人脂肪干细胞向肌成纤维细胞分化的高敏感性C. aspersa.蛋提取物

抽象的

介绍．已经提出了使用脂肪衍生的干细胞（ADSC）的再生治疗在治疗皮肤老化中。肌纤维细胞在受损皮肤细胞外基质的组织中起着相关作用。从软体动物的卵衍生自然萃取物cryptomphalusspasersa（e-caf）似乎在皮肤修复上发挥作用。我们研究了E-CAF在ADSC的分化中的潜在影响。材料和方法．在没有或有e-CAF(50和200)的情况下培养ADSCμg/mL)， 24小时7天。采用细胞实时检测、形态学、免疫荧光和RT-PCR技术评价细胞培养和表达αSMA, I型胶原，和肌弹力蛋白。结果．e-CAF诱导ADSC生长速率从培养24小时到培养7天显著降低。e-CAF还诱导了培养的ADSC的更大尺寸、更高水平的细胞质折射率和复杂性，以及更多的多面体形态变化。蛋白和mRNA的表达αe- cafc培养的ADSC中SMA显著升高。结论．e-CAF促进ADSC向肌成纤维细胞分化，应该被认为是一种潜在的预防和治疗皮肤老化的药物。

1.介绍

衰老是一个复杂的生理过程，它会导致包括皮肤在内的所有人体组织的功能逐步下降。在老化的过程中，皮肤受到许多因素或条件的影响，这些因素一起被称为暴露。皮肤暴露体包括外部因素和内部因素及其相互作用，以及人体对这些因素的反应，从而导致皮肤老化的生物学和临床迹象[1］.在内部因素中，遗传学、新陈代谢和激素应该被强调，而主要的环境因素包括太阳辐射和污染，这些因素加起来触发光老化[2，3.］.

老化皮肤的临床症状表现为皱纹、真皮萎缩和伤口愈合受损，部分原因是细胞外基质(ECM)的组织和重塑过程的改变。它的主要成分胶原蛋白和弹性蛋白为组织提供强度和弹性。它们的退化在老化过程中加剧，导致结构完整性丧失和修复能力下降[2，4］.

皮肤受伤后，激活修复机制，包括转化生长因子-β（TGFβ)的表达，诱导成纤维细胞增殖和向创面迁移，并通过增加表达向肌成纤维细胞分化α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA），促进新型ECM组件的分泌和组装，以期在成熟期间应对组织收缩性的负责[5，6］.在衰老过程中，ECM的丢失破坏了这一过程，并损害了皮肤成功确保疤痕形成和伤口愈合的能力[7- - - - - -9］.

近年来，人们对皮肤内源性再生特性的新疗法进行了广泛的研究[10特别有希望的是聚焦在组织工程和再生医学领域的那些。脂肪衍生的干细胞（ADSC）作为特别相关的细胞群，以用于这些目的。它们的丰富，可访问性和最小的创伤性收获，以及它们分为几个细胞谱系的能力，使ADSC成为高级治疗用途的伟大候选者[11- - - - - -14］.ADSC可以通过分泌多种生长因子，包括胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子- 1 (TGF-)，以旁分泌的方式发挥作用β1)、肝细胞生长因子(HGF) [15，16］.此外，除了这些细胞分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞谱系的潜力外，一些研究已经表明它们有能力转化为皮肤修复细胞，如内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞[15- - - - - -19］.通过分泌生长因子和皮肤成纤维细胞的激活，ADSC对人体皮肤具有伤口愈合和抗氧化作用。因此，ADSC及其分泌因子在光电造成的皱纹中有效。抗涂膜效应主要通过降低UVB诱导的细胞凋亡和刺激人皮肤成纤维细胞的胶原蛋白合成介导的介导[12- - - - - -14］.然而，已有研究表明，年龄可引起ADSC功能和分化能力的改变[20.］.因此，使用能够衰减这些效果的药剂可用于治疗皮肤衰老。

