文摘

Kindlin-2是多畴的细胞内蛋白质,可以招募β整合素域激活信号,启动转录程序,结合钙粘蛋白。探索其参与细胞间充质细胞命运决定,我们研究了影响Kindlin-2修改(超表达/击倒)在诱导多能细胞来源间充质基质细胞(iPSC-MSCs)。Kindlin-2过度导致iPSC-MSCs扩散,减少细胞凋亡增加,以及对骨细胞的分化、抑制脂肪细胞和软骨细胞。相比之下,siRNA-mediated Kindlin-2击倒iPSC-MSCs分化诱导细胞凋亡增加,增加反应。的能力iPSC-MSCs坚持VCAM-1 / SDF-1α在剪切应力和在伤口从头开始迁移试验后显著增加Kindlin-2超表达。看不到相反,抑制混合淋巴细胞反应(MLR)通常是独立于Kindlin-2 iPSC-MSCs调制,除了减少生产白介素2 (2)Kindlin-2 iPS-MSCs超表达。具备干细胞,因此,Kindlin-2移植生存、增殖和迁移潜力iPSC-MSCs因此可能是有益的优化性能iPSC-MSC疗法。

1。介绍

Kindlins细胞内多畴的蛋白质绑定图案,调解他们的互动与整合蛋白,细胞骨架,或者,对于Kindlin-2,钙粘蛋白(1]。Kindlins可以通过坚持他们的整合蛋白激活β胞质链使用丰贸领域参与a-actinin, migfilin,或integrin-linked激酶(亲属),导致肌动蛋白重组,细胞迁移和板状伪足的形成(2]。Kindlin-2被发现在胚胎发生中发挥作用通过改变不同的细胞的增殖潜能和迁移行为,和放松管制Kindlin-2能够阻止胚胎发育和诱导胚胎杀伤力3]。Kindlin-2发现触发上皮间充质转变(EMT)体外激活Wnt信号(4),导致增加粘附、迁移和增殖(5]。Kindlin-2也可能抑制结肠癌细胞的生长和迁移(6]。因为EMT发生在诱导多能干细胞(万能)对mesenchymal-like分化细胞(7],我们旨在调查的角色Kindlin-2 iPSC-derived MSC的功能。我们假设Kindlin-2可能增加增殖,提高迁移和附着力,提高功能激活iPSC-MSCs,因此可能会提供一个基础工程iPSC-MSCs治疗可取的方式。

获得足够数量的msc移植一直使用的一个限制因素。此外,msc的健壮的功能激活,如迁移对受伤的组织,附着力的地区需要组织修复,和抗细胞凋亡输血后,被认为是治疗的关键接受者的效率(8,9]。到目前为止,还不清楚到什么程度改变扩散,迁移、粘附在治疗上应用msc可能会影响细胞的功能来协调组织修复或者免疫调节。应该显示完全,”superfunctional“msc高可扩展性和生存和提高粘附和迁移与保存免疫调节特性可能促进msc在细胞疗法的治疗潜力。

在先前的研究中,我们为特征的分化细胞则对msc获得功能代替体外msc (7,10]。我们已经表明,万能干细胞可以分化成msc、包括开发从“epithelial-like”则向纺锤状msc增殖能力的感应到的未分化的阶段,multilineage分化。此外,iPSC-MSCs显示类似的造血支持和免疫调节效应BM-MSCs [10]。在这项研究中,我们旨在修改Kindlin-2表达iPSC-MSCs调节其增殖和功能属性。我们证明Kindlin-2表达水平调节iPSC-MSCs的粘附和迁移特性以及它们的增殖,凋亡、分化和免疫低下的属性。

