文摘

人类多能干细胞的使用基础和转化心脏研究需要高效的对心肌细胞分化的协议。体外分化产生异构的心室,心房和nodal-like阻碍细胞再生疗法的潜在应用。我们描述了生长因子激活素的影响在早期心脏分化人类胚胎干细胞的命运的决心。添加高浓度的苯丙酸诺龙在胚状体的身体心脏分化增强内胚层衍生品的产生,进而促进心肌细胞分化。此外,增加存在剂量依赖的相关性coreceptor表达式的TGF -β超家族成员CRIPTO-1在反应激活素a .我们假设细胞之间的相互作用来源于中央和内胚层的血统在拟胚体有助于改善细胞成熟心肌分化的早期阶段,改善收缩跳动频率和百分比的拟胚体。苯丙酸诺龙似乎并没有影响后期心肌细胞分化的特性,测量动作电位和胞内钙^{2 +}动力学。这些发现适用于改善我们了解人类心脏发展,可以进一步探讨和提出的协议获得与功能性心肌细胞表型,成人心脏细胞中观察到的类似。

1。介绍

功能的心肌细胞的生成(CMs)分化的多能干细胞(PSC)线提供了一个绝佳的平台开发了新型细胞疗法,建立预测药物毒理学测试,人类疾病体外模型,研究人类胚胎发育(1]。策略来有效地直接分化人类胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPSC)对心血管血统特别感兴趣的是由于心血管疾病的高发病率和死亡率在西方世界。体外分化方法到目前为止,最成功的是那些概括胚胎心脏发育的监管途径(了2,3])。

PSC分化,CMs在过去的十年里有了长足的进展。第一个定向分化协议描述涉及到人类的ESCs的coculture小鼠内脏endoderm-like细胞(END-2) [4]。目前,两种基本方法人类PSC线正在使用的心脏分化:分化培养的人类已经被作为单层和拟胚体(EBs)(综述(2,3])。

研究中,使用不同的生物模型,证明了地貌成因的苯丙酸诺龙(ActA) /节点,骨形成蛋白(BMP)和Wnt信号通路在建立心血管细胞中扮演过重要的角色的命运(5- - - - - -16]。最近发表的报告表明,BMP4和碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)信号调制ActA-induced mesendoderm分化在鼠标17- - - - - -19)文化和人类ESC (20.]。此外,BMP4的组合效应和学报采用无血清诱导心血管发展人类的ESCs [21,22]。Kattman等人报道,老鼠和人类个体PSC所需的线路优化的适当平衡BMP4和ActA信号级联来实现高效的心脏分化(23]。然而,这些研究没有定义一个stage-specific作用对这些形态因子也不同程度的信号在分化的影响。

bmp和学报的成员转化生长因子β(TGF -β)总科和控制各种基本的细胞过程,包括组织模式在胚胎发生和细胞增殖和分化。这些TGF -β配体发挥其生物效应绑定和装配两种类型的跨膜受体(I型和II型)与内在丝氨酸/苏氨酸激酶活动(24,25]。ActA II型受体,结合ACVR2A或ACVR2B,导致齐聚,新兵和磷酸化激活素I型受体激酶4 (ALK4,或也称为ACVR1B)(综述(26])。学报和节点使用相同的信号受体,尽管他们与受体的ligand-mediated互动机制是不同的。节点缺乏内在亲和力ACVR2A / 2 b和ALK4需要CRIPTO-1,也称为teratocarcinoma-derived生长因子- 1 (TDGF1),属于表皮生长factor-Cripto-FRL1-Cryptic (EGF-CFC)的家庭,它有一个关键的角色在胚胎发育和肿瘤发生[27]。研究表明,节点组装II型和I型受体(只有当CRIPTO-1在场28,29日]。在小鼠胚胎发育,Cripto-1表示囊胚内细胞团的第四天,原条6.5天(30.]。许等人已经证明,老鼠的ESCs缺乏Cripto-1形成超过CMs体外表达失去了能力(31日]。更有趣的是,老鼠Cripto-1缺乏胚胎死于由于中胚层形成缺陷(约6.5天32]。Minchiotti等人已经证实Cripto-1信号启动的关键是鼠标的ESCs分化为功能性CMs (33,34]。最近,Fiorenzano等人提供证据表明CRIPTO-1鼠标外胚层干细胞的主要决定因素(EpiSC)和人类的ESC多能性,表明早期的函数CRIPTO-1比先前公认的第一个血统决定了早期胚胎(35]。

