文摘
长期大量饮酒可能导致一系列健康、社会、和行为问题。滥用酒精的人高的风险严重骨量减少,牙周疾病,危害口腔健康。然而,乙醇的作用(EtOH)在人牙髓细胞的生物学功能(dpc)是未知的。EtOH是否会影响odontoblastic分化dpc的雷帕霉素(mTOR)的机械的目标仍然是未知的。本研究的目的是调查EtOH DPC分化和矿化的影响。dpc分离和纯化人类牙科纸浆。的扩散和odontoblastic分化dpc处理EtOH随后被调查。不同剂量的EtOH与dpc cytocompatible显示。EtOH显著激活mTOR通路剂量依赖性的方式。此外,EtOH下调碱性磷酸酶活动,减毒的矿化结节形成,和抑制odontoblastic标记的表达包括高山,DSPP, DMP-1 Runx2, OCN。 Moreover, the pretreatment with rapamycin, a specific mTOR inhibitor, markedly reversed the EtOH-induced odontoblastic differentiation and cell mineralization. Our findings show for the first time that EtOH can suppress DPC differentiation and mineralization in a mTOR-dependent manner, indicating that EtOH may be involved in negatively regulating the dental pulp repair.
1。介绍
酒在世界各地非常风靡,引起了人类几千年来参与。酒精滥用可以将一个人的健康风险的一系列疾病。据世界卫生组织统计,大量酒精饮用与许多慢性疾病相关联,包括低骨量、肝炎、和心血管疾病1]。慢性和重型饮酒是导致骨质疏松,骨形成减少,增加了骨折风险,和延迟骨折愈合(2- - - - - -4]。适度饮酒实际上可能对骨密度有适度的有利影响,尤其是绝经后妇女,尽管不是所有研究同意(5- - - - - -8]。然而,每天饮酒三个或更多的饮料是不利于骨骼健康9]。最近的实验证据表明,哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)信号可能导致骨体内平衡的维护和间充质干细胞的分化10,11]。
dpc拥有多功能分化潜力,形成dentin-pulp-like复合物的能力在生活。牙髓时面对创伤,微生物或化学物质,大量炎性细胞因子释放(12]。这些侮辱可以刺激底层祖浆细胞分化成成(13),能够分泌牙本质基质蛋白的修缮的牙质生成(14]。成分泌胶原和noncollagenous蛋白质,如I型胶原蛋白、骨桥蛋白、牙本质基质蛋白1 (DMP1)和牙质sialophosphoprotein (DSPP),这是特殊的生物标记成牙质细胞/ osteoblast-like dpc的分化15,16]。研究表明,多种信号通路参与牙髓细胞分化的调节,如BMP, Wnt和Notch信号(17- - - - - -19]。然而,酒精的影响odontoblastic人牙髓细胞的分化(dpc)仍不清楚。
因此,本研究的目的是探讨乙醇(EtOH)增殖的影响和dpc odontoblastic分化。mTOR信号的作用EtOH-mediated odontoblastic分化也被调查。这项研究的结果将揭示酒精消费的作用对人牙髓细胞的健康,在组织修复和再生的能力。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
dpc分离和特征如前所述20.,21]。牙髓组织从外植体获得临床健康牙齿的纸浆从成人第三磨牙,从个人经历拔牙矫正治疗。程序的机构审查委员会批准的马里兰大学巴尔的摩。解决方案中的果肉组织消化3毫克/毫升胶原酶I型(卫氏物化学,不动产,新泽西,美国)和4毫克/毫升dispase(美国勃林格曼海姆,印第安纳波利斯)1 h在37°C。在目前的研究中,dpc被α修改鹰的培养基培养(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)补充10%胎牛血清(FCS;表达载体),10毫米L-ascorbic 2-phosphate酸(AA)、2毫米L-glutamate,青霉素100单位/毫升和100μg / mL链霉素在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2和95%的空气。当细胞达到80%汇合,他们收获使用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)(美国Gibco,卡尔斯巴德,CA)和亚文化的比率1:3。第四段dpc被用于以下实验。
