文摘
间叶细胞的祖细胞特征与特定功能可以识别祖人口免疫力正在积极接受调查。祖细胞从骨髓和脂肪组织调节巨噬细胞(MΦ)炎症反应通过促进从炎症的抗炎表型。相反,间叶细胞祖细胞的小鼠主动脉(毛)支持和贡献MΦ炎症条件下反应。我们使用细胞系与传说中的对立的免疫调节功能,骨髓衍生间充质祖细胞系(D1)和小鼠主动脉派生间充质祖细胞系(毛)。的交互和监管MΦ细胞炎性介质反应、脂多糖(LPS),被coculture检查。正如所料,D1细胞抑制肿瘤坏死因子-α,IL-12p70生产但MΦ吞噬活动保持不变。毛细胞增强和TNF -α生产coculture和增强MΦ吞噬活动。使用流式细胞仪和PCR数组,然后试图识别套MSC-associated所表达的基因和标记这些祖人群。我们已经确定,immune-supportive间叶细胞祖细胞高表达chondrogenic和tenogenic转录因子在免疫抑制间充质祖细胞高表达脂肪形成的和成骨的转录因子。这些数据将用于隔离,净化,和修改的间叶细胞祖细胞用于治疗炎症性疾病。
1。介绍
多功能基质细胞也被称为间充质干细胞(MSC)最初nonhematopoietic干/祖细胞从骨髓分离产生结缔组织的胚胎和成年哺乳动物组织中1]。MSC是活跃的组织通过替换受损细胞的修复,但最近他们的免疫调节特性研究[1,2]。由于其抑制能力和调节炎症通过直接和间接接触t细胞和巨噬细胞细胞,MSC很适合用于细胞治疗炎症性疾病。II期和III期临床试验研究MSC治疗移植物抗宿主病的治疗用途,克罗恩病、进行性多发性硬化,肾移植排斥反应,缺血性心肌病在进步3]。
MSC抑制t细胞反应减少他们的扩散4,5),诱导细胞凋亡6),和支持监管t细胞的分化表型(7]。MSC调节巨噬细胞细胞(MΦ)没有被广泛研究和当前的研究不同的结果。MSC来源于骨髓,脂肪,和胎盘组织促进抗炎巨噬细胞的分化表型(8- - - - - -10]。另一方面,macrophage-associated MSC还可以显示一个炎性表型(11),最近的研究显示,间叶细胞祖细胞从老鼠主动脉(毛)的贡献和支持炎症巨噬细胞(12]。MSC表型特征,造成他们的消炎正在积极调查,许多最近的研究探索异质性之间的关系在表面抗原表达和功能性质的非均质性以及MSC (13]。
在这项研究中,我们比较的能力毛间充质祖和骨髓间充质祖细胞系(D1) MΦ调节炎性反应。毛和D1细胞与骨髓衍生cocultured MΦ和暴露在脂多糖(LPS)。一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-12 (il - 12)被用作标记的炎症。此外,我们审查的影响coculture MΦ吞噬指数的针对酵母聚糖曝光。然后,为了他们的免疫调节能力表型相关资料,我们测量了MSC表面抗原CD44, CD73,本来,CD105、CD106使用流式细胞仪和测量使用PrimePCR MSC-associated基因的表达间充质干细胞PCR基因阵列。
2。材料和方法
2.1。材料
所有细胞培养基、胰蛋白酶的边后卫,抗生素/抗真菌的解决方案获得表达载体(CA)卡尔斯巴德。l - 929纤维母细胞(CCl-1)从美国购买类型组织集合(弗吉尼亚州马纳萨斯)。FITC鼠anti-mouse CD44(猫。105 # 553133)、PE鼠anti-mouse CD(猫。# 562759)、PE鼠anti-mouse Ly-6AE(本来)(猫。# 561076),FITC鼠anti-mouse CD45(猫。# 553080),FITC鼠anti-mouse CD106(猫。# 553332)、PE鼠anti-mouse CD73(猫。# 557041),FITC鼠anti-mouse CD11b(猫。# 553310)购买的BD生物科学。 Gamma irradiated LPS from大肠杆菌(# L4391)和其他化学药品和试剂购自Sigma-Aldrich(美国)除非另有说明。