在这项研究中,我们调查的角色分化从人类的ESCs ActA信号通路在厘米。中胚层标记的表达啊和endoderm-associated标记SOX17和HNF4α确认ActA mesendoderm健壮的诱导物的形成。我们表明,高剂量的学报(50和100 ng / mL),添加在最初阶段的心脏分化,改善细胞成熟分化的早期阶段。具体来说,《承包EBs的比例增加,这些EBs跳动的频率。CRIPTO-1表演在ESC分化的早期时间窗口可能负责启动厘米细胞命运。最后,我们证明了早期承诺ActA似乎改善心脏细胞类型规范和ActA-mediated分化人类ESC-derived CMs (ESC-CMs)允许生产的CMs心房,ventricular-like动作电位(APs)和Ca^{2 +}支持先进的成熟的细胞动力学。总之,人类ESC-derived EBs处理高学报浓度在头两天的心脏内皮细胞分化回应越来越多的权威,进而提升厘米分化和早期细胞成熟分化的早期阶段。

2。材料和方法

2.1。人类胚胎干细胞的文化

人类ESC, H1 (WA01)和H9 (WA09都来自WiCell研究所),使用段落43年至63年,正常核型,由WiCell细胞遗传学检查服务。ESCs维持在文化、人类的ESCs培养的支线层辐照小鼠胚胎成纤维细胞在缺氧条件下(mef GlobalStem)。mef是未分化的细胞培养在正常维护媒介对人类ESC行:基因敲除基因敲除血清DMEM / F12和20%替代(KSR)补充了2毫米谷酰胺,1%不重要的氨基酸(NEAA), 0.1毫米β巯基乙醇,0.5%笔/喉炎的症状(所有从热费希尔科学)和10 ng / mL bFGF (PeproTech)。ESCs分化之前,人类被培养在馈线耗尽薄生长因子减少(GFR)人工基底膜层(BD生物科学)至少三个段落。Feeder-free文化是完全无血清mTeSR介质(干细胞技术),包括基础培养基和5 x与重组人类bFGF和TGF -补充β和维护normoxia之下。艾略特所提供的人类ESC线请et al。36]。

2.2。心脏分化人类胚胎干细胞

EB-based协议,先前所描述的布里奇et al。37- - - - - -39),被用来区分人类ESC线(H1和H9)功能CMs(图1(a))。

心脏分化诱导前的一天,人类的ESCs培养feeder-free人工基底膜,被分离成单个细胞与TrypLE(热费希尔科学)在37°C 2分钟,播种在1.0 - Matrigel-coated细胞培养瓶细胞/厘米²mTeSR中补充了10μM Rho-associated蛋白激酶(岩石)抑制剂(y - 27632;VWR)。分化,细胞在第0天达到80 - 90%的confluency并分离TrypLE和镀尖底裸96 - 5500多井板的密度每低于缺氧细胞中胚层诱导介质包含RPMI 1640(热费希尔科学)与1%化学定义脂质集中(热费希尔科学),10μg / mL重组人类胰岛素(Sigma-Aldrich), 450年μM 1-Thioglycerol (Sigma-Aldrich), 2毫克/毫升聚乙烯醇(PVA;Sigma-Aldrich), 0.1%笔/喉炎的症状(热费希尔科学),1μy - 27632,生长因子BMP4 (25 ng / mL), bFGF (5 ng / mL),和学报(从0到100 ng / mL;所有从PeproTech)。PVA增强EB形成和随后心脏规范。在第二天,媒介改变了RPMI 1640含20%胎牛血清(的边后卫;热费希尔科学),50μg / mL L-ascorbic酸2-phosphate (Sigma-Aldrich) [40),450年μM 1-Thioglycerol, 0.1%笔/喉炎和常氧条件下培养48 h。在第四天,EBs被转移到组织culture-treated 96 -孔板和孵化与RPMI 1640补充了4 72 hμ米的Wnt抑制剂IWR-1 (Sigma-Aldrich)。从第十天开始,媒体没有IWR-1使用。在CRIPTO-1干涉实验中,5μM CFC1 / CRIPTO-1阻断肽(CRIPTO-1英国石油(BP);ESCs GeneTex)添加到区分人类在差异化协议的第一步(从天0到2)。验证的屏蔽效率CFC1 / CRIPTO-1 BP体外,细胞治疗CRIPTO-1抗体(热费希尔科学,pa1 - 16534;10μ米)。