2。材料和方法

2.1。“诱导多能性”细胞培养和间叶细胞分化

人类则提供了从内部供给所述11]。短暂,人类胎儿肝纤维母细胞(FLF)并通过慢病毒表达重组因子Oct4、Sox2, Klf4,和原癌基因(OSKM)和培养对辐射小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中含DMEM / F-12 20%击倒血清替代(美国马热费希尔,沃尔瑟姆),20 ng / mL重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,提供从莱布尼兹汉诺威大学),0.1毫米β巯基乙醇(热费希尔),1毫米谷酰胺,1%不重要的氨基酸,1%青霉素和链霉素(所有从Sigma-Aldrich)。细胞分裂每周使用胶原酶IV(热费希尔)和细胞被镀Matrigel-coated(康宁)板块。万能干细胞的分化/浓缩进行了msc描述(10]。简而言之,人类iPSC殖民地种植在基底膜基质与MSC诱导维护媒体组成的DMEM(血糖过低,Sigma-Aldrich,达姆施塔特,德国),定义10%胎牛血清(公元前的边后卫,干细胞技术,温哥华,加拿大),1%的非必要氨基酸,1% penicillin-streptomycin, 2 ng / mL人类重组bFGF 7天。接下来,细胞治疗与胶原酶IV 3分钟37°C,分离玻璃珠和温柔的移液,然后通过40毫米细胞过滤器(费舍尔科学,Schwerte,德国)。单个细胞被播种到gelatin-coated板1×10⁴细胞/厘米²媒体在MSC。

2.2。转染和建立稳定的细胞系

iPSC-MSCs转染有四种不同的构造,包括Flag-Kindlin-2或标志矢量,控制短发卡RNA(成分),或Kindlin-2成分。向量从整理收到的礼物,北京大学健康科学中心,北京,中国。质粒结构描述了et al。12]。这些细胞被镀在6-well板块1×10的密度⁴细胞/厘米²转染前24小时。质粒是在扩大大肠杆菌(大肠杆菌应变DH5a) 16 h和纯化QIAfilter马克西工具包(试剂盒、希尔登,德国)制造商的协议。纯化质粒DNA(3毫克/毫升)resuspended在97.5μ2.5 L的低糖DMEM,然后μL 0.1毫米的表面(PEI)添加(Sigma-Aldrich)。PEI / DNA质粒的解决方案是涡立即让裴/质粒复合物。相互作用的复合物被允许15分钟前他们在室温下使用。然后,600年μL(低糖DMEM 10%的边后卫也添加到复合物转染混合物;最后,混合添加到细胞。3小时后,介质被删除,取而代之的是正常的msc媒体2天。两天后,细胞培养在500年μg / mL G418 (Sigma-Aldrich)选择,直到所有nontransfected细胞消失。

2.3。扩散分析

细胞增殖检测进行WST-1和BrdU比色分析(从罗氏公司)根据制造商的协议。WST-1测定,细胞被镀在96孔板的初始密度2000细胞/。增长图表是五天后转染条件测量甲瓒染料的媒体。为定量比色BrdU扩散试验(罗氏)BrdU添加固定前12小时。anti-BrdU-POD添加,通过添加随后的底物反应检测。比色分析发现了用扫描多井分光光度计(Bio-Rad)。BrdU-incorporated转染后细胞数五天。细胞被固定为4%多聚甲醛(PFA),然后进行免疫荧光染色,5-bromo-2′脱氧尿苷(BrdU) (Abcam)。荧光显微镜下细胞计数,BrdU积极核比原子核的总数与DAPI染色(Sigma-Aldrich)确定。

2.4。流式细胞术

调制后评估的表达cxcr Kindlin-2表达式,流仪分析转染后3天如下:单个细胞悬浮液被胰蛋白酶消化准备(技术)和洗冷PBS含有1%牛血清白蛋白BSA(默克密理博)。接下来,2×10⁵细胞被孵化30分钟的各自APC-conjugated单克隆抗体cxcr从BD(生物科学)和悬浮液的密度resuspended 2×10⁵细胞每200L在寒冷的包含1% BSA PBS。非特异性荧光是由孵化isotype-matched单克隆抗体的细胞能整除。样本运行在FACSCalibur (BD生物科学、钙、美国)血细胞计数器使用流式细胞仪天后软件。为每个分析,至少10000个细胞化验。数据进一步处理使用FlowJo软件(树明星,亚什兰,俄勒冈州,美国)。

2.5。流室附着力试验

对于附着力化验,10⁵iPSC-MSCs被允许休息3分钟层流室幻灯片(μ幻灯片,ibiTreat;IBIDI系统、德国慕尼黑)安装在一个倒置显微镜(如前所述)(13]。简单地说,流室预镀有2μg / mL VCAM-1融合蛋白和cocoated SDF-1,从研发系统(1μg / mL)。随后,哈佛商学院/ 0.1% BSA (prewarmed 37°C)刷新通过的钱伯斯表示剪应力计算步骤的增加0.35至15达因/厘米²每30年代。图像拍摄和贴壁细胞数在4个字段为每个条件。

