文摘

3 -百分之八的女性携带者杜氏肌肉营养不良症(DMD)出现营养不良的症状从轻微的肌肉无力迅速进步DMD-like肌肉萎缩症由于倾斜在早期开发的X染色体失活。这里,我们生成的人类诱导多能干细胞(hiPSCs)从展现女性使用逆转录病毒载体或仙台病毒(股票)向量和X-inactivation地位决定的。尽管展现carrier-derived iPS细胞显示正常的人类胚胎干细胞标记物的表达和细胞分化形成畸胎瘤体内,许多臀部克隆显示bi-allelic雄激素受体(AR)基因的表达和损失X-inactivation-specific成绩单和trimethyl-histone H3 (Lys27)信号在X染色体,表明这两个X染色体的臀部细胞处于活跃状态。重要的是,正常的肌营养不良蛋白表达的多核肌管从展现DMD-hiPS的载体细胞分化XaXa模式。基于“增大化现实”技术的成绩单也同样两个等位基因的转录诱导肌管。我们的研究结果表明,灭活X染色体重组期间患者的成纤维细胞被激活,和随机XCI发生分化。

1。介绍

x连锁的杜氏肌肉营养不良症(DMD)是由突变引起的DMD基因,编码所需的抗肌萎缩蛋白蛋白质肌纤维膜的稳定性。大多数女性的载体DMD突变是无症状的,但是3 - 8%的女性携带者出现症状从DMD-like发展一个非常温和的贝克尔肌肉dystrophy-like表型(1)由于扭曲的X染色体失活早期发展(2- - - - - -4]。

人类诱导性多功能(iPS)细胞是胚胎干细胞(ES)像多能细胞来源于体细胞的异位表达一组定义的重组因子(5,6]。iPS细胞疾病建模将是有用的,但山中重组的影响因素在X-inactivation女性“诱导多能性”细胞仍有争议。先前的研究表明,人类“诱导多能性”细胞表现出一种非随机的X染色体失活(XCI)模式,因为它们反映了XCI状态的单纤维母细胞从它们派生7]。其他团体报道两个活跃的X染色体“诱导多能性”细胞来自患者Rett综合症(8]。疾病建模DMD的显化载体的体外,XCI地位的正确认识女性“诱导多能性”细胞和hiPS-derived骨骼肌是必要的。

在这里,我们建立了“诱导多能性”细胞从一个女DMD-manifesting载体和一个女DMD载体三个X染色体和高血清肌酸激酶(CK)水平通过使用一个一体化的逆转录病毒载体或仙台病毒(股票)向量和检查他们的X-inactivation状态。许多臀部克隆显示亏损X-inactivation-specific成绩单(XIST) RNA和偏见外显子1甲基化和bi-allelic表达的雄性激素受体(AR)基因。有趣的是,骨骼肌细胞分化从体现的载体DMD-derived hiPSCs XaXa肌营养不良蛋白表达模式。我们的研究结果表明,女性的灭活的X染色体显化的载体在重组模式被激活,和随机XCI发生分化。

2。材料和方法

2.1。患者成纤维细胞

病人609(41岁)是杜氏肌萎缩症的一个体现载体。肌营养不良蛋白染色的肌肉部分显示马赛克图案。蛋白质免疫印迹显示肌营养不良蛋白是10%的正常水平。多重PCR显示删除的肌营养不良蛋白外显子42-43 DMD基因(框移突变)。病人与XXX三倍体386是一个5岁的女孩。MLPA分析显示删除外显子在一个x 13-44病人显示高水平的血清CK但没有明显的肌肉无力。病人401 (1 y2m,男)45 ~ 50 DMD基因的外显子的重复。的生成和分析这些细胞系的诱导多能干细胞和沉积在公共细胞库(这里细胞库)批准的患者或他们的父母使用同意书和NCNP伦理委员会批准。样本匿名在离开诊所。