2.3。定量实时聚合酶链反应

使用PureLink总RNA提取RNA迷你包(热费希尔科学)和处理已经没有dna的细胞工具(热费希尔科学)来保证高度纯粹的RNA。0.5μg是反向转录成RNA cDNA上标三世逆转录酶合成第一链SuperMix(热费希尔科学)。与铂SYBR定量实时PCR进行绿色qPCR SuperMix-UDG(热费希尔科学)。支持信息表中列出的寡核苷酸引物序列是S1 (IDT)所有。10倍稀释系列从10⁻³到10⁻⁸50 ng /μL人类基因组DNA是用来评估底漆效率。相对表达价值观得到规范值的基因测试管家基因的值GAPDH,产生HPRT,RPL13a。

2.4。免疫荧光染色

EBs在第七天在分化过程中沾了CM和早期内皮祖细胞特征。细胞被固定为4%多聚甲醛(PFA;Polysciences) 10分钟4°C, permeabilized PBS(热费希尔科学)中含0.2% Triton x - 100 (Sigma-Aldrich)和1%牛血清白蛋白(BSA);Sigma-Aldrich) 30分钟,封锁在10%驴血清(Sigma-Aldrich) 30分钟。细胞被孵化一夜之间在4°C以下主要抗体:心肌肌凝蛋白重链(cMyHC;Abcam BA-G5;10μg / mL),联接蛋白43 (CX43;圣克鲁斯h - 150;0.67μg / mL)和肝细胞的核因子4α(HNF4α;Abcam K9218;5μg / mL),其次是适当的Alexa萤石488和594 -共轭二次抗体(热费希尔科学;4μg / mL)。核沾染了赫斯特(33342年,热费希尔科学;1:3000)1分钟。分析评估使用Eclipse Ti显微镜和NIS-Elements AR 4.11软件(尼康)。

2.5。免疫印迹

细胞细胞溶解在缓冲区里帕补充氟化钠10毫米,0.5毫米钠原钒酸盐,1:100蛋白酶抑制剂的鸡尾酒,1毫米Phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF)。等量的蛋白质(40μg)在装样heat-denatured缓冲区(50毫米Tris-HCl, pH值6.8,100毫米德勤,2% SDS, 0.1%溴酚蓝,和10%甘油),解决了SDS-polyacrylamide凝胶电泳,然后转移到硝化纤维膜。与Tris-buffered盐水过滤器被封锁(TBS)包含0.05%的渐变和5%的脱脂奶粉,然后孵化一夜之间在4°C的主要抗体cMyHC (Abcam BA-G5;2μGAPDH g / mL)和归一化(Sigma-Aldrich G9545;1μg / mL)。中等辣根过氧化物酶(合)共轭抗体稀释1:5000年TBS-Tween和2.5%的脱脂奶粉。孵化后SuperSignal硬脑膜化学发光底物,多肽乐队与GelDoc化学发光检测系统检测到。定量进行凝胶并行加载并涂抹和相对测密度术是通过规范使用QuantityOne蛋白质乐队与背景和管家软件。

2.6。流式细胞术分析

未分化的ESCs或EBs收获和胶原酶IV 20分钟分离StemPro Accutase细胞分离试剂(从热费希尔科学)3分钟在37°C。分析HNF4 CRIPTO-1的存在α⁺内皮细胞,EBs在早期心脏分化是分离,固定与PFA 10分钟37°C,和permeabilized冰冷的90%甲醇(Sigma-Aldrich) 30分钟在冰上。样本染色为1小时37°C以下抗体:CRIPTO-1(热费希尔科学pa1 - 16534;1μg / mL)和HNF4α(Abcam K9218;1μg / mL),其次是适当的Alexa萤石488和647 -共轭二次抗体(热费希尔科学;1μg / mL) 30分钟37°C。确定cMyHC的百分比⁺CMs后心脏分化没有添加学报,PFA固定和甲醇permeabilized EBs在彩色1小时37°C与主抗体cMyHC (Abcam 3-48;1.67μg / mL),其次是适当的Alexa萤石647 -共轭二次抗体(热费希尔科学;1μg / mL) 30分钟37°C。评估可能ActA附加的增殖效应在EBs早期心脏分化,ki - 67和7-AAD (7-Aminoactinomycin D)进行了染色试验。PFA固定和甲醇permeabilized EBs彩色20分钟在RT与主抗体ki - 67 (BD Pharmingen B56;1μg / mL),其次是Alexa萤石647 -共轭二次抗体(热费希尔科学;1μg / mL) 20分钟在rt 7-AAD染色(eBioscience;1:25)与不固定的细胞,进行培养5分钟在rt,汉克斯的平衡盐溶液(哈佛商学院;与CaCl热费希尔科学)₂和MgCl₂补充了2%的边后卫,10毫米玫瑰,南10毫米₃(来自Sigma-Aldrich;pH值7.2)被用作染色缓冲区。细胞被流式细胞仪分析和量化(BD FACSCanto I或II与高温超导;BD生物科学)和FlowJo软件(FlowJo LLC)。