在这方面，天然成分来源于软体动物cryptomphalusspasersa已开发并评估为皮肤组织的再生剂[16- - - - - -20.］.其分泌(SCA)已被证明具有抗氧化剂和皮肤再生特性，保护角质形成细胞和成纤维细胞的存活和ECM动态，同时促进其在伤口愈合中的有丝分裂和运动活性[21- - - - - -27］.此外，一种新颖的成分，从卵的提取物C. aspersa.(e-CAF)是近年来发展起来的，在治疗皮肤老化方面显示出良好的效果。在最近一项使用人角质形成细胞(HaCaT)、人真皮成纤维细胞(HDF)和衰老成纤维细胞(SHDF)的研究中，已经证明e-CAF能够诱导这些细胞系的迁移和ECM的产生，同时改善细胞骨架组织。此外，e-CAF显示出抗衰老的特性，减少了年龄相关标志物的表达，并防止了紫外线辐射导致的细胞死亡[28］.此外，e-CAF已显示可促进人类毛发真皮乳头细胞(HDDPCs)的迁移，也增加了它们的迁移行为，并调节粘附分子的表达，表明其可能在皮肤再生和预防组织损伤和皮肤老化方面发挥作用[29］.

在目前的工作中，已经评估了E-CAF对人ADSC的体外影响。首先，来自软体动物蛋卵的自然提取物的细胞增殖和形态cryptomphalusspasersa，E-CAF，被测出来了。为此，使用实时细胞测定（RTCA）来测定E-CAF的能力，将ADSC生长和大小从24小时到7天的培养物进行调节。同样，提取物显示了生物引发活动的迹象。随后对肌纤维细胞标记的分析显示治疗ADSC中该细胞类型的增加，指向E-CAF对该细胞谱的感应效果。对于这种确定，所选标记表达αSMA是一种通常用作肌成纤维细胞标记物的细胞骨架蛋白。提示e-CAF可能在ADSC分化过程中起到调节作用。由于该活性具有组织修复和防止衰老的能力，可被认为是一种潜在的光老化剂。

2.材料和方法

２.１.细胞培养

人类ADSC购自商业供应商(StemPro®，Gibco®，Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)，并在MesenPro RS™培养基(Gibco)中培养，在37℃、5% CO的湿化培养箱中₂的气氛。细胞保持亚融合状态，必要时进行传代培养。所有的实验都是用第二代到第四代的细胞进行的。

２.２.成分

e-CAF (Industrial Farmacéutica Cantabria, S.A.， Madrid, Spain)，一种从鸡蛋中提取的成分C. aspersa.，如Espada等人所述制备[28］.简单地说，收集菌种，在低压下漂洗，浸泡在盐溶液中，并保持在2°C到8°C之间。然后，通过筛网过滤和裂解得到完整的螺卵。e-CAF在DMEM (Gibco)中均质，通过0.22过滤μM过滤器以产生储备溶液，并通过Bradford测量总蛋白质浓度，如其他地方所述。通过将4/5的MesenPro Rs与1/5的储备溶液和/或基础DMEM混合到50的最终浓度来制备治疗培养基 μg/mL (e- caf50组)，200μg/mL (e- caf200组)μg / ml（Ctrl组）。属于每个研究组的细胞在相应的培养基中培养7天，在第4天接受细胞培养基变化。

２.３.实时细胞检测(RTCA)和形态学研究

使用无标签、基于阻抗的RTCA系统(xCELLigence RTCA SP，罗氏诊断公司，巴塞尔，瑞士)测量不同组的生长。将ADSC以每孔2000和1000个细胞的速度分别播种在96孔e板上，并在生长培养基中维持24小时，然后切换到不同的处理培养基。随后研究细胞生长7天，直到培养物达到融合。每30分钟记录一次细胞指数(CI)，并在24小时归一化至该值。对于各组和细胞浓度，计算处理开始至实验结束曲线的平均斜率。使用AxioCam ICc1数码相机(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)的AxioCam 40C倒置显微镜，在常规透明96孔板上制备重复平行板，以便在实验期间对培养物进行可视化和摄影。进行了三个独立的实验，每个实验有三个重复。