2.6。迁移分析

细胞被播种在3×10的密度⁴细胞两侧Ibidi文化插入的活细胞分析与500年(Ibidi,慕尼黑,德国)μM分离的好,被允许长24 h。细胞被使用30μ米丝裂霉素C的30分钟前删除插入,插入和细胞在DMEM培养有或没有30μ米丝裂霉素c细胞拍摄使用10倍目标(蔡司)后插入删除(0 h)和24和36 h(孵化。轮回化验进行transwells(美国纽约康宁)和8 6.5毫米直径μ米孔隙过滤器。transwell过滤器上面的涂层为1小时37°C和0.1%牛明胶(Sigma-Aldrich)磷酸盐(PBS)。然后,5×10⁵转染iPSC-MSCs悬浮在200年μL迁移介质包含RPMI 0.25%牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)被添加到上层房间,和600年μL迁移介质的补充添加了10%的边后卫室底部。24小时和48小时后孵化的transwells 37°C / 5%的股份有限公司₂上面的过滤器与冷PBS仔细清洗,剩余和细胞上的过滤器被棉花拭子。Transwell过滤器使用染色溶液染色(Sigma-Aldrich),降低了手术刀,安装到玻璃幻灯片向上与较低的脸。细胞迁移是统计的总数在200 x放大使用光学显微镜。每个实验进行了一式三份。

2.7。实时聚合酶链反应

细胞总RNA分离使用试剂盒试剂(技术)。合成RNA受到DNase治疗和互补脱氧核糖核酸合成工具(技术)与随机五个一。混合电力SYBR绿色主人qRT PCR检测与StepOne +进行循环(应用生物系统公司)使用标准的设置。样本收集从至少三个独立的实验。Kindlin-2引物序列提出了用于实时PCR 5′-TGTCTCCCCGCTATCTAAAAAAGT-3和反向序列5′-TGATGGGCCTCCAAGATTCT-3。GAPDH是作为内部控制提出序列5′-CTGAGAACGGGAAGCTTGT-3和反向序列5′-GGGTGCTAAGCAGTTGGT-3。表达的基因决定使用比较CT方法()。

2.8。免疫低下化验

24小时iPSC-MSCs转染后,混合淋巴细胞反应(高)文化注射5×10⁴丝裂霉素C-treated (Sigma-Aldrich)人类外周血单核细胞(PBMCs)诱导和2×10⁵人类CD8⁺t细胞与正常献血者在知情同意后96 - 200年圆底板块包含RPMI 1640 L的完全培养基(技术)与0.1毫米补充β巯基乙醇,10%的边后卫,GlutaMAX我(生命技术),100 U /毫升青霉素,100存在与否的g / mL链霉素iPSC-MSCs和BM-MSCs如前所述[10]。文化培养5天在37°C / 5%的股份有限公司₂。BrdU被添加到混合淋巴细胞反应12小时之前固定。anti-BrdU-POD添加,通过添加随后的底物反应检测。比色分析发现了用扫描多井分光光度计(Bio-Rad)。和干扰素- - 2γ浓度测定在MSC /高coculture上层清液使用商用ELISA (BD生物科学)根据制造商的指示。简单地说,50μL的ELISA稀释剂添加到或干扰素- - 2γ96 -孔板涂层。然后,100年μL浮在表面的样品或标准控件添加到井在室温下2小时。洗后样品的5倍,100年μL探测器工作的准备在每个对1小时孵化rt,洗后样品七次,100μL(三甲基质添加在RT孵化30分钟,其次是增加50μL停止解决方案。比色分析发现在450 nm使用多井分光光度计(Bio-Rad)。

2.9。膜联蛋白V化验

通过流式细胞仪分析转染后的可行性iPSC-MSCs监控使用膜联蛋白V-propidium碘染色。培养iPSC-MSCs分离,离心机,悬浮在PBS,沾膜联蛋白V-FITC和propidium碘(美国圣地亚哥BD Pharmingen CA)。凋亡细胞被标识为一个膜联蛋白V-positive / propidium iodide-negative人口使用FACSCalibur血细胞计数器(BD)和FlowJo软件(树明星)。