2.7。膜片钳电生理和Ca^{2 +}测量

单个细胞被播种在Matrigel-coated盖玻片全细胞膜片箝和Ca^{2 +}录音。细胞灌注解决方案包含以下(毫米):137氯化钠,氯化钾的5.4,1.8 CaCl₂0.5 MgCl₂葡萄糖、10、10 Na-HEPES;与氢氧化钠pH值调整到7.4。补丁夹吸量管充满了一个解决方案包含以下(毫米):120 K-Asp 20氯化钾,10玫瑰,5 Mg-ATP, 10氯化钠,0.05 K₅Fluo-4;pH值与KOH调整到7.2。

APs在全细胞电流测量夹有EPC-9放大器(HEKA Elektronik) 10 kHz的采样率。贴片电极电阻时2.5和3 MΩ之间充满了细胞内的解决方案。电容和电阻连续监控。实验在37°C。APs记录300 pA的5毫秒脉冲后,在1赫兹的频率。与2.9 kHz信号过滤和10 kHz贝塞尔滤波器。数据与Clampfit进行了分析。

同时与膜片箝记录,2 d图像采集Fluo-4信号的记录使用共焦显微镜(尼康A1R谐振模式40 x 1.3 NA油浸物镜)1图像的扫描速度每110毫秒(平均4图像)。数据分析使用ImageJ通过测量背景减去平均荧光强度(MFI)的细胞,排除核区域,随着时间的推移。

2.8。统计分析

数据统计分析使用GraphPad棱镜。所有数据被报道为平均值±标准平均误差(SEM)。组进行统计学意义差异使用双尾未配对的学生的t如果需要)以及(与韦尔奇的修正,费雪的测试或方差分析。差异的意义是表示如下::与控制,§与10 ng / mL学报,#和25 ng / mL学报,50 +和ng / mL学报;:与控制,§§和10 ng / mL学报,# #和25 ng / mL学报,50 + +和ng / mL学报;和:∗∗∗与控制,§§§和10 ng / mL学报,# # #和25 ng / mL学报,50 + + +和ng / mL学报。

3所示。结果

3.1。苯丙酸诺龙多能性的监管存在剂量依赖的相关性和谱系标记在早期心肌细胞分化

人类的ESC行H1和H9分化对CMs,根据协议描述(见材料与方法;数据1(一)-1(h))。在心脏分化的早期阶段,人类的ESCs EB骨料不同浓度处理学报,范围从0到100 ng / mL。10、25、50或100 ng / mL ActA导致多能性的差别更加明显对这些标记OCT4和NANOG(图2(一个))。探讨学报的影响在早期细胞命运体外心脏分化,基因的表达对应的三个发展血统的决心。预处理与学报没有增加中层标记的表达啊2天的区别,尽管是差别明显对这些观察到第四天的100 ng / mL ActA比未经处理的条件(0 ng / mL学报;图2 (b),左面板)。此外,心脏祖标记NKX2.5显著调节人类ESC-CMs 7天处理100 ng / mL学报(图2 (b),右面板)。正如所料,ActA治疗没有直接向外胚层的分化过程血统,虽然短暂upregulationPAX6在应对学报(图2 (c))。有趣的是,《早期显著增加和中间内胚层的标记,分别SOX17(图2 (d),左面板),HNF4α(图2 (d),右面板)。因此,添加ActA的初始步骤中分化诱导多能性下降更快,更强,提升mesendodermal细胞命运,显著的表达所示啊和SOX17。100 ng / mL ActA的浓度是最有利于高效心脏祖细胞通过mesendoderm感应。