为了进一步评估细胞的形态和尺寸，将ADSC接种到无菌12mm直径的玻璃盖玻片上并如上所述培养。用4％多聚甲醛固定细胞，进行标准血红素 - 曙红染色并在配备有Axiocam HRC数码相机（Carl Zeiss）的替代轴突显微镜中。使用imagej软件（NIH，Bethesda，MD，USA），在九个随机高倍率场（10个单元/领域）中测量每组三种不同实验中的细胞的平均区域。

２.４.免疫荧光

的存在α通过免疫荧光标记检测和量化SMA，肌纤维细胞标记物。固定细胞用0.1％Triton X-100透析化，用3％牛血清白蛋白封闭，并与抗 -αSMA单克隆抗体（克隆1A4，Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo，USA）。使用FITC标记的抗小鼠抗体（Sigma-Aldrich）用作二抗，并且用DAPI染色核，如其他地方所述。包括阴性对照，暴露于3％BSA而不是一抗原发性抗体。使用Leica TCS SP5共聚焦显微镜（Leica Microsystems，Wetzlar，德国）和百分比观察细胞α3个独立实验的sma阳性细胞在9个随机高倍镜下进行评估。

2.5。实时PCR

使用TrizoL（Thermo Fisher Scientific）通过标准胍硫氰酸盐 - 苯酚 - 苯酚 - 氯仿萃取程序与培养物中分离出总RNA。通过沉淀从水相中回收RNA，通过在纳米DID-1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）中测量260/280和260/230nm的光密度来评估其量和纯度。

通过逆转录（RT）从200ng的总RNA合成互补DNA和M-MLV逆转录酶（Thermo Fisher Scientific）。使用相对标准曲线方法，在步骤Plus™系统（Thermo Fisher Scientific）中，通过实时PCR量化cDNA。使用以下引物：αSMA（FWD 5-AGC GTG GCT ATT CCT TCG TT-3和牧师5-CCC ATC AGG CAA CTC GTA ACT-3)， I型胶原蛋白(Fwd 5-CCA TGT GAA att GTC TCC CA-3和牧师5-ggg gca aga cag tga TTG aa-3)，对流层弹性蛋白(Fwd 5-GTG TAT ACC CAG GTG GCG TG-3和牧师5-cga act TTG CTG CTT tag-3)和GAPDH (Fwd 5-gga agg tga agg TCG gag tca-3和牧师5-GTC ATT GAT GGC AAC AAT ATC CAC T-3）.将样品在95℃下进行10分钟的初始阶段，然后在95℃下在95℃下的40个循环，30秒，59.5℃（TE），59.9℃（αSMA）或60.0°C（COL-1，GAPDH）和72°C的1分钟。进行了四个独立的实验，每个实验均以三份酸盐进行，包括每次反应中的无模板控制。GAPDH用作参考基因。

2.6。统计分析

采用统计软件GraphPad Prism 5 (GraphPad software Inc.， La Jolla, CA, USA)对数据进行分析。各组间比较采用方差分析，然后采用Tukey-Kramer检验。非高斯数据集(RT-PCR)经对数变换归一化后进行统计检验。数据表示为平均值±平均值标准误差(SEM)。显著性水平设为 ， , ．

3.结果

３.１.e-CAF调节ADSC的增长和大小

首先，我们调查了E-CAF对ADSC的生长的影响。RTCA实验表明，向培养基中添加E-CAF引起了ADSC的生长速率显着降低。在两种浓度下观察到E-CAF对ADSC培养物的这种影响（50 μg / ml和200 μg/mL)，以及两种不同密度的细胞播种。e-CAF显著的抑制作用在添加到培养物24小时后就获得了专利，并在接下来的7天内保持(图)1(一)- - - - - -1 (d)）.第4天观测曲线的扰动是由介质变化过程引起的。对试验间隔所对应的斜率进行分析发现，处理组与对照组之间存在显著差异，未处理ADSC曲线的值较大。

接下来，我们调查了E-CAF是否对ADSC的形态有任何影响。在培养基中存在E-CAF在培养基中诱导两种浓度细胞的形态学变化。E-CAF培养细胞在7天内呈现更大的尺寸和更多层形状（图1 (e)）.自第5天（数据未显示）以来，观察到ADSC形态的变化。此外，在7天的培养物中，用E-CAF处理的ADSC显示出更高水平的细胞质副作用和复杂性，表明存在更发达的细胞骨架。相比之下，在培养基中培养的Adsc主要显示出纺锤形，更多的细胞，覆盖近汇合的培养表面。