2.2。重组实验因素

2.2.1。逆转录病毒载体

成纤维细胞来自患者有609人感染了人类“诱导多能性”细胞生成一体化的逆转录病毒载体pDON-5 OKSNL(豆类生物、日本),编码所有五个重组因子(OCT4、KLF4 SOX2, LIN28, NANOG),然后山肩STO细胞。病毒颗粒是准备使用逆转录病毒包装装备Amph0(豆类生物)和G3T-hi包装细胞系(豆类生物)。人类ES细胞样的殖民地在天29(图1)。重编程效率(高山+殖民地/起始细胞数量)为0.19%。最后,五个克隆选择根据他们的形态和增长率。STR分析来确认这些iPS克隆来自病人609年的成纤维细胞。401 - 8“诱导多能性”细胞获得从401年609 iPS克隆成纤维细胞使用相同的协议。

2.2.2。仙台病毒载体

成纤维细胞重新编程的病人609年和386年,我们使用CytoTuneTM-iPS (DNAVEC、筑波、日本)。向量的鸡尾酒OCT3/4-SeV / TSΔF,SOX2-SeV / TSΔF,KLF4-SeV / TSΔF,原癌基因(HNL)签订/ TS15ΔF)使用的莫伊3,根据制造商的协议。人类ES细胞样的殖民地种植在SNL馈线细胞,和拿起天14-28。rt - pcr对转基因和基因进行签订使用以下引物:塞,向前:GGA柠檬酸CTA GGT手枪ATC GAG C和反向:ACC AGA CAA GAG TTT亚美大陆煤层气有限公司AGA答GTA TC(181个基点);原癌基因,提出:TAA CTG AGC gg CTT GTC G和反向:太极拳ACA TAC AGT有条件现金援助GGA TGA TGA TG(532个基点);KLF4,向前:ACA AGA棉酚AAA ACA TGT ATG G和反向:公司治理文化GCT GGC gg GCC GCT GCT CGA C(529个基点);SOX2,向前:ACA AGA棉酚AAA ACA TGT ATG G和反向:ATG公司治理文化TGG TTC ACG CCC GCG CCC gg(591个基点);OCT3/4,向前:CCC棉酚AGA棉酚AGC棉酚CCA G和反向:AAT GTA TCG亚美大陆煤层气有限公司GTG CTC AA(483个基点)(集成DNA技术,Inc .)。仙台iPS细胞与anti-Sendai应用病毒多克隆抗体(MBL)。

2.3。臀部细胞培养

臀部保持细胞丝裂霉素C (MMC)治疗SNL馈线细胞(CiRA) MMC-treated小鼠胚胎成纤维细胞(mef),或SL10馈线细胞(ReproCELL)灵长类动物ES细胞培养基(ReproCELL)补充bFGF (4 ng / ml)。201年人类“诱导多能性”细胞b7 (5),253年g1 (9),409 b2 (10京都大学的山中),是由美国提供,用于控制诱导多能干细胞。

2.4。免疫细胞化学

细胞与4%多聚甲醛固定为5分钟,与0.1% Triton-X permeabilized PBS 10分钟,阻止5%山羊(Cedarlane)或马(表达载体)血清中2% BSA 15分钟,然后用anti-TRA-1-60孵化鼠单克隆抗体(微孔),反-运输- 1 - 81小鼠单克隆抗体(微孔),anti-SSEA3鼠单克隆抗体(研发),anti-NANOG多克隆抗体(研发),anti-SOX2抗体(6定焦)(微孔),anti-OCT4鼠单克隆抗体(C-10)(圣克鲁斯生物技术),或anti-trimethyl-histone H3 (Lys27)(多克隆,微孔)。细胞被孵化与二次抗体标记Alexa-Fluor 488或568(分子探针)和DAPI。使用荧光显微镜图像拍摄IX71(奥林巴斯、东京、日本)配备一个Orca2气冷式CCD相机(滨松光子学)和AQUACOSMOS软件(滨松光子学)。

2.5。Fluorescence-Activated细胞排序(流式细胞仪)

