文摘

间充质干细胞(MSC)的基础治疗是一种很有前途的治疗软骨。然而,修复组织一般不能再生一个原始hyaline-like组织。在这项研究中,我们专注于增加胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)的表达水平,提高修复组织的质量。igf - 1基因引入人体滑膜msc与慢病毒载体进行基因表达的水平和msc chondrogenic分化条件下使用颗粒形态地位的文化。颗粒的大小来自IGF-1-MSCs明显大于对照组。大量的糖胺聚糖(GAG)也明显高于IGF-1-MSC组。IGF-1-induced丸的组织学证明相似肥厚性软骨细胞表型的透明软骨没有表现出特性。Col2A1基因和蛋白的表达水平明显高于igf - 1球的控制球,但表达水平Col10, MMP-13,高山,Osterix并不高。因此,igf - 1基因转移对人体滑膜msc导致一种改进chondrogenic分化能力的可检测感应肥厚性或成骨表型。

1。介绍

关节软骨(AC)的自我修复能力有限,部分原因贫穷多血管,淋巴系统,没有神经支配。此外,AC富含hyaline-like细胞外基质丰富II型胶原蛋白,糖胺聚糖和水,一篇作文,这可能会干扰细胞快速迁移和重新从而影响组织修复过程。为了弥补这种缺点,不同的方法研究了改善软骨愈合(1- - - - - -7]。其中,干细胞疗法可能是一个有前途的选择,促进再生修复。间充质干细胞(msc)有能力分化成各种各样的结缔组织细胞包括骨、软骨、肌腱、肌肉、脂肪组织(8]。这些msc可以很容易分离,还可以从许多别的来源如骨髓、骨骼肌、滑液膜,脂肪组织,和脐血(9- - - - - -16]。具体来说,msc与滑膜软骨修复的可能适合细胞疗法,因为相对轻松地chondrogenic分化他们的收获和强大的能力(14,17,18]。最近移植滑膜MSC (Syn-MSC)的研究已经显示成功修复软骨缺损的18- - - - - -21]。然而,详细的观察表明,在大多数情况下,修复组织不同于正常透明软骨组织一些纤维软骨的或纤维组织的污染(22]。这些发现表明,需要进一步改善的质量对更完整的再生修复组织。

其中一个选项来解决需要改进可能生物操纵MSC的分化能力。胰岛素样生长因子(igf - 1)被认为是一个重要的生长因子,可以调节细胞和软骨细胞状态的chondrogenic潜力。先前的报道表明,igf - 1能扮演重要角色在软骨修复23]。igf - 1促进msc的增殖(24),也会导致增加生产aggrecan和2型胶原蛋白,从而有助于保持软骨细胞的表型(23,25]。最近的一项研究显示,igf - 1基因转导成软骨细胞有助于改善软骨修复与更强的染色safranin-O和维护的三层结构与nontransduced相比控制软骨细胞(26]。另一项研究表明,igf - 1促进了chondrogenic骨骨髓来源MSC分化能力,但在这个研究中,igf - 1还刺激肥厚性表型的表达以及提高成骨的标记,表明促进成骨表型的这个骨骨髓来源MSC人口(27]。

因为Syn-MSCs展览一个劣质成骨分化能力相比,骨骨髓来源msc (28,29日),上述讨论的结果可能是特定的来源。为了解决这个问题,它是评估的影响感兴趣的生物表型Syn-MSCs igf - 1表达增强。在目前的研究中,igf - 1基因转移到人类Syn-MSCs和igf - 1的表达升高的影响chondrogenic分化能力进行评估。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

人类synovial-derived间充质干细胞(hSyn-MSCs)被孤立和扩大之前报道(30.]。简而言之,滑膜从5人获得捐助者(年龄= 17-35岁;2女性和3男性)在膝盖的关节镜手术的时间(交货,ACL重建半月板修复,或滑膜切除术)。他们不受任何诊断疾病(表1)。在手术之前,患者接受研究的一个解释,并同意按照协议提供了制度伦理委员会批准的大阪大学医学院和附属医院。

滑膜标本被剁碎,与0.2%胶原酶消化(Collagenase-AOF A型;沃辛顿生化,莱克伍德,NJ)在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;Gibco BRL,生活技术,马里兰州罗克维尔市)2小时摇晃水浴37.0°C。离心,然后收集的细胞在DMEM培养生长培养基补充10%胎牛血清(Sigma-Aldrich的边后卫,圣路易斯,密苏里州)和1% penicillin-streptomycin (Sigma-Aldrich),与介质取代每周两次。这些细胞被定义为synovium-derived msc。当细胞达到融合,然后用无菌磷酸盐(PBS)洗净,与trypsin-EDTA分离(0.25% EDTA胰蛋白酶+ 1毫米;Gibco BRL、生活技术)和山肩密度为3.0×10 e3细胞/厘米²。细胞通道继续以同样的方式当细胞达到融合。细胞通道3 - 5是目前研究中使用。