3.2。苯丙酸诺龙提升诱导心肌细胞

调查高剂量的学报能否支持进一步分化为CMs, EB形态的人力ESC-CMs天4、5、7和9的区别是评估治疗后50 - 100 ng / mL学报。在第四天,EBs展出一个可比外表无论ActA浓度应用(数据未显示)。在天5、7、9,圆形状的EBs在控制条件和形成高浓度的学报(50或100 ng / mL)被添加到中胚层诱导媒介(图3(一个))。在控制和高剂量ActA条件,EBs包含很大的表面积收缩CMs(补充在线视频1 a和1 d e,在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/4651238)。发现没有明显的附加增殖的影响学报EB-based心脏分化(图的第二天3 (b))。跳动的频率均值EBs接受50和100 ng / mL学报,分别为54 ()和66年(48()次/分钟,)次/分钟的控制(图3 (c))。自发的跳动EBs观察分化的第十天。感染人类ESC-CM EBs的比例为61% (分别)为控制条件,增加到71% ()和88% ()EBs接受50和100 ng / mL学报,导致显著增加感染EBs(图3 (d))。确认ActA CM分化效率的影响,我们的基因表达谱分析晚期厘米标记TNNT2和cMyHC。在7天的区别,的表达TNNT2和cMyHC在EBs调节治疗50或100 ng / mL学报相比,控制条件(图3 (e))。因此,体外厘米分化与高剂量的更高效的学报(50和100 ng / mL),导致更高的早期CM成熟。

3.3。苯丙酸诺龙一个增加HNF4α⁺在心脏分化的细胞群

与前面描述的一致HNF4α基因表达分析在ActA-induced心脏分化(图2 (d),右面板),免疫染色证明HNF4α⁺endoderm-like细胞存在,此外,在靠近cMyHC⁺CMs在7-day-old EBs在控制和50和100 ng / mL ActA治疗条件(图4(一))。向HNF4 ActA促进了分化α⁺证明endoderm-like细胞群通过mesendoderm感应HNF4的量化α⁺核,增加到18% ()和19% (分别在50和100 ng / mL ActA治疗条件比例为9% (控制(图)报道4 (b))。ActA也cMyHC的比例增加⁺细胞,62% (50 ng / mL)和69% (100 ng / mL ActA)治疗细胞比例为49% (控制条件(图)4 (b))。因此,添加高浓度的学报cMyHC的比例增加⁺CMs,确认增加HNF4α⁺endoderm-like细胞生成由学报。

3.4。得罪CRIPTO-1信号受损心肌细胞分化

了解学报的影响除了TGF -的成员的表达β信号通路在ESC EB-based心脏分化在人类环境中,基因表达分析节点,CRIPTO-1,我和跨膜类型(ALK4或ACVR1B)和二世(ACVR2A和ACVR2B)激活素受体。没有观察到显著差异的表达水平ALK4,ACVR2A,和ACVR2B为了应对不同ActA浓度(支持信息图。1)。然而,的表达节点和CRIPTO-1成绩单在ActA剂量依赖性的方式显著增加天2和4 (ActA效果观察到天7)存在剂量依赖的相关性,表明这两个信号分子(图密切相关5(一个),左和右面板)。在人类的ESCs未分化,CRIPTO-1基因表达已被证明是高(图5(一个),右面板虚线)。在分化,CRIPTO-1表达显著降低在控制条件下从第二天开始。ESCs人类对待不同ActA浓度表现出剂量依赖性增加CRIPTO-1比控制水平上观察到的第二天。当处理100 ng / mL学报,CRIPTO-1记录在第二天保持在表达水平无差别的人类的ESCs中找到。从第四天开始,CRIPTO-1在所有条件(图内容大幅下降5(一个),右面板)。确认CRIPTO-1的重要性在心脏分化,CFC1 / CRIPTO-1阻断肽(CRIPTO-1 BP)从天添加0直到第二天分化结合100 ng / mL学报(支持信息图。2)。添加CRIPTO-1 BP导致显著下降啊第二天(图记录水平5 (b))。此外,我们观察到在EB结构损伤的存在CRIPTO-1 BP(图5 (c)和补充在线视频2 a - b)。击败EBs的百分比是评估13天。CRIPTO-1 BP显著降低击败EBs的百分比从80% ()到17% ()(图5 (d))。此外,跳动的表面区域减少CRIPTO-1 BP的存在(与)(图5 (e))。因此,高浓度的学报保持高水平的CRIPTO-1表达式在心脏分化的早期阶段。阻止CRIPTO-1信号通路受损心脏体外分化。