2.2。细胞生存能力
dpc被播种在24-well板密度3×104细胞/。细胞被染色的生活/死可行性分析工具(技术)在文化1、7、14 d如前所述[22]。细胞用PBS,其次是孵化染料。活细胞被染绿了2毫米钙黄绿素和死细胞被标记成红色和4毫米ethidium homodimer-1,他们检查使用显微数字化(Eclipse TE2000-S,尼康,梅尔维尔,纽约)。活细胞和活细胞密度的百分比计算(如前所述)(21]。三个随机部分为每个样本进行了分析。
2.3。细胞增殖检测
细胞计数工具包(CCK-8 Dojindo,东京,日本)被用来评估细胞增殖1、3、5、7 d。每组四个复制用于试验。CCK-8基于WST-8反应产生橙色甲瓒染料的量与可行的细胞的数量直接相关。细胞增殖率通过吸光度测定光密度的450 nm (OD450海里)使用标(SpectraMax M5、分子器件、桑尼维尔CA)根据制造商的协议。
2.4。免疫印迹分析
细胞收获和细胞溶解裂解缓冲:20更易与L Na2阿宝4在pH值7.4,150更易与L氯化钠,特里同x - 100 1%, 1%抑肽酶,1更易与L phenymethysulfonyl氟化物,10毫克/毫升亮抑酶肽,100 L更易与氟化钠,2更易与L Na3签证官4。溶菌产物离心机在12000 rpm,持续15分钟。上层清液收集和使用Bio-Rad蛋白质测定蛋白质含量测定。SDS - page样品缓冲(10毫米Tris-HCl, pH值6.8,2% SDS、10%甘油,和0.2米德勤)被加入到溶解产物。溶菌产物被加热到100°C 8分钟,和20μ总数的g蛋白在每个加载10% sds - page凝胶。免疫印迹分析报告之前(23,24]。以下主要使用抗体:phospho-mTOR (p-mTOR)和总mTOR抗体(细胞信号技术,贝弗利,妈,美国)。
2.5。碱性磷酸酶活性
dpc和50 mM preincubated雷帕霉素然后暴露于50 mM EtOH 1小时;这个过程重复在第三天。治疗后,这些细胞被刮到冷PBS,然后用冰浴和离心机1500 g×5分钟。然后,高山活动是浮在表面的测量使用高山试验包含0.1二乙醇胺的混合物,MgCl 1毫米2对硝基苯磷酸和10毫克/毫升。孵化后30分钟37°C,反应停在氢氧化钠的加入,和吸光度测量使用标410海里(SpectraMax M5)。
2.6。逆转录酶聚合酶链反应(rt - PCR)和实时定量PCR (qPCR)
高山的表达水平,DSPP、DMP-1 Runx2, OCN mRNA SYBR绿色实时测定一(rt - pcr)如前所述25]。使用试剂盒试剂提取总RNA。定量测定RNA水平在三个独立的实验进行了一式三份。实时PCR和数据收集进行ABI棱镜7500序列检测系统。管家基因GAPDH是作为内部控制规范化不同基因的表达水平。对于每个引物组,融化曲线进行,以确保一个峰值。基因表达的数据进行了分析与△△Ct方法。使用的引物扩增的表示基因表中列出1。
2.7。冯Kossa染色
是否检测到特定的钙化冯Kossa染色(26,27]。简而言之,dpc镀在six-well盘子1×10的密度5每口井的细胞在DMEM培养补充10%的边后卫,50 mg / mL抗坏血酸,10更易与L钠β甘油磷酸盐,10 nmol / L地塞米松。dpc然后用50 mM雷帕霉素预处理前1小时50 mM EtOH。这每3 d进行重复治疗。治疗14 d后,细胞治疗与5%硝酸银溶液和暴露于紫外线照射30分钟。这个解决方案是5%的硫代硫酸钠中和后2分钟,和细胞与蒸馏水冲洗5分钟。最后,这些细胞被沾染了核快红(σ,Deisenhofen,德国)1分钟。量化矿化、钙含量测定的定量使用钙比色法测定装备后,制造商的指示。细胞层的钙含量测定14天牙原性的文化。吸光度的解决方案是使用紫外可见分光光度计在570海里。
2.8。统计分析
所有实验至少重复三次。数据表示为平均值±标准偏差(SD)。至少有三个独立的实验结果(总是执行不同的捐助者)分离出的细胞由单向方差分析比较。组之间的差异进行评估图基的期末测验。值< 0.05被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。干细胞表型标记在初级dpc的识别