2.2。慢病毒载体建设

以前使用的质粒通过Madry et al。31日)最初是为当前的研究。igf - 1 cDNA片段被释放从犯罪类型的质粒和重组慢病毒载体质粒pLVSIN-IRES-ZsGreen1(豆类、志贺、日本)。IGF-1-expressing的慢病毒质粒pLVSIN-IRES-IGF-1 ZsGreen和控制所产生的质粒pLVSIN-IRES-ZsGreeen1股Lenti-X转染293 t细胞(豆类)。的Lenti-X HTX包装系统(Clontech实验室,CA)是使用。Lenti-X镀293 t细胞在DMEM 10%透析流化床燃烧器(豆类)的浓度1×10 e6细胞/ 100毫米直径的菜然后转染质粒的第二天7 g。上层清液的转染细胞收集使用Lenti-X-PCR天2和3 posttransfection和滴定滴定工具包(Clontech)。

2.3。慢病毒载体

Syn-MSCs培养在retronectin(重组人纤连蛋白片段(豆类生物公司,Kusatsu、志贺、日本))和涂层6-well盘子。慢病毒的细胞和整除的板块股票离心机在1000 g×2小时32°C以下retronectin-binding感染方法(MOI = 50)。在感染病毒后12小时,媒介改变了生长介质。感应72小时后,Syn-MSCs受到三系细胞分化能力分析。lentiviral-mediated基因诱导的细胞被mRNA转录水平的表达评估(RT-qPCR)和蛋白质(西方墨点法)igf - 1水平。

2.4。Chondrogenic分化

使用pellet-culture Chondrogenic msc分化的诱导方法。简而言之,这些细胞被培养在聚丙烯管1×10 e5细胞密度/管chondrogenic insulin-transferrin-selenium补充中含有1%(+预混料;康宁公司,纽约),0.2毫米Asc-2P (Sigma-Aldrich), 50 ng / mL重组人类BMP-2 (Osteopharma Inc .)、大阪、日本)和2.5 ng / mL重组人类TGF-beta3 (Peprotech落基山,新泽西)。chondrogenic媒介改变了三次一个星期。评估chondrogenic分化,颗粒大小的评估,粘多糖(GAG)内容确定,基因表达水平进行评估,和组织化学分析。颗粒的大小是衡量使用横向和纵向直径下的颗粒显微图像处理软件(日本奥林巴斯显微镜,尼康映像+)诱导分化后在7和14天。粘多糖内容量化使用Blyscan硫酸GAG分析工具包(Biocolor有限公司,卡里克费格斯,英国)。组织学和免疫组织化学分析,颗粒与4%多聚甲醛固定,石蜡包埋。约5μ米颗粒的部分沾safranin-O快速绿色或甲苯胺蓝染色检测硫酸笑料。蛋白酶K (DAKO, CA)治疗部分用了反探测胶原蛋白II (F-57, Kyowa Pharmachemical有限公司高冈,日本)或胶原蛋白II抗体(eBioscience,圣地亚哥,CA)。

研究基因表达水平的球,总RNA提取与试剂盒(生活技术,医学博士),和互补的dna合成(互补)上标很(技术)。II型胶原蛋白α1的信使rna表达水平(Col2a1;Hs 00264051 _m1)和Sox9基因(Hs1001343_g1)评估TaqMan实时聚合酶链反应(存在,应用生物系统公司,卡尔斯巴德,CA)使用StepOnePlus实时PCR仪(应用生物系统公司)。X型胶原蛋白的表达水平(Col10;Hs00166657_m1)和矩阵metalloproteinase-13 (m-13;Hs00233992_m1)肥厚性软骨细胞标记和碱性磷酸酶(高山;Hs03046558_s1)和Osterix (Hs01822874_m1)作为成骨的标记被RT-qPCR评估。被归一化值glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH;Hs02758891_g1) mRNA水平作为一个房子保持基因和内部控制。

2.5。成骨、脂肪形成的分化

成骨细胞分化诱导时在大约80% confluency使用商业成骨的介质(StemPro成骨分化装备,生活技术GmbH,达姆施塔特,德国)。中了三次一个星期。分化文化的一个星期后,评估细胞的成骨分化检测高山表达式使用一个高山染色法(BCIP /电视台显色底物,Promega)。三个星期后,再次进行了对成骨细胞分化用茜素红染色(Muto纯化学品有限公司,东京,日本)。定量的茜素红染色进行使用溶液的吸光度在415 nm从染色细胞筛选了。脂肪形成的分化诱导的细胞开始扩散时,使用商用overconfluent脂肪形成的分化培养基(StemPro去装备,生活技术GmbH)。经过三个星期的分化,细胞被沾油红溶液(0.5%油红,Sigma-Aldrich)评估细胞的脂质含量作为脂肪形成的能力的指标。