细胞被resuspended浓度为1.0×10⁶细胞/ 100μl在PBS含有2%的边后卫和孵化anti-SSEA4 (mc - 813 - 70,微孔),anti-TRA-1-60(微孔),或反-运输- 1 - 81(微孔)抗体在冰上30分钟,然后用Alexa孵化488 -标记山羊anti-mouse IgM(英杰公司)或Alexa 488 -标记兔anti-mouse免疫球蛋白(表达载体)。广泛的洗涤后,分析了细胞在一个FACSAria流式细胞分析仪(BD生物科学)。

2.6。rt - pcr和rt - pcr数组

从细胞总RNA提取使用MicroRNeasy工具包(试剂盒)。互补DNA合成(互补)使用QuantiTect逆转录工具包(试剂盒)。表达模式,四个PCR引物被使用:ex42F, AAT CAC柠檬酸TGT CTC ACA AGC有条件现金转移支付;太极拳广汽ex43R, CTG AGC TTT GTT侠盗猎车手;太极拳TGA ex44F,棉酚TTG GGA ACA TGC助教;甘氨胆酸和ex45R CCA GTT TTC AAT GTT CTG AC。AR的表达,AR-F TCCAGAATCTGTTCCAGAGCG TGC和AR-R (CTCTACGATGGGCTTGGGGAGAAC)。rt - PCR数组,使用人类胚胎干细胞基因表达分析RT2分析器(SABiosciences试剂盒)PCR阵列根据制造商的协议。

2.7。核型G-Band染色

基因研究实验室的分析是由日本公司(仙台日本)。染色体的数量在50个细胞/组织检查,然后由详细调查20细胞进行了进一步的分析。

2.8。雄激素受体外显子1甲基化分析

从臀部细胞基因组DNA提取及父母的成纤维细胞与HpaII或MspI消化。然后,消化DNA放大Ar1-r-6FAM底漆(6家TCCAGAATCTGTTCCAGAGCG TGC)和Ar1-f2底漆(CTCTACGATGGGCTTGGGGAGAAC)。PCR分析了产品在3130 xl基因分析仪(应用生物系统公司)和信号的比例量化描述(11]。雄性基因组DNA被用作控制的完整消化unmethylated X染色体(无信号)。因为两者的区别乐队(a和b)只有3 bp (23 CAG重复和24 CAG重复,resp)。在609年病人,我们发现口吃乐队的重叠。修改信号强度,我们使用以下公式:。0.31的计算是基于我们的观察样本24日8个人。

2.9。雄激素受体转录本的直接测序

“诱导多能性”细胞的rna分离reverse-transcribed与Ar1-r-6FAM和Ar1-f2引物互补脱氧核糖核酸和放大。序列PCR产品由直接测序。PCR产品从诱导肌管被克隆到一个助教克隆载体表达载体和插入排序。

2.10。荧光原位杂交(FISH) XIST RNA探针和X染色体探针

鱼分析父母的成纤维细胞和臀部细胞染色体科学非饱和Inc .)、日本札幌(http://www.chromoscience.jp)。简而言之,外显子1 (6 kb)和外显子6 (6 kb) XIST基因扩增的PCR和贴上Cy3尼克翻译。X染色体的FITC-labeled HXO-10探测器(染色体科学非饱和Inc .),其中杂交DXZ1地区使用。细胞室幻灯片处理0.01%盐酸胃蛋白酶/ 0.1 N 4分钟,然后固定在4%多聚甲醛/ PBS。在70°C变性后5分钟,细胞被孵化XIST探针和X探针。洗后以50%甲酰胺/ 2 xssc, 1 xssc,细胞与DAPI染色和安装。图像被使用徕卡相机DMRA2和徕卡CW4000鱼软件。

2.11。畸胎瘤的形成分析

hiPSCs ()注入8 - 12-wk-old的睾丸NOD / Scid老鼠。注射三个月后,肿瘤解剖和固定在15%福尔马林,嵌入在石蜡,减少切片机,苏木精和伊红染色())。