2.10。分化后iPSC-MSCs Kindlin-2修改

分化诱导iPSC-MSCs进行21天在不同分化媒体,转染后24小时。总的来说,10⁴每口井的细胞被播种在six-well盘子(TPP)。与MSC诱导成骨分化,细胞培养介质包含1μ0.5 M地塞米松,M抗坏血酸,10毫米b-glycerol磷酸从Sigma-Aldrich(所有)。脂肪形成的诱导、细胞培养的MSC中补充了5050 g / mL消炎痛(Sigma-Aldrich)g / mL抗坏血酸,和100 nM地塞米松。chondrogenic分化,iPSC-MSCs离心机在0.2毫升的介质在500 g 10分钟15毫升猎鹰管形成颗粒。球团培养在MSC与0.01中补充地塞米松,397g / mL抗坏血acid-2-phosphate (Sigma-Aldrich), 1毫米丙酮酸钠(Sigma-Aldrich), 10 ng / mL转化生长因子-β1 (TGF -β1、生活技术)和1% insulin-transferrin-selenium(技术)。骨生成评估了茜素红染色,脂肪生成评估石油红色的o染色,软骨形成被阿尔新蓝染色评估从Sigma-Aldrich(所有)。

2.11。统计分析

结果表示为平均值±标准平均误差(SEM)。使用单向分析iPSC-MSCs体外进行重复测量方差分析(方差分析)其次是图基的事后测试多个组比较分析组体内数据的差异。平均差异是显著的的水平。为量化ImageJ软件,共有30个领域每组化验。

3所示。结果

3.1。在iPSC-MSCs Kindlin-2表达式模式和目标

作为第一种方法评估的角色Kindlin-2 msc,我们分析了iPS的mRNA水平的Kindlin-2 BM-MSC, iPS-MSCs。我们发现BM-MSCs表达高水平的Kindlin-2 RNA与万能干细胞(,图1(一))。不同段落的iPSC-MSCs显示略有增加Kindlin-2 mRNA和蛋白表达水平的“诱导多能性”细胞相比,但仍低于BM-MSCs(图1 (b))。超表达/可拆卸的实验中,我们使用iPSC-MSCs段落4 - 6。定量rt - pcr结果表明成功转染iPSC-MSCs Kindlin-2结构相比,控制质粒(图1 (c))。相应的表达Kindlin-2蛋白质数据所示1 (d)和1 (e)。

3.2。Kindlin-2促进增殖/ iPSC-MSCs生存和抑制细胞凋亡

以前,我们表明,iPSC-MSCs显示比BM-MSCs倍增时间短,衰老在以后章节比BM-MSCs [10]。调查的影响Kindlin-2 iPS-MSCs增殖和生存,我们执行一个BrdU公司化验(图2(一个))显示显著增加Kindlin-2国旗转染后相比,矢量控制。相比之下,渺小但减少BrdU合并后观察Kindlin-2 shRNA转染。同样的模式在WST-1化验(图2 (b))。我们确认这些数据通过计算BrdU-incorporated iPSC-MSCs转染后。BrdU的数量⁺细胞也明显高于Kindlin-2国旗转染细胞,有轻微下降后Kindlin-2 shRNA转染相比控制向量(数字2 (c)和2 (d))。我们下一个寻找转染后细胞凋亡通过膜联蛋白V表达式(数字3(一个)和3 (b))。凋亡细胞的比例显著下降3 - 6% Kindlin-2国旗转染细胞相比,相应的对照组(7 - 12%)。此外,Kindlin-2击倒的凋亡细胞数量显著增加Kindlin-2 shRNA转染细胞(图17 - 21%3(一个)和3 (b))。MSC的同时,表达未分化的细胞标记,CD73和CD105增加Kindlin-2 overexpressing细胞和减少Kindlin-2击倒后(数字3 (c)和3 (d))。

