等离子体富含生长因子诱导细胞增殖、迁移、分化和细胞脂肪中提取干细胞的生存

文摘

脂肪干细胞(对asc)是一种有前途的治疗选择组织修复的各种临床应用。然而,限制细胞生存,微分组织集成和无向在一个充满敌意的微环境细胞分化移植后并发症,需要细化。等离子体富含生长因子(PRGF)富含血小板血浆有利于人类和犬类ASC生存、增殖,延缓人类衰老ASC和自吞作用与血清相比,文化。此外,狗和人为对asc有效地分化为骨细胞,脂肪细胞或软骨细胞PRGF的存在。PRGF治疗诱发一种蛋白激酶的磷酸化防止ASC死亡引起的致死浓度的过氧化氢。事实上,一种蛋白激酶抑制废除了ASC PRGF凋亡预防暴露于100年μ过氧化氢的M。在这里,我们表明,犬对asc PRGF刺激反应类似于人体细胞对细胞生存和分化对狗的使用作为一个合适的转化模型。总的来说,PRGF将用作血清替代品间充质干细胞扩增改善细胞分化和作为预处理剂,以防止氧化细胞死亡。

1。介绍

脂肪干细胞移植(ASC)已经证明了有效性和仍然是一个重要的研究和发展大道由于他们非凡的治疗能力。ASC移植已经显示出非凡的恢复能力反映在患者的显著恢复功能的一系列疾病,如帕金森症、老年痴呆症、脊髓损伤、心脏病、风湿性关节炎(1]。然而,新方法对ASC隔离和放大了(2- - - - - -4),产生足够的干细胞临床应用优化(5]。然而,缺乏信息ASC移植后生存有助于进一步调查的ASC移植前数量和质量。例如,ASC激活与之前定义的刺激移植可能加强ASC修复功能和提高再生治疗的成功率。最近的研究集中在增加产量,效率,和治疗能力的ASC通过生长因子治疗PDGF和bFGF [6- - - - - -8]或为间充质干细胞xeno-free替代扩张(5,9]。内源性生长因子是等离子体的主要来源丰富的生长因子(PRGF)从富含血小板血浆10]。PRGF已广泛应用于许多物种减少治疗时间,提高组织再生(7,11]。PRGF有利影响是通过控制调节α颗粒的脱粒血小板(12,13包含几个重要的生长因子,刺激细胞生长,增殖,分化14,15]。PRGF刺激未分化的干细胞增殖和分化,并被用于组织再生(8,16- - - - - -18]目的。未分化的干细胞迁移到platelet-releasing生长因子引发的浓度扩散的细胞在该网站19]。此外,血小板源生长因子增强ASC的严厉20.)是作为一种黄金标准提出的胎牛血清代替人类细胞传播方法临床应用[5,21,22]。此外,PRGF也显示出协同属性间充质stem-induced分化的加速骨(23]或软骨修复(24]。

减少老化ASC的文化代表着一个重大的挑战为自体组织工程特别是细胞方法在老年患者25]。新方法被认为是为了避免ASC衰老延长体外扩张或诱导分化避免,例如,肥厚性表型chondrocytes-induced分化过程(26),通过迫使hTERT的表达,端粒酶活性诱导,延长寿命的间充质细胞的文化。之前的报告数据显示,hTERT-transduced间充质干细胞在体外长期复制能力并保持adipo,细粒,成骨分化潜能体外和体内成骨的潜力27,28]。重要的是,尽管没有证据表明肿瘤细胞形成或转化,nongenetic操作将更适合进一步潜在的临床应用。

丝氨酸/苏氨酸激酶AKT代表了一个初始信号节点内所有高等真核生物细胞对生存的规定,作出重要贡献的增长,增殖,血管生成,许多细胞类型和新陈代谢29日]。AKT激活在ASC [PRGF提高存活率和再生功能30.]。此外,条件反射的ASC诱导AKT活动增加细胞生存和proangiogenic能力(31日]。细胞生存信号的感应,比如一种蛋白激酶,也赋予抵抗敌意环境如与炎症反应有关,诱导细胞死亡的氧化应激(32]。