2.2。动物
所有动物协议批准温斯洛普大学医院的动物保健和使用委员会和遵守法规由美国国立卫生研究院的概述。雄性小鼠获得Taconic C57BL / 6,北美。动物被安置在当地动物园的条件下(12 h光暗周期),允许适应实验前至少7天。小鼠安乐死在有限公司2在8 - 12周的年龄和主动脉和后肢被移除,准备细胞隔离。
2.3。细胞培养
2.3.1。主动脉间充质祖细胞系(毛)
小鼠主动脉祖行来自C57BL / 6小鼠使用da Silva Mierelles法[14]中描述与轻微的修改15]。
2.3.2。骨髓间充质祖细胞
(D1) D1 ORL UVA (D1)细胞,骨骨髓来源间充质干细胞系,得到来自美国文化类型集合(写明ATCC # crl - 12424)和维护在DMEM补充10%的边后卫,100 U /毫升青霉素钠、硫酸链霉素100 U /毫升、和0.25µ克/毫升两性霉素B。
2.3.3。来源于巨噬细胞的骨细胞(MΦ)
骨髓的后肢C57BL / 6小鼠是孤立如前所述16]。创建一个单细胞悬液后,有核细胞数使用3%醋酸/台盼蓝排斥和镀与10%胎牛血清的DMEM补充的边后卫,15% L929成纤维细胞条件培养液,100 U /毫升青霉素钠、硫酸链霉素100 U /毫升、和0.25µ在10 g / mL两性霉素B7细胞培养皿中每100毫米。的L929条件培养基制备写明ATCC所显示。l - 929细胞系生产- csf支持从骨髓巨噬细胞的生长和分化。3天后,一半中被删除,取而代之的是新鲜的媒介。一个完整的媒介变化是6天完成。在第七天文化单核细胞/巨噬细胞细胞山肩根据实验目标,通过或冻结,并储存在液氮(LN2)。文化到通道2被用于实验。
2.3.4。Coculture
毛细胞启动的密度为1.5×104/厘米2和D1发起的密度为3.25×103/厘米2。细胞开始在不同密度在同一密度,因为当镀D1细胞将达到融合。为了开展coculture实验与细胞群具有相同的时间表,有必要启动D1细胞密度较低。他们有相似的细胞数量在融合。间充质祖文化达到融合时,添加了MΦ密度为1.0×105/厘米2并允许附加在一夜之间。文化被洗与血清DMEM补充0.02% BSA然后不及时治疗或治疗与有限合伙人(100 ng / ml) 24小时新鲜血清DMEM / BSA的0.02%。文化上层清液被收集并存储在−80°C到化验。
2.4。流式细胞术
染色的毛泽东MSC和D1 MSC表面标记,单细胞悬浮体第一次孵化与Fc受体阻断剂(Miltenyi研究)其次是染色表面抗体标记CD29、CD44, CD73, CD105、CD106,本来(Ly-6AE),在4°C和CD45 30分钟。孵化后,细胞被洗两次洗缓冲区(1%的边后卫在PBS)和分析Accuri C6流式细胞分析仪。
2.5。亚硝酸盐测量
亚硝酸盐,一氧化氮(NO)的反映生产、测定细胞培养上清液中使用格里斯试剂系统(Promega,麦迪逊,WI)根据制造商的指示。
2.6。分泌细胞因子和趋化因子的测量
肿瘤坏死因子-α文化和IL-12p70细胞因子测定上层清液使用Ready-SET-Go !从eBioscience ELISA试剂盒(CA)圣地亚哥。
2.7。吞噬作用分析
