标志“src=

干细胞国际
PDF
干细胞国际/2017年/文章
特殊的问题

在干细胞小生境：互动干细胞与环境之间

查看此特刊

研究文章|开放访问

体积 2017年 |文章ID. 4576327 | https://doi.org/10.1155/2017/4576327

阿米尔·优素福，维克多K. M.汉那 “的胎盘来源的成骨分化的调控间充质干胰岛素样生长因子和低氧压细胞“，干细胞国际那 卷。2017年那 文章ID.4576327那 17. 页面那 2017年． https://doi.org/10.1155/2017/4576327

的胎盘来源的成骨分化的调控间充质干胰岛素样生长因子和低氧压细胞

阿优素福1那2那3.和 维克多·k·m·韩1那2那3.那4.

1加拿大伦敦Schulich医学和牙科学院生物化学系

2西部大学儿童健康研究所，伦敦，加拿大

3.劳森健康研究所，西部大学，伦敦，在加拿大

4.舒立克医学和牙科学院儿科系，伦敦，安大略省，加拿大

学术编辑器:纱丽彭宁斯j .
收到了 2017年2月27日
公认 2017年7月20日
出版 2017年9月12日

摘要

胎盘间充质干细胞（PMSCs）是可以区分的多能细胞体外多个谱系，包括骨骼。胰岛素样生长因子（IGF，IGF-1和IGF-2）参与维持许多干细胞的生长，存活和分化，包括骨催化剂。低氧气张力（PO2)可以维持干细胞的多能性，阻碍成骨分化。在本研究中，我们研究了低PO是否影响PMSC成骨分化2并通过IGFS。我们的结果表明低宝2成骨标志物RUNX2和OPN降低;然而，再次暴露于较高的氧张力(室内空气)恢复了分化。igf，尤其是IGF-1，引发RUNX2早期表达，增强OPN和矿化。RUNX2在室内空气中磷酸化并被igf增强。低PO时IGF-1受体(IGF-1R)升高2并通过胰岛素样生长因子减少，而胰岛素受体（IR）在鉴别私营军保增加和增强由IGF-1。低PO2并且IGF保持更高的IR-A，其在室内空气中切换到IR-B。骨质发生分化需要pi3k / akt，而MEK / ERK被要求抑制RUNX2和OPN在低PO中增加2．因此，igf，特别是IGF-1，在室内空气中引发更早开始的成骨分化，而低PO是可逆的2通过维持较高的多能性和较低的分化标记来阻碍完全分化。

1.介绍

间充质干细胞（MSCs），在许多成人组织中，负责组织修复和再生损伤或疾病[之后1］.与胚胎干细胞(ESCs)不同，MSCs的致瘤性较低，且对肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、间质成纤维细胞和内皮细胞的间内胚层谱系特异性分化较为受限[1-4.]. 此外，骨髓间充质干细胞可以调节免疫反应，并已成功用于移植物抗宿主病患者[5.]. 因此，骨髓间充质干细胞是治疗许多成人和儿科疾病（如镰状细胞病）的干细胞疗法的有希望的候选者[6.]、风湿病[7.]，淋巴瘤[8.，以及心力衰竭[9.]. 在骨方面，MSC移植已被用于纠正骨畸形和损伤。在儿童中，成骨不全（OI）是一种严重的间充质细胞遗传性疾病，缺乏I型胶原，这对基质沉积和矿化很重要[10.］.有没有治疗OI;然而，同种异体骨髓移植已被证明成功地加速线性生长和OI儿童增加全身骨矿物质密度[10.］.

虽然骨髓MSCs用于干细胞疗法[11.那12.，胎盘间充质干细胞(PMSCs)丰富且易于获取，不需要侵入性技术进行分离[13.］.从胎盘（羊膜，绒毛膜和胎膜）的不同隔室中分离PMSCs，并且比骨髓MSC的增殖能力较高[13.]. MSCs依赖于其周围的微环境来维持干细胞的特性[14.那15.，它们通过特定的促进因子分化，通过紧密的转录网络信号传递多效性缺失和启动家族特异性祖细胞分化。在成骨细胞分化中，runt相关转录因子2 (RUNX2)是起始转录因子，上调骨基质沉积和矿化所需基因的转录，包括骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)、I型胶原和碱性磷酸酶[16.-19.］.runx2由丝裂剂激活的蛋白激酶（MAPK）在C-末端脯氨酸 - 丝氨酸 - 苏氨酸（PST）区域中磷酸化，这是其转录活性和与骨基基因的启动子区域的转录活性和DNA结合所必需的，例如OPN和OCN[20.那21］.