2.12。通过诱导MyoD肌原性的感应

臀部细胞培养imatrix - 511 (Nippi) StemFit AK02N培养基(味之素)和诱导向中胚层沿袭使用STEMDiff中胚层诱导介质(干细胞技术)。3 d文化后,细胞培养领域(12]。6周后文化,这些细胞被镀上collagen-coated盘子和一个慢病毒感染向量编码一个强力霉素(阿霉素)诱导小鼠MyoD基因(pLVi -TagGFP-E2a-MYOD-Puro (3 g),使生物技术)。在2 d选择嘌呤霉素(1μg / ml) (Calbiochem)和阿霉素(1μg / ml) (LKT实验室)的选择、细胞诱导形成肌管的强力霉素和2%马血清DMEM补充。多核肌管与赫斯特33258年应用染料(核),antidystrophin多克隆抗体(Abcam)和antimyosin重链(MF20)(研发系统),然后用山羊可视化anti-mouse IgG2b-Alexa568和山羊anti-rabbit IgG-Alexa 488(生命技术)。

3所示。结果

3.1。“诱导多能性”细胞的诱导成纤维细胞的展现模式载体

成纤维细胞从一个显化载体(病人609)首次感染一个一体化的逆转录病毒载体表达OCT4 KLF4, SOX2, LIN28, NANOG和山肩细胞停止给料机;五个克隆获得(609 - 2、609 - 4、609 - 5,609 - 9和609 - 12),接下来,相同的成纤维细胞被感染四SOX2仙台病毒载体编码,KLF4, OCT4、原癌基因和山肩SNL馈线细胞(图1)。我们获得了四个克隆(609 s - 1、609 s、609 s 3和609 4)使用仙台病毒载体。精原殖民地的出现还快(2 - 3周)SeV-mediated重组比逆转录病毒vector-mediated重组(3 - 4周)。RNA (rt - pcr)或蛋白质签订没有发现最早通过三(补充图可以在网上https://doi.org/10.1155/2017/7906843)。的表达人类ES标记(TRA-1-60交易- 1 - 81、SSEA3 NANOG, OCT3/4,和SOX2)在所有臀部细胞经免疫细胞化学(补充图)。流式细胞仪分析证实SSEA4的表情,TRA-1-60,交易在所有臀部- 1 - 81细胞(补充图进行测试)。基因的表达人类ES标记和分化标记也通过rt - pcr检查数组(补充图)。病人609的细胞则显示类似的基因表达模式201 b7和253 g4,这已经显示出在体外分化多能性鉴定和畸胎瘤形成实验(5,9)(补充图)。鱼分析使用一个X染色体探针和G-band臀部的父母的成纤维细胞和细胞的染色(609 - 4 iPS和609 s 3“诱导多能性”细胞)显示,父母的成纤维细胞和iPS细胞正常核型形成总值(46 xx)和染色体异常(补充表1和补充图1)。臀部细胞来源于609年成纤维细胞分化良好型的畸胎瘤形成三个月后移植到睾丸(图2)。

3.2。甲基化的外显子1的基于“增大化现实”技术基因的等位基因的表达基于“增大化现实”技术细胞基因的成纤维细胞和臀部

确定X chromosome-inactivation iPS细胞的状态,我们首先研究了外显子1的甲基化的雄激素受体在肌肉纤维母细胞、骨骼肌(活检样本)和血液根据艾伦描述的方法等。13)(图3)。我们消化基因组DNA与HpaII (CpG甲基化敏感)或MspI(消化甲基化CpG),然后通过PCR扩增外显子1地区特定的引物。这个试验被广泛用于测量XCI扭曲DMD的纯合子的航空公司(1]。病人609显示22和23的CAG重复第一个外显子的雄激素受体基因(数据没有显示)。量化信号的甲基化和unmethylated等位基因显示扭曲XCI向相同的X染色体在骨骼肌肌成纤维细胞。血液样本显示没有明显的扭曲。23日的数据表明,AR基因CAG重复和突变DMD基因相同的X染色体,这等位基因(等位基因1)主要活跃在骨骼肌。我们下了雄激素受体的第1外显子的甲基化状态609年病人的iPS细胞(数字3和4)。所有五个retro-iPS克隆遗传的非随机的甲基化模式基于“增大化现实”技术外显子1的父母的成纤维细胞;等位基因2优先甲基化,尽管一个理论模式,0%:100%,没有被观察到。令人惊讶的是,四分之三的SeV-iPS克隆了一个几乎nonskewing模式,表明XCI的损失。