2。材料和方法

2.1。ASC隔离和文化

脂肪组织收集从狗和人类都是患有骨关节炎,和被兽医和医生在手术室进行,分别。10 g活检患者皮下脂肪的狗(8)或从suprapatellar脂肪垫人类患者(33收集, (狗)和 (人类)。所有程序都是在无菌条件下进行,脂肪组织是放在无菌锥形管包含无菌生理盐水。实验程序狗不需要动物伦理委员会评估的过程只包含一个转让对asc放大细胞移植所需的一部分,为此,狗主人自愿签署知情同意使用多余的脂肪组织利用对asc的推导和进一步的研究目的。人类样本匿名,这实验过程评估和接受的地区临床研究伦理委员会与药品和医疗产品的代码实践2014/01。排除标准,没有样本收集患者癌症和传染病的历史的时候手术(细菌或病毒)。所有的人类患者自愿签署知情同意文档使用多余的脂肪组织和捐赠外周血(20毫升)收集含柠檬酸钠管PRGF隔离后准备Anitua等描述的标准化方法。14),汇集减少个体差异和存储−20°C。

脂肪组织从手术房间在一个封闭包在4°C无菌溶液和萃取后24小时内到达实验室。每个样本被多次在PBS +抗生素清理组织,消除残留血液。脂肪组织被置于无菌培养皿(10 g脂肪组织培养皿中每100毫米),在一个解决方案包含PBS,青霉素100单位/毫升和100年μg / ml链霉素(Gibco 15140),胶原酶类型我(0.07%,Sigma-Aldrich C9891 CA,美国),和dispase我(0.2毫米,Sigma-Aldrich)。脂肪组织是手工切成小块用无菌手术剪刀在层流罩和转移到为隔夜消化细胞瓶瓶在37°C、O的20%₂,5%的公司₂。第二天,消化脂肪组织收集和清洗多次PBS系列离心加抗生素。细胞颗粒resuspended在生长介质(包含2毫米的DMEM谷酰胺,L-glucose 30%,青霉素100单位/毫升、和100年μg / ml链霉素),+ 10%胎牛血清(的边后卫)犬或10%人类血清样本(HS)人类样本。第二天,中被删除,取而代之的是新鲜的媒介和连接细胞被允许成长直到近汇合的然后受到细胞增殖、生存研究和细胞分化化验。

2.2。细胞增殖实验

在章节3 - 4,狗和人类对asc, 10⁴细胞被播种在24-well板块的边后卫或商品的10%,分别为24小时。中替换为0,1,2.5,5或10%的边后卫或商品或PRGF-containing介质和细胞保持在24小时孵化文化。细胞量化,每一个在纽鲍尔®室使胰蛋白酶化和计算。三个独立的实验进行了一式三份。数据被表示为平均数±标准差。

2.3。细胞迁移和入侵分析体外试验

伤口愈合的细胞移植诱导体外的划痕进行IncuCyte®S3 live-cell分析(34,35]。15×10⁵对asc被播种在96孔板单层细胞培养的10%的商品。播种后24小时内,刮当时执行在所有井使用WoundMaker工具。然后,媒介商品或PRGF取代0%,2.5%或10%的商品或PRGF一式三份。细胞生长和迁移在相差显微镜检查连接到一个延时监测记录系统在挠,期间每小时16 h。一幅画在每个实验条件从四个不同的领域被记录为延时重建和量化添挠区域的细胞密度。图像分析软件自动执行的相关报道后数学分析(35]。结果显示为均值±SD %的相对密度在每一个实验条件。

2.4。Senescence-Associated苷(SA)β加)活动

细胞被播种在2000细胞/厘米²six-well盘子的10%的商品。播种后24小时内,介质代替PRGF 2.5%, 2.5%的商品,商品10%,或0%的PRGF或商品。孵化后48小时,细胞被固定在4%多聚甲醛10分钟和SA的化验β加活动描述Debacq-Chainiaux et al。36]。SAβGal-positive细胞数与最小的200个细胞的整体状况。三个独立的实验进行。数据被表示为均值±SD的百分比的比率βGal-positive细胞内总化验细胞培养。