3.3。后分化潜力Kindlin-2 iPSC-MSCs超表达

调查是否转染后细胞可能有各种各样的分化能力,我们进行了基因表达分析和形态分析iPSC-MSCs培养在各种条件下21天。在成骨分化,我们发现少钙积累Kindlin-2国旗转染iPSC-MSCs骨钙素和碱性磷酸酶的表达明显降低,而碱性磷酸酶的表达明显()高Kindlin-2 shRNA转染细胞相比,控制向量(图4(一))。在chondrogenic分化,Kindlin-2国旗转染软骨细胞产生一个小和未分化的颗粒;然而,其他组创建了一个更大的和完全分化细胞组织学分析(图中观察到的颗粒4 (b))。此外,Kindlin-2超表达明显()aggrecan mRNA水平下降而细胞转染Kindlin-2成分明显()的高表达aggrecan和胶原蛋白II型(图4 (b))。我们观察到的脂滴数量增加Kindlin-2 shRNA转染iPSC-MSCs和明显高于表达式()的PPAR -γ和LPL,脂滴的数量减少iPSC-MSCs转染与显著降低Kindlin-2标志矢量表达式()的PPAR -γ和LPL(图4 (c))。

3.4。附着力iPSC-MSCs在剪切应力

调查iPSC-MSCs如何与相关的归巢受体激活交互整合蛋白在剪切流,平行板流室系统使用VCAM-1 + SDF-1α涂层。我们评估粘附iPSC-MSCs和决定他们的能力的百分比仍然附着在不同的剪切应力从低(0.35达因/厘米²(15达因/厘米)高²)的水平。确定数量的细胞附着在每个剪切应力表明,Kindlin-2国旗转染细胞有较高的亲和力坚持VCAM-1 + SDF-1α涂层表面比控制向量转染细胞。如图5后,增加剪切应力2达因/厘米²,%的Kindlin-2国旗仍然附着在表面相比,转染细胞%控制向量和的%的Kindlin-2 shRNA转染细胞。更重要的区别是增加剪切应力后观察5达因/厘米²的平均% Kindlin-2国旗转染细胞保持连接,而控制细胞拒绝%,细胞Kindlin-2 shRNA集团拒绝%。与此同时,% Kindlin-2国旗也发现阳性细胞趋化因子受体CXCR4通过流式细胞术,相比%控制向量,%控制成分%在Kindlin-2 shRNA iPS-MSCs分别(意味着+ SD;;图中没有显示)。因此,Kindlin-2超表达明显()增加附着力VCAM-1 + SDF1α涂层流室幻灯片之间的剪切应力2和15达因/厘米²和趋化因子受体CXCR4的表达增加。

3.5。迁移的潜力后iPSC-MSCs Kindlin-2超表达

我们下一个调查的迁移潜力iPSC-MSCs转染后使用transwell文化插入Kindlin-2构造。我们发现显著差异(细胞的数量都在24 h和36 h之间Kindlin-2国旗转染细胞(%与%后24 h和%与%后36小时)。然而,这些差异都不显著Kindlin-2成分和对照组之间(图6(一))。我们观察到,在转染后24小时,细胞迁移到低表面文化插入Kindlin-2国旗转染iPSC-MSCs,但只有对照组细胞数()。此外,细胞迁移的数量减少在Kindlin-2 shRNA转染细胞,显著降低()比对照组。Kindlin-2国旗转染细胞迁移也明显更好()比对照组细胞48 h后孵化(与细胞Kindlin-2国旗控制细胞)。虽然我们观察到的数量减少的迁移细胞Kindlin-2 shRNA组与对照组相比,差异无统计学意义(图6 (b))。总之,Kindlin-2水平导致调制iPS-MSCs迁移。

3.6。Kindlin-2 iPSC-MSCs和抗炎作用

以前,我们已经表明,iPSC-MSCs表现出强大的免疫调节功能在混合淋巴细胞培养试验通过减少CD4(高)⁺早期增殖以及减少IFN -γ分泌。在这项研究中,我们使用Kindlin-2国旗/ shRNA转染iPSC-MSCs和BM-MSCs确定Kindlin-2表达水平差异可能影响这些细胞的免疫调节特性高钙测定。总体而言,我们的研究结果表明,Kindlin-2国旗/成分没有显著差异表达iPS-MSCs相比,相应的控制。然而,所有组iPSC-MSCs以及BM-MSCs可以显著降低CD4的数量⁺t细胞或释放的干扰素-γ没有支线层(数据比较高7(一)和7 (b))。然而,在干扰素释放——没有明显差异γ在所有高化验iPSC-MSCs或BM-MSCs之间作为支线细胞(图7 (b))。只有Kindlin-2表达iPSC-MSCs BM-MSCs - 2分泌能够显著减少,而其他3组与对照组没有显著差异(图7 (c))。