知道这两个AR基因的等位基因转录在iPS克隆,雄激素受体转录reverse-transcribed到cDNA、放大,直接测序。令人惊讶的是,6 iPS克隆出9 iPS克隆显示同样表达模式。只有三个iPS克隆(609 - 4、609 - 12和609 s)保留优惠等位基因的表达(图13和补充图5)。

3.3。XIST RNA信号成纤维细胞展现DMD的载体和派生的“诱导多能性”细胞

接下来,我们检查XIST在成纤维细胞表达,retro-iPS细胞,SeV-iPS细胞。XIST是一种非蛋白编码RNA所在不活跃的人类X染色体(14,15]。RNA-FISH分析显示,超过80%的retro-iPS细胞克隆609 - 2和609 - 4保留XIST表达两个X染色体(图之一4和表1)。相比之下,609年未发现XIST信号s - 1“诱导多能性”细胞或609 s万能干细胞(图4和表1)。因为609 s“诱导多能性”细胞显示倾斜的甲基化的基于“增大化现实”技术的外显子1和主导一个AR基因的表达(数字3和4),我们推测,大多数609 s“诱导多能性”细胞失去了XIST RNA但仍hypermethylated转录抑制。相比之下,我们的观察表明,609 s - 1“诱导多能性”细胞激活不活跃的X染色体。

3.4。XCI iPS细胞来源于女性与XXX三倍体DMD的载体

进一步检查XCI重组的影响,我们生成的万能女载体与XXX三倍体仙台病毒载体(386年病人)。这个病人有大量删除Ex13-Ex44活跃的X染色体和血清CK水平高,但显示没有明显的肌肉无力由于在坐标系突变。在这种情况下,抗肌萎缩蛋白组织化学染色表明,其他两个X染色体完全灭活(数据未显示)。诱导iPS克隆(补充图显示ES细胞样的基因表达模式)和三XXX分析(补充图)。XIST鱼分析还表明,父母的成纤维细胞有三个X染色体,其中两个是涂有XIST RNA。相比之下,大多数病人386的“诱导多能性”细胞显示只有一个XIST信号(图4(b))。H3K27me3在不活跃的X染色体是一个压抑的染色质的印记。信号H3K27me3也只有一个X染色体上发现在大多数386 iPS细胞(图4(b))。尽管这样一个异常XCI状态,386 -编程的细胞则通过签订向量形成分化良好型的畸胎瘤NOD / Scid小鼠的睾丸(图2)。

3.5。肌营养不良蛋白表达DMD-Manifesting载体hiPSC-Derived肌管

确定病人确实609年的“诱导多能性”细胞激活的X染色体正常的肌营养不良蛋白编码,我们诱导她“诱导多能性”细胞分化成骨骼肌血统利用doxycycline-inducible MyoD表达,免疫细胞化学检测肌营养不良蛋白表达。肌管源自609 s, 609 s 3和609 s 4表示正常肌营养不良蛋白的细胞则无特征的水平从肌管来源于控制409 b2(图5)。rt - pcr对肌营养不良蛋白确认正常肌营养不良蛋白积极转录的基因。直接测序CAG-repeats AR的成绩单还表示,两个等位基因都同样表现在肌管从609 s 3和609 s 4万能干细胞诱导。23 609年s肌管,AR基因CAG重复等位基因1还是优先(图表示5)。