2.5。透射电子显微镜和自噬体量化

细胞被播种在2000细胞/厘米²Lab-Tek室幻灯片(Nalge Nunc国际内伯威尔市,IL)的10%的商品。播种后24小时内,介质代替PRGF 2.5%, 2.5%的商品,商品10%,或0%的PRGF或商品。孵化后48小时,细胞被固定在3%戊二醛1小时37°C。OsO细胞柱固定在2%₄1小时在室温和染色在1%醋酸双氧铀在黑暗中在4°C 2 h。最后,细胞在蒸馏水冲洗,在乙醇脱水,渗透在Durcupan树脂(丙烯酰胺,Sigma-Aldrich,圣路易斯,美国)。聚合后,嵌入文化脱离商会幻灯片和粘在环氧树脂块。串行semithin部分(1.5μ米)削减了一个超切UC-6(徕卡、海德堡、德国)和安装到幻灯片和1%甲苯胺蓝染色。选择semithin部分与超级Glue-3粘,乐泰(德国汉高,杜塞尔多夫,德国)环氧树脂块和脱离的载玻片重复冻结(液氮)和解冻。超薄部分(0.06 - -0.08μ米)准备与柠檬酸铅进行超剪切和染色。最后,在透射电子显微镜显微照片得到范Tecnai G2精神(范欧洲、埃因霍温、荷兰)使用数码相机Morada(奥林巴斯软形象GmbH是一家现代化的、可靠的解决方案,明斯特,德国)。自噬体形态学鉴定()和量化至少10个不同的图片,在平等的放大,每个实验条件和归一化总细胞面积使用ImageJ软件在像素(px²)。三个独立的实验,数据被表示为平均数±标准差的自噬小体/细胞总面积(px²)。

2.6。ASC-Directed分化

汇合的狗和人类对asc通道4受到直接向脂肪细胞分化,骨细胞、软骨细胞(37]。所有三个分化过程并行执行解冻PRGF + 2.5%肝素(40 U)或肝素。定向分化的媒体都是来自Lonza集团有限公司

2.6.1。脂肪生成

对asc被播种的细胞密度10000细胞/厘米²融合性的,当对asc是> 90%,生长介质改为分化培养基含有胰岛素,地塞米松,IBMX (3-isobutyl-methyl-xantine)和吲哚美辛(脂肪干细胞基础培养基;Lonza Group Ltd .)。细胞培养10 - 12天。脂肪形成的分化是由油红O染色评估formalin-fixed脂质空泡的文化。

2.6.2。骨生成

对asc被播种的细胞密度10000细胞/厘米²在胶原蛋白I-coated板块(Sigma-Aldrich;10毫米)中含有0.1μ50 M地塞米松,μM Asc2P, 10毫米μ甘油磷酸酯(成骨的基础培养基;人类血清Lonza Group Ltd .)为10%。ASC文化维持在这个媒介4周(每3天与介质的变化)。检测细胞外钙沉积,茜素红染色用于formalin-fixed文化。Immunodetection,通过免疫荧光,进行检测肌动蛋白丝phalloidin和骨细胞联接蛋白43。

2.6.3。软骨形成

使用micromass软骨细胞的分化了。从高浓度的ASC在最小体积(1×10⁵细胞/ 100μTGF - l)的存在β1和3 (10 ng / ml), Asc 2 p (50μ(6.25 M)和胰岛素μg / ml) (Chondro BulletKit;对asc Lonza Group Ltd .),这些培养了四个星期在这个媒介,媒介变化每3天。阿尔新蓝被用来检测存在的浓缩硫酸在细胞外基质蛋白聚糖。在染色之前,micromass文化在福尔马林固定,石蜡嵌入式,切成5μ米的部分。

2.7。免疫细胞化学

ASC单层是固定的4% PFA在室温下15分钟,permeabilized Triton x - 100 0.1%,随后封锁了10%的边后卫。从chondrocyte-induced Micromass部分分化以前脱蜡。孵化后的抗体主要是表现在一夜之间(1:200)在4°C:联接蛋白43 (Abcam;英国);Sox9(美国Chemicon)。脱掉初级抗体和彻底清洗后,下列二次抗体之一(1:400)添加和孵化1 h在室温下;俄勒冈州绿色488山羊anti-mouse免疫球蛋白或Alexa萤石647鼠标anti-rabbit(美国热费希尔科学)。用FITC Phalloidin共轭(1:1000;英杰公司、美国)孵化前45分钟可视化。所有的细胞都被孵化4复染色,6-diamidino-2-phenylindole盐酸盐(DAPI)分子探针(美国英杰公司)在室温下3分钟紧随其后清洗步骤。 Samples were mounted using FluorSave Reagent (Calbiochem, USA). Confocal Microscopy (Leica, Germany) was employed to visualize the signals; at least six different fields per condition and assay were analysed.