3.5。CRIPTO-1表达的是苯丙酸诺龙A-Induced HNF4α⁺Endoderm-Like细胞

已经表明,Cripto-1高度在小鼠mesendoderm细胞(32,33),分化,它可以促进厘米(31日,34]。然而,在人类环境中,表达的细胞分数CRIPTO-1仍然是未知的。我们假设HNF4α⁺ActA endoderm-like细胞,诱导,可能表达CRIPTO-1的膜结合对碘氧基苯甲醚。因此,HNF4α⁺细胞可以负责通过CRIPTO-1-mediated机制改进的CM分化效率。通过流仪分析,未分化的人类HNF4 ESCs CRIPTO-1呈阳性和消极α图3 a - b(支持信息)。的CRIPTO-1⁺HNF4α⁺细胞群是量化的第三天心脏分化的比例变化在ActA浓度的方式(图6)。在控制条件下,9.52% ()的分化细胞双阳性CRIPTO-1 HNF4α(第一个面板)。在10到25 ng / mL ActA条件下,双阳性细胞的数量与控制(第二个和第三个面板)。然而,CRIPTO-1的百分比⁺HNF4α⁺分别在高剂量的细胞增加学报,19.20% (50 ng / mL ActA)和22.00% ()100 ng / mL学报(第四和第五小组)。这些结果与HNF4疣状数据一致α量化(图4 (b))。这些数据表明,高剂量的50和100 ng / mL ActA HNF4的比例增加α⁺endoderm-like细胞群表达CRIPTO-1的表面束缚分数。

3.6。苯丙酸诺龙治疗在早期心脏对心肌细胞分化成熟支持

对于心脏分化,我们使用25 ng / mL BMP4和5 ng / mL bFGF启动中胚层诱导。诱导NKX2.5⁺心脏祖细胞,IWR-1 Wnt信号通路抑制剂添加4天(支持信息图4 a - c)。IWR-1人类可以直接向一个atrial-like ESC-CM分化表型(41]。CM亚型规范研究学报,APs的分离分析了EB-CMs 25天的区别使用膜片钳技术(数字7(一)- - - - - -7 (c))。首先,我们测量了静止膜电位(RMP)(图7(一))。细胞治疗与学报()极化的RMP−70 mV或者更消极,而细胞没有ActA RMP ()表现出更多的异构分布。这些数据表明较低程度的成熟没有学报。据美联社特点,研究细胞与低RMP(即。,比−40 mV,更积极)被排除在外。然后,APD30 APD50复极化(30%和50%)早期复极化测量APs(图的属性7 (b),正确的和左面板)。在缺乏学报,早期复极化(低APD30)似乎是常见的细胞(11/15有APD30低于15 ms与4/11细胞ActA)。此外,这也可以观察APD50 8细胞有一个APD50低于30 ms没有学报和与学报。这表明,有一个趋势,细胞有更明显的高原期学报的存在。根据总体概要文件和以前测量的属性(APD50 APD30),我们分类细胞atrial-like或ventricular-like表型(数字7 (c)- - - - - -7 (d)),没有ActA 9/15细胞有atrial-like概要和4/11细胞学报(费雪的测试= NS)。然而,重要的是要注意,有一个光谱的APs atrial-like ventricular-like表型,最近中描述人类iPSC-CMs [42]。后40天的文化,我们也可以观察胞质Ca^{2 +}瞬态伴随刺激APs(图6(e)和补充在线视频3)。从这些数据来看,这里使用的协议为心脏分化(有或没有100 ng / mL ActA)允许生产的心房,ventricular-like CMs与美联社和Ca^{2 +}瞬变,显示趋势更均匀的表型与学报极化。

4所示。讨论

人类的ESCs展览可能产生功能性细胞类型可以作为可再生研究胚胎发生和细胞来源,因此,在信号通路参与获得更好的见解PSC-driven分化,包括家族规范,血统的承诺,和终端分化。