4所示。讨论

4.1。在推导iPSC-MSCs Kindlin-2表达式

这个研究表明Kindlin-2 integrin-associated蛋白可以改变iPSC-MSCs的表型的扩散以及粘附和迁移特性向更原始的表型和的方式是可取的msc用作细胞疗法(14,15]。之前报道,Kindlin-2可以调节信息和cell-ECM粘连以及通过整合素和细胞迁移integrin-linked激酶(同类)激活16- - - - - -18]。Kindlin-2已被证明在调制信号转导中起关键作用和激活,帮助细胞传感和与周围环境相互作用19]。Kindlin-2不仅调节由内向外信号与整合素作用β链(20.),也有利于由外向内信号通过绑定integrin-linked激酶(21]。最近,它已经表明,Kindlin-2可以调节整合素β1蛋白表达在成人心肌细胞(22]。Kindlin-2还参与调节肿瘤细胞入侵不同函数在不同癌症类型(23]。

一般来说,亲和力监管但不是调节整合素表达水平影响整合素激活。虽然各种目标Kindlin-2如mir - 200家庭和migfilin已经描述(24,25)作为增强介质粘附、迁移和入侵,这些影响仍然是有争议的,因为Kindlin-2超表达/击倒在不同的细胞类型并不总是相同的。例如,Kindlin-2超表达促进前列腺癌干细胞增殖(26),而它减少了细胞分裂在结直肠癌细胞(6)和间叶细胞癌症入侵(27]。使用Kindlin-2突变与整合素结合的缺陷可能会进一步澄清的参与观察功能的整合素结合Kindlin-2在我们的研究中。

我们假设如果Kindlin-2增加增殖、粘附和迁移iPS-MSCs,研究这种蛋白质可以提供高度增殖的msc可以保留或超越正常的msc治疗所需的功能特征和可能解决他们的缺陷28,29日]。我们的数据表明,Kindlin-2表示在BM-MSCs水准高于我们用来区分的万能iPSC-MSCs(图1(一))。在胚胎发育期间,Kindlin-2,弱表达在胚胎干细胞,开始积累水平增加mesodermal-derived组织(3,30.,31日]。此外,Kindlin-2表达的增加随着epithelial-shape胚胎干细胞epithelial-mesenchymal过渡(EMT)向mesodermal-differentiated细胞(32]。如图1(一),新分化iPSC-MSCs Kindlin-2信使rna和蛋白质的表达量相对较低。然而,这个表达式增加在后面的段落。

4.2。cxcr / SDF-1 Kindlin-2目标α轴

我们还表明,蚀变Kindlin-2表达式在iPS-MSCs(图1 (b))积极影响表达式的新发现Kindlin-2目标,cxcr。这表明Kindlin-2可能会增加细胞粘附和迁移通过增加在细胞表面趋化因子受体CXCR4的表达或其可用性(33]。工程msc的高表达cxcr被证明有一个增强的迁移能力和还在辐照小鼠自导能力,SDF-1有关α骨髓内水平(34]。此外,cxcr / SDF-1α轴有主要影响msc招聘组织,趋化性和导航35]。

水平的提高cxcr iPSC-MSCs由于Kindlin-2过度可能是提高了细胞的粘附能力的关键因素VCAM-1 / SDF-1α涂层流室幻灯片在高水平的剪切应力也更好的迁徙的潜力。我们执行一个附着力试验VCAM-1和纤连蛋白,这并不影响Kindlin-2超表达/击倒(补充图1在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/7316354)。我们的研究结果支持先前的研究表明,增强cxcr表达可能导致改进迁移潜力和msc粘附在受影响的网站36- - - - - -38]。