2.8。ASC治疗和生存研究过氧化氢的存在

H₂O₂(美国Sigma-Aldrich)和AKT抑制剂(美国Calbiochem;一种蛋白激酶抑制剂八世124018;10μ从1 M和M)是刚做好的10毫米股票的解决方案,分别。PRGF和H₂O₂结合治疗同时孵化。AKT抑制剂是preincubated辅助治疗前30分钟。

细胞的生存能力是96年由CellTiter®水非放射性细胞增殖测定(WI Promega有限公司麦迪逊,美国)后,制造商的指示。简单地说,10⁵对asc在章节2 - 5被播种到96 -孔板和允许在生长培养基生长24 h。删除后生长培养基,细胞治疗与PRGF(0或2.5%,加上40 U的肝素),商品的2.5%,H₂O₂(100μ米),和/或AKT抑制剂(美国Calbiochem;一种蛋白激酶抑制剂八世124018;10μ米)24 h在缺乏血清。每一个条件是化验一式四份在三个不同的实验。细胞的生存能力,在每一个化验条件表示为平均数±标准差之比的百分比。

2.9。膜联蛋白V检测通过流式细胞仪分析

对asc使胰蛋白酶化,10⁵细胞每条件被稀释到100年μl PBS和孵化1:50稀释的膜联蛋白V-FITC-conjugated抗体(美国英杰公司)在黑暗中在室温下了45分钟,然后洗了三次PBS和resuspended 0.3毫升的流式细胞术分析冷PBS(美国贝克曼Cultek FC500)。膜联蛋白的平均数±标准差V-positive人口(百分比)的测试样本。

2.10。免疫印迹分析

的收集也和蛋白质提取利用裂解缓冲(50 mM Tris-HCl, pH值7.5,150毫米氯化钠,0.02% NaN₃0.1 SDS NP40 1%, 1毫米EDTA, 2μg / ml亮抑酶肽,2μg / ml aprotinine、1毫米PMSF和1 x蛋白酶抑制剂鸡尾酒(美国罗氏诊断))。等量的蛋白质提取物(20μg)加载到10% SDS-polyacrylamide sds - page凝胶和解决标准。蛋白质电泳转移到PVDF膜。膜被封锁PBST 60分钟5%的脱脂牛奶和孵化后一夜之间的特定主要抗体(1:1000):PARP(英国Abcam);P-AKT、AKT或细胞周期素D(细胞信号,美国)。β肌动蛋白(1:5000)(美国Sigma-Aldrich)被用作加载控制。随后,膜与兔子anti-mouse孵化或兔抗体辣根peroxidase-conjugated二级抗体(1:5000)(美国Sigma-Aldrich)。屁股被ECL可视化检测系统(英国Amersham)。

2.11。统计分析

通过对评估学生的统计比较t以及。所有值来自小动物——一张长有统计使用SPSS 11.5软件进行测试。的值 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。对asc PRGF诱导增殖和迁移

人类对asc浓度日益增加的商品或PRGF(1、2.5、5、或10%),24 h,表现出显著的增殖与缺席相比增长因素(0%;图1(一)离开图; )。10%的PRGF诱导增殖率最高,HS增殖活动(图明显不同1(一)离开图;^美元 )。代表人类对asc的相衬显微镜的图像存在10%的商品或PRGF如图1(一)(右)。同样,在一个细胞入侵检测,10%的PRGF诱导细胞迁移活性最高,相比明显不同与ASC HS(图的存在1 (b),左图像)。代表传真电报从延时分析,16个小时后PRGF或海关处理,证明细胞密度的增加和加速伤口入侵PRGF诱导10%(图1 (b),对面板)。犬对asc显示可比人类对asc回应。10%的狗PRGF诱导更高的增殖率相比,包含狗的边后卫ASC文化(补充图可以在网上https://doi.org/10.1155/2017/5946527)。

