示类似的修改有针对性的人类MYOGHEK293T细胞基因组片段(c)的相对表达MYOG在人类成肌细胞细胞转染有或没有Hu5-immortalized pX458 -hMYOG+ 189向量。所有误差表明±SEM ( )。
3.2。一代的MYOGENIN细胞突变的臀部

为了生成MYOG臀部突变细胞,我们用臀部细胞携带MYOD1表达式构造与阿霉素诱导激活肌原性的项目(图2(一个))[21]。扩大了“诱导多能性”细胞SNL feeder-coated板电穿孔后pX458 -hMYOG+ 189矢量48小时,GFP-positive细胞细胞排序(收集的数据2 (b)和2 (c))。这些细胞被镀成殖民地分别拿起。每个克隆筛选进行进一步的分析。

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图2
一代的hMYOGENIN臀部细胞突变。的图解模型诱导肌原性的细胞来自臀部细胞的过度MYOD1标有mCherry(红色)后管理阿霉素(a)。课程的时间识别的流程图MYOG突变的臀部细胞(b)。流式细胞仪分析孤立臀部细胞后的引入pX458 -hMYOG+ 189 (c)向量。基因组序列数据在该地区的目标pX458 -hMYOG+ 189。5 bp删除的克隆数28和1 bp的插入克隆数C3(虚线,(d))。建立了臀部细胞和未分化的多能细胞标记,应用anti-SSEA4在左面板(绿色),anti-OCT3/4在左面板(红色),反- tra1 - 80在右面板(绿色),和anti-NANOG右面板中(红色)抗体。核沾染了4′6-diamidino-2-phenylindole (DAPI,蓝色)。酒吧,100μm (e),分化的细胞肌原性的强力霉素治疗7天后与anti-MYOG应用n端(n的项,红色)和糖(c、绿色)抗体。核沾染了4′6-diamidino-2-phenylindole (DAPI,蓝色)。酒吧,100μ在(f)(上)。假定的MYOG蛋白质结构在野生型(MYOGWT)和突变细胞(MYOG傻瓜)(低(f))。

我们能够确定25个克隆,缺乏野生型MYOG序列(野生型:19.4%,杂合子;64.5%,比如;和16.1%,总克隆的筛选 )通过检查在目标基因序列MYOG地区。选择克隆数量28或克隆号C3被证实biallelic目标移码突变,5 bp的删除,和一个额外的1 bp的集成hMYOG-sgRNA和Cas9-targeted区域如图2 (d)。这些数据表明,这种针对CRISPR / Cas9系统充分有效地击倒两个等位基因MYOG直接通过引入帧频失调的突变(较低的图像,如图2 (f))。MYOG臀部突变细胞(克隆数量28)与未分化的多能标记,应用anti-SSEA4, anti-OCT3/4,反- tra1 - 80和anti-NANOG抗体,评价未分化的多能性状态,积极发现了这些标记MYOG突变的臀部细胞(图2 (e))。确认截断MYOG蛋白质的翻译从这些突变序列,从Dox-treated臀部肌原性的细胞分化细胞7天与人类抗体immunoreacted MYOG n端和糖基相对因为MYOGmrna转录有额外的终止密码子,它的结果MYOG基因打靶。肌原性的细胞来源于野生型臀部被这两个MYOG抗体检测;然而,糖基MYOG没有检测到MYOG突变的臀部细胞(图2 (f))。

3.3。骨胳肌原性的分化MYOD1感应

调查人类MYOG函数在肌原性的分化,MYOD1臀部细胞中过表达了管理阿霉素如图3(一个)。MYOD1阿霉素治疗后表情模仿bicistronic mCherry荧光(图3 (b))。诱导肌原性的细胞来自臀部细胞体外培养分化的条件下,应用MYHC表达式作为一个指示器的能力分化成骨骼肌纤维(图3 (c))。尽管成肌细胞融合的速度MYOG臀部突变细胞克隆数量28略低于野生型(图3 (d)),终端分化是相似的。

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图3
在骨骼肌肌原性的分化细胞来源于MYOGENIN缺乏臀部克隆28细胞数量。肌原性的分化时间进程的流程图(a)形态变化和mCherry荧光表达与强力霉素治疗后(b)。分化肌原性的细胞来自于臀部有或没有MYOG由阿霉素治疗7天与anti-MYOSIN应用重链抗体(MYHC、绿色)。核沾染了4′6-diamidino-2-phenylindole (DAPI,蓝色)。酒吧,100μm (c), DAPI-positive mono的比率或多个细胞核染色出现在单一MYHC-positive肌纤维来自野生型或MYOG突变的臀部细胞(d)。相对的成绩单肌原性的监管因素的表达,MYOG(e)、内源性MYOD1(f)MRF4(g),在差异化的肌原性的细胞用强力霉素治疗5,7,9天。所有误差表明±SEM ( )。 值是由一个决定t以及从双尾分布。 。