2.6。统计分析

每个体外实验至少重复三次独立使用不同的供体细胞来源。受到一个独立样本的数据t以及。结果提出了均值±标准差(SD)一式三份的决定。评估的统计差异,值小于0.05被认为是重要的。所有数据分析使用统计软件“EZR”(容易R)是基于R和R指挥官(32]。

3所示。结果

3.1。igf - 1基因转移对Chondrogenic分化的影响

先前的研究已经表明,颗粒的大小文化是一个很好的评估参数评估实现软骨形成使用pellet-culture分化方法(33]。因此,我们测量颗粒的直径由pLVSIN-IGF-1-transfected msc。平均直径为2080±7天94.4毫米和2730±116.0毫米在14天。这些值都明显大于对照组7点(1899±47.8毫米())和14天(2548±91.5毫米())(图1(一)和1 (b))。

同样,粘多糖(GAG)含量明显高于3.6倍()IGF-1-induced细胞颗粒比控制在第14天丸(图2(一个))。正常化后DNA内容、呕吐内容IGF-1-transduced组仍显著(1.7倍)高()与对照组(图的值2 (b))。

尽管所有的小球显示积极safranin-O和甲苯胺蓝染色,无论igf - 1介绍,染色强度较高的样本IGF-1-transduced组比对照组(图3(一个))。因此,组织学IGF-1-induced颗粒表现出更多的相似之处的正常,透明软骨。值得注意的是,没有明显增加的存在与大而圆的形状肥厚性软骨细胞igf - 1传导球与控制颗粒(图3 (b)上车道)。在其他捐赠样本,类似的结果(补充图2 a、2 b网上https://doi.org/10.1155/2017/5804147)。

免疫染色的结果显示(图3 (b)更激烈的II型胶原染色在IGF-1-transduced比在控制球球。相反,染色X型胶原蛋白,一个标记为肥厚性表型是微不足道的两组,表明肥厚性软骨细胞的存在与两组小球的最小(图3 (b))。

我们也评估IGF-1-transduced细胞和控制细胞的RNA chondrogenic标记基因mRNA转录水平II型胶原蛋白α(Col2A1),以及肥厚性标记X型胶原蛋白(Col10)、基质金属蛋白酶13 (MMP-13),高山和Osterix成骨的标记基因。Col2A1 chondrogenic标记基因的表达水平明显高于(3.1倍)IGF-1-transduced组与对照组相比)。相比之下,信使rna表达水平的肥厚性软骨细胞标记基因(ColX和MMP-13),和成骨的标记基因(高山和Osterix)没有显著的高于颗粒从IGF-1-transduced细胞比控制颗粒(图4)。

3.2。成骨、脂肪形成的分化IGF-1-Transduced Syn-MSCs

igf - 1的影响引入到Syn-MSCs成骨和脂肪形成的谱系分化能力也被调查。没有可检测igf - 1之间的差异在高山染色7天组的样本和对照组(图5(一个))。经过21天的成骨分化,两组表现出类似的染色茜素红(图5(一个)),量化值两组没有显著差异(图5 (b))。

经过21天的接触去文化条件,检测与脂肪形成的分化相关的脂质滴观察两组相似(图5 (c))。

上面描述的结果是类似的结果得到三个代表Syn-MSCs的捐助者。其他捐助者被用来证实只有部分的完整描述。对照组,并与pLVSIN-IRES-ZsGreen1缺乏igf - 1的质粒插入用于细胞增殖化验,发现不不同的属性(补充图3)nontransduced细胞。因此,nontransduced细胞被定义为对照组的所有后续评估。

4所示。讨论

目前的研究表明,慢病毒vector-mediated igf - 1基因转移特别是提高人类Syn-MSCs chondrogenic分化能力的,所以没有任何检测对骨和脂肪形成的影响这些细胞的分化。

治疗使用msc软骨修复一直提倡要克服的局限性自体软骨细胞移植方法,如相关问题的去分化软骨细胞的影响在扩大培养和删除从同一关节软骨损伤。在他们的评论,变动等。9)表明,一半的60个临床试验使用msc软骨修复被报道在过去的3年。然而,它也被显示,MSC-based疗法有一些限制有关的质量修复组织由于污染和纤维软骨的组织(22]。这种不完全的再生组织被证明有低等的生物力学特性与正常软骨(22]。因此,有必要提高修理质量MSC-based疗法以走向组织再生。的方法进行了调查。随着多能干细胞的替代使用,如胚胎干细胞或诱导多能干细胞(iPS)细胞作为细胞来源(34- - - - - -39),操纵生物表型的MSC可以是一个潜在的方向数,包括包容发挥低氧张力在细胞培养(40),应用外源性生长因子或细胞因子(41- - - - - -43),和特定的目标分子的基因转移44,45]。