dpc的表面标记使用流式细胞仪进行了分析。与其他间充质干细胞的数量(图一致1),大多数的dpc表现出强烈的表达间叶细胞表面分子标记(cd90 cd73 - 99.2%——99.6%, cd105 - 99.3%)。另一方面,dpc表现出弱的表达表面标记(cd34 - 0.2%),表明dpc包含间叶细胞的祖细胞。
3.2。DPC可行性和细胞增殖
为了评估DPC cytocompatibility EtOH治疗的影响,细胞生存能力评估使用生活/死染色后24小时的文化。代表生活/死染色图片如图2(一个)。有很多活细胞染色绿色)和一些死细胞(染成红色)。在图2 (b),活细胞的百分比在所有四组中大约90%并没有显著不同的三个剂量EtOH ( )。细胞数量显著增加从第一天到14天,最有可能由于细胞增殖(图2 (c))。EtOH高达50 mM的浓度增强细胞增殖比未经处理的dpc(图2 (d))。总的来说,这些结果表明,50 mM EtOH,用于本研究的其他实验,dpc没有细胞毒性。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。mTOR激活在应对EtOH dpc
来确定是否mTOR EtOH-mediated分化的信号通路参与了dpc, dpc EtOH 24小时处理。EtOH治疗的表达水平升高phospho-mTOR信号随着剂量增加,与对照组相比,如图3(一个)。小分子的雷帕霉素已被广泛用作选择性mTOR抑制剂(28]。我们使用雷帕霉素预防mTOR EtOH磷酸化的反应。如图3 (b),EtOH-induced phospho-mTOR与50 mM雷帕霉素预处理后表达下调。这些结果证实,在dpc EtOH触发器mTOR通路的激活证实了雷帕霉素的抑制作用。
(一)
(b)
3.4。EtOH-Induced mTOR激活碱性磷酸酶活性增加,碱性磷酸酶mRNA表达,和矿化
理解EtOH是否会影响dpc的牙原性的分化,高山活动分析。为此,高山EtOH-treated组活动显著减少,直到14天,而对照组(图4(一))。减少高山活动显著增强与雷帕霉素预处理后。高山mRNA表达的结果与高山试验(图一致4 (b))。接下来,我们调查了矿化结节形成,索引的终端odontoblastic分化,dpc后14 d孵化EtOH没有和雷帕霉素的存在。治疗的dpc EtOH矿化结节形成和钙含量降低。相反,增加钙化结节的形成(图4 (c)(图)和钙的内容4 (d))观察细胞对EtOH雷帕霉素的存在。这些结果表明,下游EtOH odontoblastic成熟的dpc的影响是通过mTOR的激活信号通路介导的。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。EtOH触发DPC Odontoblastic mTOR-Dependent地分化
进一步调查的影响EtOH dpc odontoblastic分化,细胞暴露于EtOH, 7和14 d。EtOH明显下调关键odontoblastic基因的mRNA表达包括DSPP DMP-1 Runx2, OCN信使rna。相比之下,这些基因的表达显著升高的雷帕霉素EtOH之前治疗(图5)。这些结果进一步表明,mTOR是一个关键的调节因子控制EtOH-induced odontoblastic dpc的分化。
4所示。讨论
酗酒的长期不利影响骨量相对完善的(29日]。先前的研究显示,严重慢性饮酒与各种危险因素可能导致骨骼疾病的发病机制,包括吸收不良、性腺机能减退、营养不良、缺乏维生素D,肝病,甲状旁腺功能障碍(30.]。酒精对细胞增殖的影响已经报道了各种类型的细胞(31日- - - - - -33]。我们的观察目前的研究表明,酒精治疗能够增加dpc的增殖率。此外,EtOH高达50 mM的浓度不会改变dpc的可行性。刘等人报道,治疗骨髓间充质干细胞与酒精导致细胞增殖增加由methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium溴化分析(34]。EtOH dpc的增殖的影响也是符合报告老鼠骨髓间充质干细胞。