毛泽东和MΦMΦ和cocultures MΦ/ / D1发起4室的幻灯片和孵化过夜。Zymosan-A酿酒酵母BioParticles®,荧光素共轭(分子探针),添加5和10每MΦ颗粒细胞和孵化了45分钟。钱伯斯被轻轻冲洗4 x冷PBS和固定在4%多聚甲醛(PFA)其次是安装在坚决的DAPI安装介质(矢量实验室)细胞核染色。十到十二个荧光数码显微图拍摄的胞内zymosan-A每个文化类型和分析。吞噬细胞分为团体根据摄取粒子的数量和数据表示为[1 - 5],[6 - 10],[11 - 15号],[16 +]粒子每个细胞。
2.8。基因表达
2.8.1发布。基因阵列
PrimePCR间充质干细胞(SAB目标列表)PCR基因从Bio-Rad数组是用来比较基因MSC的毛和D1文化。RNA提取使用试剂盒试剂从文化(英杰公司)根据制造商的指示。量化后,2µg总RNA反转录使用iScript先进互补脱氧核糖核酸合成装备(Bio-Rad)。反应混合制备定向使用Sso先进通用SYBR绿色supermix (Bio-Rad)生产20 ng cDNA /反应在PCR数组。
2.8.2。实时逆转录聚合酶链反应
实时逆转录聚合酶链反应进行了使用Sso高级通用SYBR绿色supermix和实时PCR系统从Bio-Rad CFX96联系。引物序列是特定的鼠标:Pparg向前5′-CGGGCTGAGAAGTCACGTT-3′Pparg反向5′-TGTGTCAACCATGGTAATTTCAGT-3′, Sox2向前5′-GATCAGCATGTACCTCCCCG-3′Sox2反向5′-TCCTCTTTTTGCACCCCTCC-3′, Sox9向前5′-GGGCGAGCACTCTGGGCAAT-3反向5′′Sox9 -CGTCGCGGAAGTCGATGGGG-3′,并Runx2 5′- CCCTGAACTCTGCACCAAGT-3′Runx2反向5′-TGGAGTGGATGGATGGGGAT-3′。PCR条件95°C 5分钟紧随其后40 95°C的周期10年代,55°C, 10 s, 72°C 30年代。
2.9。统计分析
除非另有指示,使用单向方差分析的数据进行了分析。Bonferroni期末测验是用来确定统计组之间的差异。
3所示。结果
3.1。当与MΦCoculture,毛MSC增强而D1 MSC抑制LPS-Induced炎症
一氧化氮(NO)是一种炎症的标志,是由MΦ在急性炎症刺激反应(17),但也可以由MSC调节t细胞(2,18]。先前的研究已经表明,毛祖细胞产生没有协同coculture MΦ[12]。尽管许多先前的研究已经确定,骨髓祖细胞抑制MΦ炎性细胞因子的分泌,有一个缺乏研究,检查生产没有cocultures的骨髓祖细胞和MΦ派生而来。相比我们的生产没有在D1 / MΦ与毛/ MΦcocultures后接触有限合伙人。
正如前面决定(12),毛/ MΦ文化没有产生协同水平显著高于MΦ或毛细胞单独培养(~ 28μ毛在MSC / MΦ与~ 11µM MΦ~ 5µ在毛泽东MSC,)(图1(一))。在t细胞的研究中,没有由MSC导致免疫抑制t细胞在附近19]。MΦ也使用没有调解细胞毒性的影响但也容易受到细胞凋亡在接触。是否在毛/ MΦ交互的情况下提高生产导致MΦ凋亡和随后的先天免疫反应的抑制和/或有助于抑制t细胞的反应还有待确定。相比之下,D1 / MΦcoculture生产相比大大减少没有MΦ文化(~ 5µ米在D1 / MΦ与~ 11µ在MΦM,)(图1(一))。显著降低生产D1 / MΦ文化符合先前的研究表明骨髓间叶细胞祖细胞促进的开关MΦ炎症的抗炎表型(8,9]。
(一)
(b)
(c)