我们还在培养7天后，在e-CAF存在或不存在的情况下对ADSC培养物进行苏木精-伊红染色(图)2）.没有证据表明在ADSC培养中存在任何浓度的e-CAF会增加细胞死亡。两种浓度的e-CAF处理后的ADSC细胞的平均大小(以细胞面积衡量)均高于对照组。由于RTCA显示了对照培养的更高的生长速度，且该组细胞明显较小，这些结果表明e-CAF对ADSC具有双重作用，既减少了它们的增殖，又促进了细胞体积的增加。

3.2。e-caf增加了比例αSMA-Positive ADSC

接下来，我们通过免疫荧光检测e-CAF对ADSC向肌成纤维细胞分化的影响αSMA，一种常用为肌纤维细胞标记物的细胞骨架蛋白（图3.）.阳性细胞比例的量化显示各组间有显著性差异。对照组也有阳性细胞(32.76%±4.11%)，但e-CAF-50组(48.59%±3.62%)和e-CAF-200组(49.80%±4.41%)的阳性细胞均高于对照组(32.76%±4.11%)，差异无统计学意义。

此外，我们还研究了表达ADSC的形态αSMA。在经e- cafe处理和未经e- cafe处理的ADSC中，αsma阳性细胞显示排列整齐的细胞骨架微丝。还观察到这些细胞往往具有更广泛的细胞质，经常并发多面体形状。

３．3.e-CAF上调表达αSMA在ADSC

为了进一步评估E-CAF诱导ADSC分化的扩展，MRNA水平肌纤维细胞标记，例如αSMA，I型胶原蛋白和Tropoelastin，通过在存在和不存在E-CAF的ADSC中的Adsc中的实时定量PCR来测量7天（图4）.表达α与对照组相比，SMA显示治疗组的增加，达到E-CAF-200组中的统计学意义。在细胞外基质蛋白I型胶原蛋白和Tropoelastin的表达中没有观察到显着差异，尽管在这两种情况下，E-CAF-200组表现出明显的趋势，以表达这些蛋白质的更高平均值而不是对照组。

4.讨论

老化导致所有组织和器官的结构和生理学的变化。然而，作为生物体的最外部，皮肤暴露于加重该过程的额外侵略，从而导致光电的临床条件[8］.已经进行了广泛的研究，旨在找到合适的药剂，能够克服对皮肤的这些相关的效果。为此，许多天然产物已被评估为重复剂，主要是由于它们的抗氧化和抗炎特性[30.，31］.在这项工作中，从软体动物的卵中提取的一种提取物cryptomphalusspasersa(e-CAF)已在人类ADSC培养物上进行了测试，以评估其对该细胞系的影响，该细胞系可能产生具有皮肤表型的细胞。

用RTCA法测定e-CAF培养物的生长情况。这项新技术基于电极覆盖的细胞培养电子板中登记的阻抗变化，允许无创和无标记的培养监测[32］.该系统已被证明是评估不同细胞培养的增殖、迁移和侵袭的强大工具[33，34]，在测量不同物质的细胞毒性作用[32，35]，以及评估干细胞活力和细胞治疗的最佳使用时间[36］.在我们的研究中，两种不同浓度的e-CAF使ADSC增殖率降低，但未观察到任何细胞毒性作用。相反，复制板的监测显示，与对照细胞相比，e-CAF组的细胞分化过程具有形态学变化，这些观察结果也通过细胞大小的量化得到了证实。由于在RTCA实验中，细胞增殖和细胞生长都有助于CI的增加，处理过的细胞更大的尺寸表明e-CAF和对照组在增殖率上的差异甚至比记录的更大。这些结果与Alameda等人的发现一致[29结果发现，在e-CAF浓度相近的情况下(50和200)，人头发真皮乳头干细胞(HHDPCs)的增殖显著下降μg / ml）。

