人类ADSC购自商业供应商(StemPro®，Gibco®，Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)，并在MesenPro RS™培养基(Gibco)中培养，在37℃、5% CO的湿化培养箱中₂大气层。将细胞保持在补算子下，并在必要时转培养。使用来自第二个通道的细胞进行所有实验。

e-caf（工业farmacéuticacantabria，s.a.，马德里，西班牙），源自鸡蛋的成分 c . aspersa，如Espada等人所述制备。[ 28.］．简言之，将卵收集在低压下漂洗，浸在盐水溶液中，并保持在2和8℃之间℃。然后，通过过滤通过筛网得到完好蜗牛产卵并裂解。电子CAF在DMEM（Gibco）中匀浆，并通过过滤0.22  μ.M个滤波器以产生原料溶液，和总蛋白浓度通过Bradford测定，如在别处所述。处理介质通过混合MesenPro RS的4/5与储备溶液和/或基底DMEM的1/5，到50的终浓度制备  μ.G / ML（E-CAF-50组），200  μ.g / ml（e-caf-200组）和0  μ.g / ml（Ctrl组）。属于每个研究组的细胞在相应的培养基中培养7天，在第4天接受细胞培养基变化。

使用无标记的阻抗的RTCA系统（Xcelligence RTCA，罗氏诊断，巴塞尔，瑞士）测量不同组的生长。在2000和1000个细胞的96孔E-平板下将ADSC接种，并在切换到不同的处理介质之前，在生长培养基中保持24小时。随后，在培养物可以达到汇合之前，研究了细胞生长7天。每30分钟记录细胞索引（CI）并将其标准化为24小时的值。对于每组和细胞浓度，计算治疗开始与实验结束之间的曲线的平均斜率。在常规透明的96孔板中制备重复的平行板，以允许在实验期间进行培养的可视化和摄影，使用AXIOVERT 40C倒的显微镜，配备AXIOCAM ICC1数码相机（Carl Zeiss，Oberkochen，德国）。进行了三个独立的实验，每种含量均含量。

为了进一步评估细胞的形态和尺寸，将ADSC接种到无菌12mm直径的玻璃盖玻片上并如上所述培养。用4％多聚甲醛固定细胞，进行标准血红素 - 曙红染色并在配备有Axiocam HRC数码相机（Carl Zeiss）的替代轴突显微镜中。使用imagej软件（NIH，Bethesda，MD，USA），在九个随机高倍率场（10个单元/领域）中测量每组三种不同实验中的细胞的平均区域。

的存在 α.SMA是肌成纤维细胞的标记物，采用免疫荧光标记法检测并定量。用0.1% Triton X-100渗透固定细胞，用3%牛血清白蛋白阻断固定细胞，用抗 α.SMA单克隆抗体(克隆1A4, Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO, USA)。使用fitc标记的抗小鼠抗体(Sigma-Aldrich)作为二抗，细胞核用DAPI进行反染色。阴性对照，暴露于3%的牛血清白蛋白而不是一抗。使用Leica TCS SP5共聚焦显微镜(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)观察细胞 α.3个独立实验的sma阳性细胞在9个随机高倍镜下进行评估。

总RNA从使用TRIzol（赛默飞世尔科技）通过标准的硫氰酸胍 - 苯酚 - 氯仿提取方法的培养物中分离。RNA was recovered from the aqueous phase by precipitation, and its quantity and purity were assessed by measuring optical density at 260/280 and 260/230 nm in a NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific).

用oligo-dT引物和M-MLV逆转录酶(Thermo Fisher Scientific)进行逆转录(RT)，从200 ng总RNA中合成互补DNA。在StepOnePlus™系统(Thermo Fisher Scientific)中使用相对标准曲线法，通过实时PCR对cDNA进行定量。使用的引物如下: α.SMA (Fwd 5 ' -agc GTG GCT att CCT TCG tt-3 ' 和5. ' -ccc atc agg caa CTC gta act-3 ' )， I型胶原蛋白(Fwd 5 ' -cca TGT gaa att GTC TCC ca-3 ' 和5. ' -ggg gca aga cag tga TTG aa-3 ' )，对流层弹性蛋白(Fwd 5 ' -gtg tat acc cag ' 和5. ' -cga act TTG CTG CTT tag-3 ' ）和GAPDH（FWD 5 ' -gga agg tga agg TCG gag tca-3 ' 和5. ' -gtc att gat GGC aac aat atc cac t-3 ' ）.样品在95°C下进行10分钟的初始阶段，随后在95°C下进行15 s的40个循环，在59.5°C (TE)下进行30 s，在59.9°C ( α.SMA)或60.0°C (Col-I, GAPDH)，并在72°C下1分钟。进行了4个独立的实验，每个实验进行3个重复，每个反应包括一个无模板的对照。GAPDH作为内参基因。