IL-12p70和肿瘤坏死因子-α不表达的间叶细胞祖细胞(12,20.,21),因此这些细胞因子被用来检查炎症的MΦ在coculture毛和D1祖细胞。细胞因子分泌的cocultured细胞相比,MΦ细胞单独培养。Coculture毛增加TNF -α分泌MΦ(~ 26 ng / mL MΦ与毛~ 32 ng / mL MSC / MΦ,)和在D1 / MΦcocultures显著降低(~ 18 ng / mL D1 / MΦ与MΦ~ 26 ng / mL,)(图1 (b))。IL-12p70分泌毛/ MΦ文化没有明显偏离MΦ文化(~ 2.8 ng / mL和~ 3.2 ng / mL, resp。)(图1 (c))。另一方面,在D1 / MΦ文化中,il - 12的分泌显著减少(~ 3.2 ng / mL MΦ与D1 / MΦ~ 0.4 ng / mL,)(图1 (c))。这些数据证明D1骨髓祖细胞抑制而来自主动脉(毛)导致的炎症MΦLPS激活符合先前的作品(10,22]。
3.2。的吞噬指数MΦ增加针对酵母聚糖在Coculture毛
除了建立MΦ和间充质祖和信息交互的影响炎症环境,我们还研究了影响MΦ吞噬活动。已知MSC诱导增加MΦ吞噬作用一致的推广抗炎表型(23];然而,毛泽东和D1影响细胞对MΦ吞噬之前尚未确定。Zymosan-A粒子被添加到cocultures D1 / MΦ的密度和毛/ MΦ5和10粒子/ MΦ细胞水平低于饱和所确定的初步研究。摄入,细胞相关zymosan-A粒子数和结果作为代表不同层次的活动范围。增加活动的范围包括[1 - 5]、[6 - 10],[11 - 15号],[16 +]粒子每细胞摄取(数字2(一)和2(b))。转向右边的条形图(从低到高范围)与吞噬活动的增加。
与D1 Coculture没有影响MΦzymosan-A颗粒的吞噬作用在5或10每细胞颗粒;注意类似的模式在酒吧图表D1 / MΦ和MΦ图2(b)。此外,MΦcoculture的毛时,MΦ吞噬活动的增强,反映在转变的毛/ MΦ条形图向右MΦ相比,在图2(b)。综上所述,细胞因子和吞噬作用的数据分析表明,D1祖细胞抑制LPS-induced炎症通路对酵母聚糖诱导的但没有影响。然而同时支持LPS-induced和毛祖细胞zymosan-induced MΦ活动。
3.3。毛泽东和D1表型相关的资料和他们的免疫调节功能
毛在我们建立的免疫调节功能和D1细胞在coculture MΦ在炎症条件下,然后,我们试图确定他们的表型和基因型的配置文件。我们的目标是与他们的功能属性来表达间充质祖细胞相关的标记。
3.3.1。MSC-Associated抗原表达
正如预期的那样,为造血细胞群都是负面标记、CD45和CD11b。两种细胞类型也呈阳性MSC-associated抗原,CD29、CD44,本来,但不同的表达式CD73, CD105、CD106。D1细胞培养是异构的表情但不利于CD105和CD106 CD73标志。另一方面,毛细胞为阴性CD73 CD105和CD106(数字的和积极的3(一个)和3 (b))。MSC基因特定的反转录PCR结果数组CD73确诊的差异表达,CD105、CD106也发现CD90(表的微分表达式1)。
(一)
(b)
2006年,国际社会间充质干细胞和组织委员会发布的细胞治疗意见书概述MSC指定的最低标准人体细胞数量。MSC的最低标准必须能够多功能分化、白细胞特定抗原是负的,至少表达细胞表面标记,CD73, CD90、CD105 [24]。老鼠细胞,然而,没有明确的标准出现和MSC表面抗原表达差异有很多老鼠和人类细胞(25]。也有一个伟大的变化在报道MSC表面抗原表达和许多新的潜在识别抗原不断出现(26]。D1和毛细胞用于这些研究能够多功能分化(22),但有不同的表面抗原概要文件,因此我们使用术语间充质祖。