进一步描述这些肌原性的细胞的分化,RNA表达定量rt - pcr的肌原性的因素进行了分析。的成绩单MYOG是表达下调,如图1(d)与未知的机制;然而,其他肌原性的因素,特别是成绩单的MYOD1或MRF4条件下,调节MYOG在人类肌原性的细胞突变(数据吗3 (e)- - - - - -3 (g))。

3.4。通过中胚层分化体外骨骼肌分化

瞬态超表达的MYOD1可能克服MYOG不足的影响,因为虚高MYOD1可能补偿的失活MYOG基因在人类肌原性的细胞。为了避免过度MYOD1水平,肌原性的细胞来自中胚层诱导体细胞来源于臀部细胞克隆数量28日,没有政府的强力霉素,如图4(一)。

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(e)
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图4
从中层前身来源于肌原性的分化MYOGENIN缺乏臀部克隆28细胞数量。中胚层和肌原性的分化时间进程的流程图臀部肌肉细胞来源于细胞(a)。流式细胞仪分析DLL1-positive中胚层细胞来源于臀部细胞(b),总额的相对表现MYOD1和内生MYOD1(c),分化肌原性的细胞来源于中胚层的细胞有或没有MYOG 60天与anti-MYOSIN应用重链抗体(MYHC、绿色)。核沾染了4′6-diamidino-2-phenylindole (DAPI,蓝色)。酒吧,100μm (d)。相对的表情MYOD1和MRF4成绩单在野生型或MYOG -肌原性的突变细胞来源于中胚层的细胞(e)。所有误差表明±SEM ( )。 值是由一个决定t以及从双尾分布。 , 。

中胚层诱导的百分比,DLL1 [22)通过流式细胞仪分析显示,类似的不考虑MYOG突变(图4 (b))。在肌原性的细胞来源于中胚层的前兆,总数MYOD1成绩单没有积累,Dox-treated臀部细胞相比,包括内生的低水平MYOD1表达式(图4 (c))。在这种情况下,MYHC-positive分化肌纤维源自MYOG-positive和MYOG-negative臀部细胞识别类似的程度(图4 (d))。分析来自中胚层细胞肌原性的分化潜能,记录在这些细胞肌原性的监管因素的监控。的水平MYOG成绩单是减毒;然而,MYOD1或MRF4在野生型和成绩单没有多少改变MYOG突变肌原性的细胞,调节MYOG突变细胞在细胞培养期间(图4 (e))。

4所示。讨论

在这里,我们报告的生成MYOGENIN缺乏臀部细胞和对人类的影响肌原性的分化使用CRISPR / Cas9技术。这种细菌系统已成为一个有效的工具,通过基因打靶nonhomologous结束加入(NHEJ);然而,据报道为基因组序列的精确编辑的效率很低。在这项研究中,我们选择的顺序MYOGexon1-targeted sgRNA Cas9复杂作为一个独特的基因组序列,有针对性MYOG由T7EI化验不效率高;然而,在臀部细胞基因组编辑的结果显示,敲出的效率高MYOG在杂合的基因,包括超过80%的效率。这不是改变了额外的叠氮胸苷,已报增加效率NHEJ [25)(没有显示)。

虽然基因敲除小鼠Myog差异化的骨骼肌纤维表现出一个致命的缺陷,然而剩余肌纤维Myog突变体(12,13]。可能在体内和体外的情况之间的差异Myog突变体的选择可以解释一个特定的路线从Myog-independent血统体外肌肉细胞分化,可能由MyoD1和Mrf4因为Mrf4可以驱动控制早期肌原性的分化在肌刀Myog蛋白质不是最初积累(10,14]。或者,可能存在一个阈值水平的总要求在成肌细胞肌原性的监管因素触发终端分化程序。我们现在还没有观察到任何缺陷的肌原性的分化MYOG突变细胞在两种不同的情况下,过度的MYOD1或通过介质条件,促进中胚层细胞向肌发生发展。不仅没有突变的臀部细胞MYOG而且其他肌原性的因素,MYF5,MYOD1,MRF4,将需要进一步的分析来识别人类肌原性的监管因素的关系,因为我们观察到upregulation其他肌原性的因素MYOG突变细胞可能补偿MYOG函数体外,和淘汰赛的三倍Myog,Mrf4,Myod1或Myf5,Myod1,Mrf4表现出晚期分化成肌纤维受损的能力,不是淘汰赛的两倍Myod1和Mrf4(8,10]。此外,还有其他可能性,通过骨骼肌Myog体内影响系统性因素(13),这对肌纤维形成反馈。

总的来说,这些结果说明MYOG变异人类“诱导多能性”细胞肌原性的分化能力,可以形成终末分化肌纤维,分化的条件下,对比结果对发展中鼠标Myog突变体。

的利益冲突

不存在竞争的经济利益。

确认

这项研究支持了日本医疗机构的补助金研发、工程技术开发、开发耐火肌肉疾病的细胞移植的方法,和AMED-CREST(艾湄湾)和中臣纪念基金会的资助。作者感谢Hu5 / KD3-immortalized人类肌原性的细胞提供的博士Naohiro桥本(国家老年与老年学中心、Ōbu、日本)和建议是细胞培养的维护Tomoko Horikiri。