酒精已经报告给激活mTOR在骨髓间充质细胞34]。有趣的是,这项研究显示,雷帕霉素,一种广泛使用的mTOR抑制剂(35),减毒饮酒导致的反应。这些结果表明,酒精降低osteoblast-like细胞的分化和矿化通过mTOR的激活信号。调查mTOR信号通路是否参与EtOH-induced牙原性的dpc的分化,我们评估了mTOR的激活信号EtOH-treated dpc设计条件下诱导odontoblastic分化及其在odontoblastic分化作用与mTOR的使用。在浓度梯度在我们的实验中,我们发现50 mM EtOH显著调节dpc phospho-mTOR活动。因此,这个浓度在本研究被选为后续实验。雷帕霉素也用来测试酒精mTOR磷酸化的影响。mTOR的磷酸化是部分由雷帕霉素抑制。EtOH如何调节成牙质细胞分化机制的dpc复杂,尚未完全阐明。此外,是否mTOR信号参与成牙质细胞分化的dpc尚未完全阐明。
dpc从牙髓组织代表人口的间充质干细胞/祖细胞。dpc的高增殖潜能使这个群体的细胞适合细胞再生和特别是对牙质修复。dpc dentin-like组织和骨突组织形式在活的有机体内(36]。几项研究已经表明,dentin-like组织形成与dpc (37- - - - - -39]。高山活动通常是用作odontoblastic分化的早期标志和dentin-like组织形成中起着重要的作用。在目前的研究中,更多的高山活动和高山mRNA取得mTOR信号通路被雷帕霉素抑制。符合这一发现,更多的矿化结节也观察到dpc处理后期的雷帕霉素odontoblastic分化。这些结果表明,mTOR信号通路在一定程度上控制EtOH dpc的odontoblastic分化的影响。
此外,相关的基因表达水平odontoblastic标记,如DSPP DMP-1, Runx2, OCN测量调查mTOR的影响信号成的分化能力在体外。的那只弱小的狗崽Runx2域基因家族,是一个重要的转录因子控制骨骼和牙齿发育通过调节成骨细胞和成牙质细胞分化40,41]。DSPP和DMP-1小integrin-binding配体的成员N-linked糖蛋白(兄弟姐妹)的家庭。DSPP最初认为是dentin-specific。虽然最近几项研究已经显示其表达在骨42- - - - - -44),DSPP仍然odontoblastic区别的主要标志。此外,DMP-1至关重要的矿化骨和牙质[45,46]。此外,OCN可以表示成和存在于牙质矩阵,它也被认为是修复牙髓内的分子(47]。在目前的研究中,DSPP、DMP-1 Runx2, OCN EtOH-treated dpc mRNA水平表达下调。但是,雷帕霉素显著逆转DSPP,差别EtOH-induced对这些DMP-1 Runx2, OCN mrna。这提供了进一步的证据,mTOR信号通路中发挥着重要作用EtOH-mediated DPC odontoblastic分化。我们的研究提供了一个基础,高剂量的酒精会损害dpc的修复和再生能力。
然而,dpc可调节的牙原性的分化程度也被其他重要的因素。Paduano等人表明水凝胶支架来源于骨细胞外基质(bECM)促进牙原性的牙髓干细胞的分化在缺乏外部诱导物,这些支架可能与骨的结合/牙原性的介质或生长因子(48]。曲和刘表明明胶/生物活性玻璃混合支架为牙髓干细胞提供了一个良好的环境对牙原性的分化(49]。此外,dental-derived间充质干细胞表现出倾向于其他表型在适当的媒体培养(50- - - - - -53]。有趣的是,poliphenolic分数与啤酒酿造过程增强了抗氧化和抗肿瘤活性。需要进一步的研究来确定是否积极的生物活性化合物的啤酒和其他代理可以调节dpc的牙原性的差异和他们的潜在机制。
总之,本研究首次证明EtOH可以下调odontoblastic分化的dpc mTOR信号通路的激活,这表明EtOH odontoblastic分化起着重要的作用。牙本质再生是一个重要的目标治疗牙髓暴露(54]。保髓治疗的主要目标是保持纸浆的健康组织和刺激剩下的纸浆再生完成复杂(55]。因此,本研究的目的是探讨重型EtOH消费的潜在影响纸浆疗法作为一个因素需要考虑在临床实践中。进一步的研究需要充分理解和支持临床迹象表明重型酒精消费应该在保髓治疗成人气馁。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
魏秦、黄Qi-Ting同样co-first作者本研究做出了贡献。
确认
本研究在一定程度上由NIH R01 DE14190 (Hockin h . k . Xu),马里兰大学牙科学院的桥梁基金(Hockin h . k . Xu),广东省自然科学基金(2015 a030310079)(秦魏),和中山大学的青年教师培训计划(15 ykpy40)(秦魏)。