观察到改变ADSC的主轴形特征的趋势[15通过具有突出的细胞骨架的多面体，增殖率降低提出了E-CAF赞成ADSC对肌纤维细胞谱系的可能性的可能性。因此，我们检查了存在的存在αSMA，最广泛使用的标记用于鉴定肌纤维细胞[19，37在我们的细胞里。各组均有阳性细胞出现，但e-CAF处理显著增加了阳性细胞百分率αsma阳性细胞与未处理细胞的比较，证实了我们的假设。因此，ADSC以前被报道为能够分化为αsma表达细胞，包括血管平滑肌细胞[38]和肌成纤维细胞，它们在调节收缩和迁移表型方面也表现出高可塑性[18］.这种可塑性可以部分解释胶原I型和Tropoelastin mRNA水平中观察到的轻度差异，因为ECM蛋白的表达在收缩肌纤维细胞中大大上调，主要由TGF诱导β1 (18］.此外，这些培养缺乏许多自然存在的刺激体内并引起肌成纤维细胞分泌ECM，如机械力，特别是TGF-β1和它与矩阵中许多成分的相互作用，这极大地调节了它们的作用[37，39，40］.然而，必须指出的是，这三个被研究的基因在e- caf200组中表达水平最高，这可能表明在浓度较高的组中分化程度更高。e-CAF促进ADSC向肌成纤维细胞分化的作用并不局限于这些干细胞。研究还表明，e-CAF可使HHDPCs向肌成纤维细胞(一种特殊的成纤维细胞表型)的主要皮肤细胞谱系分化[29］.用E-CAF处理观察到的肌纤维细胞分化促进的分子机制尚未建立，但是可以表明它可能能够模仿TGF-β1管理的效果。

衰老与成纤维细胞向肌成纤维细胞分化失败有关，同时透明质酸的生成降低[41］.肌成纤维细胞作为主要的ecm分泌细胞之一，e-CAF对肌成纤维细胞ADSC的诱导作用可能有助于皮肤老化的治疗。与此相关，最近的研究表明，e-CAF对其他皮肤细胞类型，如角化细胞和成纤维细胞也有几种促再生作用[28］.

此外，功能性干细胞单元已被描述在人类皮肤的各个层次:毛囊凸出、毛囊间表皮、真皮乳头和血管周围皮下脂肪组织。由于它们产生广泛的生长因子和其他信号分子，它们的分泌组可能有很大的用途[42］.然而，在衰老过程中，干细胞群发生了重要的变化，减少了它们的库，减弱了它们的功能，改变了它们的生态位[43- - - - - -45.]，这反过来加剧了老化过程。因此，希望能够调节干细胞活性和分化的处理的存在。

在过去的几年里，ADSC已经成为治疗皮肤老化的有希望的工具。干细胞的疗法为皮肤再生提供了巨大的潜力。ADSC显示出映射诱导胶原蛋白合成和血管生成，同时降低基质金属蛋白酶-1（MMP-1）和细胞凋亡的水平[12，13］.也有研究表明，ADSC可能在防止与衰老相关的晚期糖基化终末产物(AGEs)积累方面发挥作用[14］.由于这些干细胞的活性可以如此有益地改善皮肤老化的影响，来自血管周围皮下皮层的常驻ADSC成为抗衰老治疗的潜在靶点，如e-CAF。

5.结论

我们的结果表明，e-CAF促进ADSC向肌成纤维细胞分化，应该被认为是一种潜在的预防和治疗皮肤老化的药物。这些e-CAF对ADSC的调节作用扩展了对HHDPC分化的描述，表明e-CAF可以对多种类型的皮肤细胞发挥其活性，应该被认为是一种潜在的预防和治疗皮肤老化的药物。

披露

茱莉亚·布扬和梅尔乔·阿尔瓦雷斯-蒙共同担任这项工作的高级作者。

的利益冲突

作者宣布没有本文的研究，作者和/或出版本文的潜在利益冲突。

致谢

来自IFC（工业药房Cantabria），马德里（B2017 / BMD-3804.Mitic-CM）的授予部分支持这项工作，以及Instituto de Salud Carlos III（FIS-PI13 / 01413）。本研究中使用的E-CAF是由工业药房Cantabria，S.A的提供。

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