在当前的研究中,我们分析了学报的作用早期形成的原条,从人类中胚层和内胚层的ESCs期间心脏分化。我们演示了,在这里描述心脏分化协议,高浓度的学报在分化的人类的初始步骤的ESCs对CMs普遍ventricular-like美联社表型和美联社和Ca^{2 +}处理属性类似于成熟的心脏细胞。研究细胞间相互作用中胚层和内胚层的细胞群,一个EB-based心脏分化系统应用,代表更好的人类心脏的三维(3 d)环境中发展。临床上更相关的无血清培养系统EB-based协议被称为替代我们的协议,但效率较低,因此不适合中胚层和内胚层的交互研究[38]。转化为目的,在无血清条件下单层是最相关的协议生成人类ESC-derived心室CMs药理筛选或者开发一个平台来研究心脏疾病。

几项研究已经进行了探索TGF -之间的相互作用βActA /节点、bFGF和BMP信号通路在早期细胞命运的决心。然而,冲突的结果对这些通路的影响存在于老鼠和人类的ESCs。单独添加学报已被证明维持自我更新属性(43)和《/节点一起bFGF信号协调维持多能性在人类的ESCs [44]。研究老鼠的ESCs表明BMP4或学报单独或结合诱导原条标记,即使BMP4似乎发挥主导作用[45,46]。最近,Fiorenzano等人报道的早期功能CRIPTO-1在第一个血统决定由早期的胚胎。CRIPTO-1是最早的外胚层标记和功能发挥了关键作用的获取和维护老鼠和人类的多能性。此外,他们需要证明CRIPTO-1生成和维持bFGF / ActA EpiSCs和缺CRIPTO-1倾斜ESC体外分化对滋养层血统(35]。

抑制ActA信号阻塞mesendoderm BMP4治疗老鼠ESCs感应,而BMP4信号抑制mesendodermal细胞分数没有影响体外培养中观察到处理学报,从而指出学报/节点信号的关键作用mesendoderm形成。此外,ActA诱导高水平的前mesendoderm /早期内胚层标记,Foxa2和Sox17,而BMP4稍微调节这些基因(46]。同样,鼠标的ESCs接受高水平的学报分化更前连续的命运,包括心脏中胚层和明确的内胚层[14]。人类已经有证据表明,短期BMP4 ESCs治疗人类提升中胚层分化(47]。还有证据表明尽管ActA信号是宽容人类ESCs向mesendodermal细胞的分化命运,这是不够的。然而,人类PSC中胚层分化,并随后CMs,更健壮当BMP4的组合/学报(21]或BMP4的组合、bFGF和学报(使用20.]。有趣的是,一项研究报道,分化的人类的ESCs BMP4但没有ActA导致减少生成mesendoderm生存率和降低效率和/或中胚层(47]。与这些研究一致,我们证明了ActA结合BMP4和bFGF的表达增加早期内胚层的标记SOX17和明确的内胚层的标记HNF4α在人类的ESCs。最近,monolayer-based心脏分化协议已经发表,应用Wnt信号受体激动剂CHIR结合高或低水平的学报(48]。这项研究并不是与我们的数据对比。事实上,作者与我们的结果一致表明,coinduction CHIR和高学报水平诱导的内胚层,而较低的CHIR补充ActA cardiomyogenic效率提高水平。相比之下,CHIR +低水平的BMP4一贯强烈抑制cardiomyogenesis。与我们的工作,我们扩展这项研究并提供了新颖的机械的见解。我们确定的upregulation内胚层的基因SOX17和HNF4α增加CRIPTO-1 ActA添加在CM早期分化时发出信号。