3.2。PRGF减少衰老和体外扩大ASC自吞作用

体外扩增对asc显示被限制在一定数量的段落构成限制生成足够高的细胞数量在临床使用。事实上,细胞改变发生在体外老化已经提出对asc上类似于观察到的差异从年龄和年轻的捐助者38]。有越来越多的证据表明,细胞衰老的一个原因是干细胞衰老和恶性肿瘤(39]。在此,我们报告,2.5%的PRGF减少人类对asc在饥饿的衰老,在缺乏生长因子,而不是商品的当量浓度,与生长因子的总缺席相比(图2(一个))。同样,自噬小体的大量积累,细胞衰老的特征(40),缺乏生长因子诱导的显著预防2.5%的PRGF而不是相同浓度的HS(图2 (b);图)。透射电子显微镜图像显示代表一个广泛积累自噬小体体()和液泡($)在完全缺乏生长因子和更少的扩展,但也重要,对asc的HS(图的2.5%2 (b);上面板)。剂量反应的PRGF减少衰老和自吞作用是化验也PRGF的5 - 10%,与2.5%相比,未发现显著差异PRGF(数据没有显示)。

3.3。PRGF加速ASC-Directed体外分化的脂肪细胞,骨细胞和软骨细胞

人类的存在对asc PRGF向脂肪细胞分化更迅速,骨细胞和软骨细胞(数字3(一),3(b)和3(c))。人类对asc被诱导分化成三个中胚层细胞系,PRGF存在与否的2.5%定义为每一个谱系分化的媒介。导演脂肪生成显示快速积累fat-containing在存在PRGF,可视化和量化的油红O染色(图3(a))。骨细胞分化的PRGF更加健壮和加速。PRGF治疗导致Cx43表达的增加,一个已知的标志成熟的骨细胞,四个星期的含钙骨细胞分化过程和更高数量的细胞簇证明了茜素红染色量化(图3(b))。对asc向软骨细胞分化显示高表达Sox9的PRGF(图3(c),右面板)。此外,细胞数量和密度增加PRGF的存在,与胶原蛋白的浓缩micromass文化为软骨细胞诱导阿尔新蓝染色(图的可视化和量化3(c),左面板)。犬PRGF也提高了收益率定向分化过程进入脂肪细胞,骨细胞和软骨细胞的代表图片所示补充图 。

3.4。PRGF展品改善耐过氧化氢对asc人类的细胞毒性AKT归纳

急性发作的氧化应激刺激对asc[细胞增殖41];然而,高剂量或延长暴露于低剂量的活性氧,大大降低ASC可行性(42]。治疗100μM H₂O₂对asc 24小时显著毒性对人类缺乏生长因子(图4(一))。一致认为cytoprotective PRGF的影响,量化的细胞生存能力PRGF透露,在2.5%,但不是2.5%的商品,PRGF显著预防明显受损的细胞死亡的100人μM H₂O₂(图4(一))。

药物抑制AKT的预培养30分钟和10μ抑制剂的八世124018 (Calbiochem)屏蔽保护作用的2.5%对asc PRGF在暴露于毒性H₂O₂剂量(图4 (b))。此外,凋亡细胞的人口的比例,量化表达的膜联蛋白V,决心在PRGF的存在与否和治疗H₂O₂单独或与一种蛋白激酶抑制剂。结果表明,PRGF通过激活诱导细胞生存的一种蛋白激酶抑制以来AKT导致相当数量的膜联蛋白V-positive细胞,包括那些在PRGF(图4 (c))。

以来对asc需要营养因素在缺乏PRGF或商品,有增加基底激活细胞凋亡就是明证PARP的乳沟,蛋白质与细胞凋亡信号的感应43)(图4 (d))。此外,PRGF封锁了诱导PARP劈理的存在对asc处理时100μM H₂O₂。在PRGF面前,磷酸化AKT(活跃的形式)和细胞周期素D (AKT的下游效应)表示当PARP没有被裂解。