表达式的CD73 D1细胞炎性环境差别是符合他们对这些cocultures。CD73是5′ectonucleotidase,酶与CD39负责催化的第二步生成腺苷三磷酸腺苷的释放细胞到细胞外液。腺苷作用于腺苷酸受体表达在白细胞和一般抑制炎症反应(27]。CD73表示在MSC导致免疫抑制t细胞活动的自身免疫反应(28]。然而,由于CD73 D1细胞培养是异构的,直接证据的CD73 D1间充质祖MΦ监管是十分必要的。此外,由于其位置,表面抗原很可能参与信息监管间叶细胞祖细胞之间的交互和MΦ。因此,CD105的潜在角色和监管CD106毛祖细胞的功能也应该关注未来的调查。
3.3.2。PCR阵列分析
PCR数组用于我们与间充质干细胞相关研究包含了92个基因,包括上述表面标记基因。当关注的结果数组,我们使用30周期作为严格的阈值Cq值来确定表达式。然后我们分类(1)差异表达,表达差异(2)同样表示,或(3)表达的细胞群。只有基因≥3重表达差异被认为是不同的监管。原始的基因阵列数据补充文件中可以找到1(在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/5846257)。同样表达或不表达的基因两个细胞群被打折的原因反对免疫调节功能。然后我们将根据的差异表达基因功能或效用。使用的分类是MSC-associated表面抗原,转录因子,生长因子,矩阵/细胞粘附细胞骨架元素,和几种/杂项(表1)。
3.3.3。MSC-Associated基因表达模式
转录因子。转录因子基因的模式证明SRY-box包含基因2 (Sox2)表达在D1而不是毛祖细胞。过氧物酶体扩散者激活受体γ(Pparγ)和小牛相关转录因子2 (Runx2)也表现出更大的D1的表达比毛了8.12和7.26倍,分别。另一方面,生长分化因子7 (Gdf7 / Bmp12)、K(赖氨酸)乙酰转移酶2 b (Kat2B / PCAF),和SRY-box包含基因9毛(Sox9)高表达的细胞相比,D1(图4和表1)。使用实时逆转录聚合酶链式反应的技术,我们能够确认Sox2微分调节,Pparγ毛,Runx2 Sox9 D1和间充质祖数量(图4 (b))。
(一)
(b)
Pparγ是脂肪细胞的分化和葡萄糖稳态的关键调节器(32]。Runx2蛋白质对成骨细胞分化和骨形态发生至关重要,作为支架核酸和监管因素参与骨骼基因表达(33]。Sox2对成骨细胞的自我更新和增殖至关重要前体(34]。这些转录因子都是D1细胞中高度表达表明他们准备脂肪形成的和/或成骨分化。Gdf7 tenogenic分化的关键调节器的间充质干细胞(42]。Sox9是至关重要的对间充质凝结在软骨形成和抑制chondrogenic肥大而Kat2B / PCAF染色质组蛋白乙酰转移酶参与transactivation chondrogenic基因(25]。调节Gdf7言论,Kat2B / PCAF, Sox9表明毛准备chondrogenic / tenogenic分化。
生长因子。差异表达的模式生长因子基因在D1和毛祖人口符合的转录因子表达(图模式4(一)和表1)。骨伽马carboxyglutamate蛋白(Bglap)和骨形成蛋白2 (Bmp2)表达在D1细胞而不是毛细胞。Bmp2是一种成骨的标记及其表达诱导成骨细胞分化[39]虽然Bglap是一个高度保守的蛋白质,参与骨化和与矿化骨基质(37,38]。血小板衍生生长因子受体β多肽(Pdgfrb)表达式相比,毛高7.21倍D1细胞和纤维母细胞生长因子2 (Fgf2)毛只是表达的细胞。Pdgfb和Fgf2刺激MSC MSC的增殖和迁移,而抑制脂肪形成的和成骨分化(40,41,45]。转化生长因子β3 (Tgfb3)生长因子影响chondrogenic分化,表示大3.52倍相比,毛D1细胞(46]。