ActA /节点/ CRIPTO-1信号中扮演一个重要的角色在维持人类的ESCs处于未分化的多能性状态(49,50]。几个以前发表论文指出Cripto-1鼠标cardiomyogenesis作为一个关键球员。类似于我们的CRIPTO-1阻断实验,CRIPTO-1基因敲除小鼠的ESCs生成超过CMs体外(缺乏能力31日]。Minchiotti等人证明了节点/ Cripto-1通路参与了小鼠ESC分化功能击败CMs,同时防止neuroectoderm分化(33,50,51]。此外,mesendodermal Cripto-1[细胞高表达32,33]。Cripto-1的动态信号,包括时间,强度,和持续时间的信号,被描述为正确规范和分化的关键心脏血统。Cripto-1信号需要在早期启动代理窗口时间,和Cripto-1瞬态存在的不足,而持续Cripto-1信号(至少24小时)被要求促进cardiomyogenesis [33]。另一项研究报道,hypoxia-mediated mesendoderm形成小鼠ESC分化,分化,随后厘米,通过Cripto-1-mediated发生信号通路(34]。然而,这些研究成功地定义一个人类起源CRIPTO-1表达式。在我们的研究中,我们证实了学报、剂量依赖性的方式,增加了CRIPTO-1成绩单在混合EB后代。我们首次显示,在一个EB-based分化的人类对CMs ESC, CRIPTO-1感应被要求对CMs诱导分化。CRIPTO-1存在作为细胞膜或分泌同种型,精确的细胞表达CRIPTO-1考试是困难的。我们观察到学报的加入导致大大增强HNF4人口α⁺内皮细胞在EB产物。我们的数据表明,在ActA暴露EBs, HNF4α⁺endoderm-like CRIPTO-1细胞群表达HNF4 CRIPTO-1表达式α⁺细胞保持在水平被发现在未分化的人类ESC分化的第二天。因此,我们建议HNF4α⁺细胞可以增加人类的重要贡献者CM通过CRIPTO-1分化信号机制。

与我们的结果一致,哑剧等人已经确定内脏内胚层细胞的分子信号,导致人类的ESCs区分CMs (4]。进一步的研究将有助于了解如果HNF4α⁺细胞最初的内脏内胚层分化诱导促进厘米,最终成熟为了建立健壮的CM分化从人类的ESCs的协议。

将高水平的胰岛素在心脏分化的早期阶段被证明产生强烈抑制影响cardiomyogenesis [52]。事实上,在最近的一篇论文中,胰岛素可以抑制心脏中胚层,但不是mesendoderm形成,在利用TGF -心脏分化诱导β总科配体。然而,作者声称,规范Wnt信号通路的调制可以拯救这个insulin-mediated抑制(53]。我们证实胰岛素的释放的抑制作用通过添加Wnt抑制剂IWR-1在心脏祖细胞阶段。

人类PSC-CMs药物发现提供了一个可能相关的模型系统。尽管他们是否适合毒性测试和安全药理学,他们的应用程序在小说验证药物候选心房或ventricular-specific心脏疾病需要体外文化丰富心房或ventricular-like CMs。目前,心脏分化协议的人类已经结果通常在异构的心房,心室和nodal-like CMs (3]。最近出版的一篇论文报道的重要性外源添加维甲酸(RA)在心房室人力ESC分化细胞发展(54]。与Wnt抑制剂治疗区分人类的ESCs IWP-4 IWR-1,导致CMs心房和心室表达水平的差异,分别MLC-2a和MLC-2v(55]。抑制Wnt信号通路通过IWR-1已被证明向主要区分人类ESC-CMs atrial-like CMs (41]。然而,冲突的数据存在(56]。人类的ESCs,受到与ActA协议中描述的这个研究,极化和有一个主要的趋势心室美联社表型。进一步的研究将检验这种表型的持久性和进一步发展在以后的时间点。有趣的是,细胞治疗ActA展出RMP−70 mV或者更消极,而RMP没有ActA的细胞治疗显示出更多的非均匀分布,提出一个较低程度的CM成熟没有学报。

总之,高浓度的学报在最初阶段EB-based心脏分化增强内皮细胞的人口,进而促进分化的人类ESCs对CMs,在早期分化和成熟,改善收缩EBs的跳动频率和百分比。

信息披露

列文Thorrez和Maurilio Sampaolesi联合高级作者分享。

相互竞争的利益

所有作者声明没有潜在的利益冲突。

确认

罗宾Duelen和Abdulsamie Patel是支持的KU鲁汶Rondoufonds voor杜乡Onderzoek。作者想请谢谢艾略特等人向他们提供人类ESC线。这项工作一直支持的贡献“开启未来”的活动(ejj - optfut - 02010) CARIPLO 2015 _0634 FWO (G088715N #, G060612N #和# G0A8813N),果阿(EJJ-C2161-GOA / 11/012), IUAP-VII / 07 (EJJ-C4851-17/07-P), OT # 09 - 053 (EJJ-C0420-OT / 09/053),项目金融家干细胞(PFO3 10/019), AFM-Telethon拨款。贡纳·m·Buyse是研究基金会的高级临床研究员佛兰德斯(FWO Vlaanderen,比利时)。

补充材料