4所示。讨论

4.1。活化细胞灭活的X染色体的臀部是一种常见的现象

X染色体的失活人类“诱导多能性”细胞已经被检查在正常女性万能(16)和Rett综合症iPS细胞(8,17- - - - - -20.]。三组报道非随机XCI Rett iPS克隆的地位。相比之下,Marchetto等人,金等人报道,XCI抹去一些,但不是全部,重组RTT-iPSC克隆,再一次XCI发生随机在分化成神经元。609年病人XCI的iPS克隆与RTT-iPSCs克隆。我们还发现XXX-iPS克隆重组通过向量签订只有一个XIST信号,当父母的成纤维细胞有两个,暗示激活两种不活跃的X染色体。诺曼等人报道,许多XXX-iPS细胞来源于三重X病人没有显示ξ标记在他们的实验21]。因此,尽管我们推测,臀部与三个活跃的X染色体细胞无法生存在一个X染色体基因的过量,XaXaXa臀部细胞可能生存在不同的培养条件。解释相互矛盾的结果,需要进一步调查。

4.2。重组方法影响XCI女性DMD-iPSCs怎么样?

我们发现不同XCI状态retro-iPSCs和Sendai-iPSCs之间,但不同的重组方法的机制产生臀部细胞与不同XCI状态尚不清楚。一种可能性是,高水平和长时间的表达重组因子的仙台病毒载体导致臀部失去XCI细胞。但在等人报道,“《京都议定书》的方法,”LIF-producing SNL细胞作为喂食器,有助于激活的重编程过程中(22]。尽管生活如何消除XCI还有待确定,我们的结果是同意他们的假设;我们使用STO细胞(SNL的亲代细胞细胞)逆转录病毒重组,仙台viral-mediated重组和SNL细胞。我们也比较了两个喂食器的影响,也就是说,mef和SL10正常女性的成纤维细胞的重编程。有趣的是,重组,mef倾向于保留trimethyl-histone H3 (Lys27)相比,则建立在SL10,再次表明馈线的细胞是一个因素影响XCI状态(补充图6)。重组因子的组合是另一个可能的因素影响了XCI hiPSCs在我们的研究中(图1)。两个X染色体是如何被激活在重组和XaXa状态稳定保存在文化应该在将来的研究中确认的。

4.3。人类iPSC来自的一个显化载体DMD分化成肌管,表示正常的肌营养不良蛋白

因为许多iPSC克隆是从一个显化的载体模式显示XaXa-like AR基因位点的甲基化模式,表达两种基于“增大化现实”技术等位基因(图3(表),XIST信号1,图4),H3K27me3疣状(图4),我们预计不活跃的X染色体重组期间被激活,导致重置XCI倾斜的分化细胞。意外,“XaXa”hiPSCs源自DMD-manifesting航母分化成多核肌管,并显示强劲的肌营养不良蛋白的表达控制。我们的观察表明,XaXa hiPSC克隆重置XCI表达肌营养不良蛋白的扭曲分化细胞。Bi-allelic基于“增大化现实”技术表达肌管确认XCI随机诱导分化期间从XaXa hiPSCs到肌管(补充图)。

5。结论

(1)许多iPS克隆是从一个展现女性DMD的载体有两个活跃的X染色体(XaXa)或混合模式(XaXa / XaXi)。(2)再分化的女性展现DMD-iPSCs的载体有两个活跃的X染色体为肌管恢复肌营养不良蛋白表达由于取得nonskewed XCI。

的利益冲突

没有利益冲突有关出版的手稿。

确认

作者感谢部门的所有成员的分子治疗技术支持和讨论。他们也欣赏恭子中川技术援助。这项工作是支持的科研补助金(20590418,24590497)和格兰特的实现再生医学教育部,文化、体育、科技、研究基金”发展耐火肌肉疾病的细胞移植的方法”(项目技术开发)和“耐火材料研究肌肉骨骼疾病使用特异诱导多能干细胞(iPS)细胞”从“再生医学研究中心网络实现,”日本科学技术振兴机构,日本医学研究和开发署(艾湄湾),和校内的科研补助金(24-9,25-5、27-7 28-6)NCNP神经和精神疾病。

补充材料