4所示。讨论

对asc和PRGF一直显示为有前途的治疗选择mesoderm-related组织修复的组织,例如,在受损的软骨的修复骨关节炎。对asc很容易扩大在文化和有能力区分的多功能性质在各种成熟细胞谱系允许复制体外过程,如成骨、软骨形成,或脂肪形成44]。然而,仍然有很多不确定的信息体外扩增,行为的移植细胞的细胞生存,组织集成,或在一个充满敌意的微环境细胞分化。如今,PRGF提供已知的自体来源再生能力能够提高协同ASC治疗的好处。PRGF有利于ASC扩散(7,8),能够刺激未分化的干细胞分化为组织再生(17,45]。未分化的干细胞迁移到PRGF生长因子的浓度梯度,和这些细胞的生长因子触发扩散一旦现场管理(46]。对asc PRGF的组合使用,已经显示了改善工人福利的组织修复过程,包括骨关节炎或通过加速骨化的骨折47- - - - - -49]。

细胞移植的效率直接取决于细胞存活、细胞衰老和细胞命运的规范。复兴的主要报道了岁的祖细胞暴露于一个年轻的或再生环境通过减少细胞衰老(50]。最近的研究表明,血液从年轻的捐助者可以逆转衰老相关疾病基于实验的血液转移从岁年轻的老鼠可以恢复组织在年老的动物50- - - - - -52]。在分析几种循环因素,Loffredo et al。52)建议GDF11可以负责这些影响。最近,好等。53]表明GDF11集中在至少10倍比血清或血浆中血小板溶解产物,表明GDF11存储在血小板贡献最可能微分PGRF对细胞增殖的影响,细胞分化,细胞老化(54]。我们已经观察到显著依赖于一种蛋白激酶信号激活与生存反应对asc在缺乏生长因子和氧化损伤。PRGF诱导一种蛋白激酶的磷酸化对asc显著提高细胞生存当暴露于proapoptotic过氧化氢的浓度。过氧化氢是用来繁殖发现氧化应激损伤和移植区。inflammatory-related氧化应激事实上妥协的细胞功能和生存整个关节,包括软骨骨关节炎的患者(55]。在这种背景下,PRGF治疗可以防止细胞死亡相关的氧化应激诱导prosurvival信号联合AKT激活的(56]。

对骨关节炎的效率对asc已经探测功能有了显著的改善。狗提供一个合适的骨关节炎平移模型进行进一步的临床研究,与组织病理学和功能特性57]。我们最近在一项随机研究显示在犬类患者中度到重度骨关节炎,关节内的移植的ASC提供了一个重要的关节功能改善,减少狗的疼痛和改善身体功能六个月(58,59]。事实上,从犬样本还测试了体外对asc, PRGF,我们发现了一个类似的细胞增殖反应,生存和分化中发现人类对asc(补充图)。体外实验的基础上,显著改善预计将对asc激活PRGF刺激;然而,需要进一步的体内分析披露。因此,对asc在文化用PRGF预处理移植前可能带来改善生存,细胞增殖和凋亡能力和呈现一个强大的来源细胞治疗和组织再生。狗和人类对asc显示类似的回应PRGF细胞增殖,细胞分化,AKT归纳。因此,狗为进一步的临床研究提供合适的转化模型ASC-based治疗。

5。结论

对ASC PRGF治疗是一种潜在的刺激,可以作为自体预处理剂增强ASC移植的治疗潜力。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

理查德•j . Griffeth蒙特塞拉特加西亚,雷蒙Cugat,维多利亚Moreno-Manzano Maravillas Mellado-Lopez,和穆Meseguer-Ripolles收集和/或装配、分析和解释数据。蒙特塞拉特加西亚,雷蒙Cugat,维多利亚Moreno-Manzano给了他们的金融支持。Maravillas Mellado-Lopez和理查德•j•Griffeth同样这项工作。

确认

作者特别承认Fundacion加西亚Cugat金融和各种智力支持。这项工作也支持Ministerio de隐藏y Competitividad(批准号CONSOLIDER-INGENIO 2010 csd2008 - 00005)和MINECO(批准号mat2015 - 66666 - c3 - 1 - r)。

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