我们假设igf - 1基因转移可以改善人类Syn-MSCs chondrogenic能力,类似于研究Madry et al。26),igf - 1基因引入牛软骨细胞。提高效率的igf - 1基因的介绍,我们利用一个既定的慢病毒载体系统。最近,犯罪类型慢病毒载体已成为最流行的一种工具,用于基因转移到哺乳动物细胞根据其效率,安全,方便46]。转移的igf - 1基因转移到msc确认mRNA转录和蛋白表达水平(补充图1 a、1 b),它没有发生明显改变细胞表面标记表达谱(补充图1 c)或分化能力的细胞向成骨、脂肪形成的血统。相比之下,igf - 1基因的引入促进了chondrogenic Syn-MSCs到组织的分化表型形态更类似于透明软骨。还应该指出,在目前的研究中,igf - 1基因转移到Syn-MSCs促进软骨形成没有检出增强的肥厚性或成骨表型。弗里希等人报道,成骨和肥厚性标记基因的表达增加了超表达igf - 1的骨骨髓来源msc,可能来源于msc分化的倾向的骨头向成骨的血统以及一些软骨形成(27,45]。尽管两者之间的差异观察研究可能受到不同的基因转移和细胞培养的条件,也可能igf - 1的行动Syn-MSCs与骨骨髓来源的分化特点msc也可能是完全不同的。支持这一结论,古德里奇等人报道异位骨形成在修复组织植入后骨骨髓来源msc成软骨的缺陷(47]。这些发现表明,潜在的体内成骨分化的msc可以发生在软骨修复。与以前的报告,过早在体外诱导肥大软骨形成的msc与钙化后异位植入(48),刺激成骨分化能力的msc时应避免用于软骨修复。在这方面,接触igf - 1在骨骨髓来源MSC-based软骨修复可以增加骨形成不利的风险,因此不推荐。相反,IGF-1-transduced Syn-MSCs似乎展览lineage-specific增强chondrogenic能力,这些观察结果的临床意义是,这些细胞可能是一种很有前途的方法操纵朝着更完整的组织再生软骨修复。

本研究的限制之一是,尽管我们发现了一个独特的表型变化对增强chondrogenic分化能力的人类Syn-MSCs通过igf - 1基因转移,我们不能评估是否依赖于供者年龄和性别的差异。我们使用细胞来源是可用的,但是这些都是年轻的捐助者(17-35岁)和数字是有限的。然而,我们以前调查的详细chondrogenic能力的人类Syn-MSCs不同年龄段的,和我们没有发现任何明显的表型的差异个人Syn-MSCs评估(49]。然而它仍有争议是否人类Syn-MSCs种群表现出不同的chondrogenic能力依赖于年龄或性别。此外,我们没有评估软骨组织的生物力学特性和典型的软骨组织体内植入后的稳定性。进一步的研究需要在这些领域的详细澄清IGF-1-transduced MSC的潜力,促进软骨再生。

5。结论

Lentivirus-mediated igf - 1基因转移对人类Syn-MSC促进chondrogenic分化能力的细胞没有刺激肥厚性或成骨表型,因此,可能会增强软骨修复的潜力。

缩写

呕吐:	糖胺聚糖
M.O.I。	感染复数
msc:	间充质干细胞。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

池田Yasutoshi Morito Sakaue,某某Chijimatsu,大卫·a·哈特Hidenori Otsubo亨宁Madry,其它Shimomura Tomoyuki铃木,未获中村负责项目概念和实验设计。池田Yasutoshi Morito Sakaue,某某Chijimatsu收集和组装数据。池田Yasutoshi Morito Sakaue,某某Chijimatsu,未获中村分析和解释数据。池田Yasutoshi Morito Sakaue大卫·a·哈特和中村未写的手稿。中村Yoshikawa,行长山下式和未负责行政支持和手稿的最终批准。中村未获博士是负责项目概念和实验设计,数据分析和解释,稿件写作,行政支持,手稿的最终批准。

确认

作者感谢玛丽Shinkawa夫人和太太Asa的技术支持。本研究支持Grand-in-Aid科研(B)的日本社会科学,促进日本(22390291)和格兰特下一代再生技术的研究和开发的新能源和工业技术发展组织,日本(14542969)。大卫·a·哈特是阿尔伯塔省创新支持的卫生解决方案OA团队格兰特,加拿大(rt71 - 6221)。

补充材料