细胞外基质、细胞粘附和细胞骨架元素。当研究基因的表达与细胞外基质,细胞粘附和细胞骨架元素(图4(一)和表1),我们发现黑色素瘤细胞粘附分子(Mcam)表达检测毛D1细胞祖细胞但不符合血管周的起源的毛49,50]。矩阵metallopeptidase 2 (Mmp2)、巢蛋白(Nes),和血管细胞粘附分子1 (Vcam1)也表达了在毛但不是在D1细胞。I型胶原蛋白,α1 (CoI1α1)、波形蛋白(Vim)表达式分别为3.03和5.05倍,分别在毛与D1细胞整合素α6时(Itga6)表达在D1文化大3.25倍。表达Mmp2和Vim的毛血管周的区域内为它们的迁移提供了一种机制(51,55]。Vcam1介导造血细胞的附件,作为MSC与t细胞免疫抑制活性的标志(53,54]毛可以通过指向机制与免疫细胞互动。相比之下,Itga6表达式在D1和功能增强MSC multipotency通过特定转录因子Oct4和Sox2 [48),而巢蛋白,这也是与multipotency [52毛],表达的细胞。因此,毛泽东和D1祖细胞基因表达建议他们保持增殖能力和multipotency通过不同的机制。
几种/杂。免疫功能相关的基因(图4(一)、表11)包括锯齿状(Jag1)、白细胞介素- 6 (il - 6)、白血病抑制因子(生活),切口同族体基因1(果蝇)(Notch1)。Notch1,毛只存在于细胞,细胞表面受体Jag1表示更大的22.11倍在毛与D1细胞。Notch1和Jag1信号通路需要MSC诱导调节性t细胞扩张和指向潜在的毛祖交互和监管的适应性免疫59]。符合这个,il - 6, MSC分泌的一种细胞因子,当抑制淋巴细胞凋亡(60]和抑制树突状细胞分化[61年毛],表示只有祖细胞。生活记录也只有在毛发现细胞。这个基因的产物参与upregulation MSC多能性标记(62年]。
卷曲的同族体9 (Fzd9)并不符合任何类别描述和属于杂项。Fzd9 D1和表达的不是毛细胞(图4(一)、表1)。这个基因调节在早期成骨分化[58)及其表达式通过D1细胞成骨的转录和生长因子的基因表达是一致的。
4所示。总结
吞噬细胞因子的数据分析建立D1骨髓祖细胞抑制MΦ派生的炎症概要文件但没有影响zymosan-induced MΦ吞噬,而祖细胞来自主动脉(毛)导致MΦ炎症激活有限合伙人和支持zymosan-induced MΦ活动。
免疫功能和基因数组的相关研究显示三大主题。(1)表达的转录模式和增长因素表明,毛泽东间叶细胞祖细胞,增强MΦ炎症反应,将分化为软骨细胞,而D1间叶细胞祖细胞,抑制MΦ炎症反应,将分化为成骨细胞和脂肪细胞。(2)毛间叶细胞祖细胞基因表达是一致的交互和适应性免疫的调节。(3)D1的转录模式间充质祖和主动脉组织中毛间充质祖表明他们保持增殖能力和multipotency通过不同的机制。必须指出的是,除了这些祖种群不同组织来源通道号码,可能导致这些研究中观察到的表型和免疫调节的差异。
5。结论
这些研究证明功能异质性间充质祖人群来自不同组织的巨噬细胞细胞。主要的发现表明,间充质祖细胞表面抗原表达,转录,与脂肪形成的相关生长因子和成骨分化抑制LPS-induced巨噬细胞炎症。这些数据将用于隔离,净化,和修改的间叶细胞祖细胞用于治疗炎症性疾病。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作是由美国国立卫生研究院/ NHLBI)的资助下,R00HL091116-05乔迪·f·埃文斯。
补充材料
补充文件1是一个excel文件包括运行文件PrimePCR间充质干细胞(SAB目标列表,Bio-Rad)基因阵列(表1),分析符号的原始数据(表2),和总结表达差异(表3)。