采用统计软件GraphPad Prism 5 (GraphPad software Inc.， La Jolla, CA, USA)对数据进行分析。各组间比较采用方差分析，然后采用Tukey-Kramer检验。非高斯数据集(RT-PCR)经对数变换归一化后进行统计检验。数据表示为平均值±平均值标准误差(SEM)。显著性水平设为 ∗ P. ≤ ０．０５ 那 ∗ ∗ P. ≤ 0.01 ， 和 ∗ ∗ ∗ P. ≤ ０．００１ ．

首先，我们研究了e-CAF对ADSC生长的影响。RTCA实验表明，在培养基中添加e-CAF可显著降低ADSC的生长速率。e-CAF在两种浓度下(50 μ.克/毫升和200年 μ.g / ml），以及两种不同的细胞播种密度。在向培养物中加入产物后24小时，E-CAF的显着抑制作用在培养物中得到专利，并保持在研究后7天（图 1（a）- 1（d））.在第4天观察到的曲线中的紊乱是由中等变化程序引起的。对应于实验间隔对应的斜率的分析表明，治疗组和对照组之间的显着差异，在未处理的ADSC曲线的情况下具有更大的值。

接下来，我们研究了E-CAF是否对ADSC的形态的任何影响。电子CAF的在培养基中存在下，在两种浓度诱导细胞中的形态学变化。电子CAF-培养的细胞呈现更大的尺寸和在第7天的更多面体形状（图 1（e））.自第5天（数据未显示）以来，观察到ADSC形态的变化。此外，在7天的培养物中，用E-CAF处理的ADSC显示出更高水平的细胞质副作用和复杂性，表明存在更发达的细胞骨架。相比之下，在培养基中培养的Adsc主要显示出纺锤形，更多的细胞，覆盖近汇合的培养表面。

我们还在培养7天后，在e-CAF存在或不存在的情况下对ADSC培养物进行苏木精-伊红染色(图) 2）.由于E-CAF的存在，没有任何浓度，没有证据表明adsc培养物中的细胞死亡增加。用两种浓度E-CAF处理的ADSC，测量为细胞面积的细胞的平均尺寸高于对照组。由于RTCA表现出更高的对照培养物的生长，并且该组的细胞显着较小，因此这些结果表明E-CAF对ADSC的双重作用，两者都降低了它们的增殖和促进细胞体积的增益。

接下来，我们通过免疫荧光检测来研究E-CAF对肌纤维细胞的分化的影响 α.SMA是一种通常用作肌成纤维细胞标记物的细胞骨架蛋白 3.）.阳性细胞比例的定量显示出治疗组的显着差异。虽然对照组也发现阳性细胞（32.76％±4.11％），但在E-CAF-50（48.59％±3.62％）和E-CAF-200（49.80％±4.41％）组中观察到较高的值，它们之间没有显着差异。

此外，我们还研究了ADSC的表达形态 α.SMA。在E-CAF处理和E-CAF-未经处理的ADSC中， α.sma阳性细胞显示排列整齐的细胞骨架微丝。还观察到这些细胞往往具有更广泛的细胞质，经常并发多面体形状。

为了进一步评估e-CAF诱导ADSC分化的范围，肌成纤维细胞标记物的mRNA水平，如 α.SMA，I型胶原，原弹性蛋白和，通过实时在ADSC定量PCR在存在和不存在的培养的e-CAF测量7天（图 4.）.的表达 α.与对照组相比，治疗组SMA增加，在e- caf200组达到统计学意义。细胞外基质蛋白I型胶原蛋白和肌弹力蛋白的表达没有显著差异，但在这两种情况下，e- cafc -200组的这些蛋白的平均值明显高于对照组。