4.3。在iPSC-MSCs Kindlin-2超表达上调扩散

然而,仍然有争论Kindlin-2对细胞增殖的影响。以前,Kindlin-2被称为mitogen-activating蛋白导致增强扩散[审查,请参阅[39]]。然而,最近,它已经表明,Kindlin-2超表达并不总是放大扩散但降低细胞分裂(6,27]。为此,我们在这里显示Kindlin-2过度导致iPSC-MSCs更高的增殖,而其可拆卸的细胞凋亡增加。关于msc输液治疗,msc与增强扩散,迁移,和导航能力(附着力)是有利的,长期有利影响治疗的受伤区域(40]。到目前为止,我们Kindlin-2国旗转染iPSC-MSCs接近“superfunctional”msc的特点是一个合适的替代正常的msc在细胞输注治疗。然而,它仍然需要移植和调查他们的致瘤的潜力。

4.4。Kindlin-2过度会使Multilineage iPSC-MSCs分化

我们已经描述了完整的分化潜能和免疫抑制的能力iPSC-MSCs的一项研究[10]。在这里,我们发现Kindlin-2击倒iPSC-MSCs呈现更容易分化成三个中胚层的血统,而Kindlin-2过度抑制了这些过程。最近,吴等人表明Kindlin-2击倒在分化细胞,软骨细胞等,降低了密度通过抑制TGF -β1-induced Smad-2磷酸化,从而导致较低的细胞倍增率和细胞凋亡增加。这些结果与我们的研究结果(41]。然而,Kindlin-2击倒的老鼠在这之前的研究缺乏初级骨化中心和分化软骨细胞由于细胞凋亡的增加在体内主要的间叶细胞祖细胞(41]。我们的数据表明,Kindlin-2国旗转染后,分化的亲和力iPSC-MSCs显著减少使用形态和分化标记,而Kindlin-2击倒增加iPSC-MSCs体外的分化潜能。

4.5。Kindlin-2超表达并没有改变iPSC-MSCs免疫调节的影响

iPSC-MSCs的免疫抑制的能力和BM-MSCs完好无损后Kindlin-2超表达/击倒在我们的研究中。多能干细胞诱导免疫耐受能力的msc和BM-MSCs是基本标准,使他们一个有前途的来源的细胞移植治疗移植物抗宿主病(GVHD) [42,43]。最近,陈等人表明CD4细胞的增殖⁺和CD8⁺t细胞的数量随着减少促炎细胞因子干扰素-γ- 2和移植后的调控t细胞数量的增加与iPSC-MSCs胰岛细胞44]。我们之前显示iPSC-MSCs会抑制免疫反应一样BM-MSCs [10]。在当前的研究中,在Kindlin-2过度和击倒,iPSC-MSCs仍然可以显著降低CD4的数量⁺t细胞(图7(一))和促炎细胞因子(和干扰素- - 2γ)分泌(数据7 (b)和7 (c))。这表明Kindlin-2过度击倒并没有消除iPSC-MSCs的有益作用和BM-MSCs抑制免疫反应。

5。结论

根据我们的假设,我们发现Kindlin-2过度增加的增殖潜力iPSC-MSCs用更少的细胞凋亡和增强他们的迁移潜力和粘附VCAM-1 / SDF-1α在剪切应力增加cxcr的表达。我们还表明,Kindlin-2过度降低的能力iPSC-MSCs分化成脂肪形成的,具备干细胞成骨的,或chondrogenic血统,而保持标记。我们的研究结果表明,功能iPSC-MSCs降低cd - 4的扩散的能力⁺t细胞,减少促炎细胞因子(IFN -γ和2)在一个高钙测定仍完好无损,一般不受Kindlin-2修改。在一起,我们的数据显示,针对Kindlin-2 iPSC-MSCs打开一个新方法对cell-therapeutic方法采用功能增强的msc。

信息披露

托拜厄斯Cantz和Reinhard Henschler去年作者共享。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢整理张(北京大学健康科学中心)为他支持Kindlin-2构造和阿克塞尔Schambach(汉诺威医学院)与慢病毒载体对他的支持。作者感谢马提亚Ballmaier和汉诺威医学院的流式细胞术单位的技术援助。他们也感谢Irina Eberle(法兰克福大学)对她的帮助在设计项目以及Verena普拉特和Angelika Helmbrecht(路德维希马克西米利安大学、慕尼黑)的技术援助。部分的研究资助通过卓越的重生集群DFG (EXC 62/2),研究基金由路德维希Maximilans大学,慕尼黑马克斯·普朗克分子生物医学研究所,德国明斯特。

补充材料