干细胞分化条件由可溶性因子、小分子、激素和生长因子控制[15.］.胰岛素样生长因子(igf, IGF-1和IGF-2)可以促进和刺激干细胞从所有三个胚层向多个谱系分化[22-26]，包括成骨细胞分化[27] 和体内骨骼发育(28那29］.IGF-1和IGF-2与它们的受体IGF-1R具有成骨强关联，并丰富地在自分泌/内分泌机制成熟的成骨细胞和破骨细胞[特异性表达27］.IGF-1-和IGF-1R-NULL小鼠表演欠发达的短骨，低骨矿物质密度和延迟钙化，而IGF-2-NULL小鼠没有显示出主要的骨骼缺陷[28］.因此，IGF-1和IGF-2在成骨分化中可能具有不同的功能。

体内，缺氧诱导的Fator-1α.- （HIF1.α.- ）敲除小鼠具有降低的骨小梁体积，降低的骨形成率，并且长骨发育过程中减少的成骨细胞增殖[30.］.相比之下，过表达HIF1α.在成骨细胞中导致产生极其密集，严重血管化的长骨骼[31］.因此，低氧张力，稳定HIF1α.是骨骼健康发育所必需的基因调控。在体外，低氧张力促进干细胞增殖、自我更新和多能性[32而抑制成骨细胞分化[33］.然而，再暴露于室内空气恢复完整分化和会增强成骨细胞分化[34那35]．因此，长期暴露于低氧张力对干细胞分化有抑制作用，而短期暴露可在引导干细胞走向更强健的成骨分化中发挥作用[34］.

igf和低氧张力是成骨微环境的自然生态位成分，在MSC分化矿化期影响成骨分化的后期阶段[36那37］.然而，这两种微环境因素对承诺和早期分化阶段的联合作用尚不清楚。在本研究中，我们使用早产儿PMSCs研究IGF-1和IGF-2信号通路联合低氧张力在成骨分化中的作用。我们发现低氧张力抑制PMSC成骨分化，IGF-1比IGF-2更能通过IGF-1R/IR、PI3K、MEK1/2和RUNX2磷酸化介导的特定信号通路促进分化。

2.材料和方法

2．1.PMSC隔离

PMSCs分离自妊娠早期(10-13周)人胎盘。经知情同意后，收集治疗性终止妊娠患者的胎盘。术后立即在无菌条件下剥离胎盘，收集小块绒毛膜绒毛。组织样本被机械地切碎，经过两个步骤的酶解(1)胶原酶/透明质酸酶(2)脱氧核糖核酸酶(I)和(3)胰蛋白酶/EDTA。每一步酶解在37°C下进行20分钟，然后在4°C添加10%胎牛血清(FBS)的PBS溶液中洗涤10分钟(Gibco, Mississauga, ON)。在消化过程中释放的细胞通过组织网(45μ.M)获得单细胞悬液。接下来，根据Worton等人修改的用于造血干细胞分离的方案，在Percoll (Sigma)不连续梯度上分离细胞[38]，然后在添加10%胎牛血清和抗菌抗真菌液的DMEM/F12培养基(Gibco, Mississauga, ON)中播种。4天后，更换培养基，用培养基冲洗非贴壁细胞，留下贴壁的PMSCs形成菌落。流式细胞术检测细胞表面标记物CD90、CD73、CD105和CD117/c-kit的存在与否[39］.

2.2。低氧张力溶液的骨质分化和孵育

使用含有10% ES-FBS和FGF-2 (100 ng/mL)的DMEM/F12培养基培养和维持细胞(Gibco, Mississauga, ON)。治疗前，细胞在DMEM/F12中只添加10%胎牛血清培养。治疗后，在未分化条件(15%胎牛血清/DMEMF12)或存在成骨刺激条件(15%成骨分化胎牛血清，10−8. M地塞米松，50 μ.g/mL抗坏血酸，3.5 mMβ-甘油磷酸)(STEMCELL Technologies, Vancouver, BC)对于IGF-1或IGF-2处理，将100 ng/mL的IGF加入到降低胎牛血清水平的2%碱性成骨分化培养基中;每次媒体改变都添加了全新的igf。采用茜素红和碱性磷酸酶染色比较不同IGF和氧张力处理对钙沉积的相对影响。U0126的持续存在抑制了MEK/ERK通路或PI3K/AKT通路的信号通路(5μ.或LY294002 (10μ.分别。然后将细胞培养物置于5％CO中2培养箱或低氧室，其中充满1% O2，5％CO2，和平衡N2(BOC Canada Ltd, Toronto, ON)使用Hudson 5590氧气监测器(Hudson, Ventronics Division, Temecula, CA) 15分钟以确保饱和。随后，将该室置于37°C的组织培养箱中。

２.３.茜素红染色及定量

为了评估分化细胞与未分化细胞的这些形态学变化，将细胞培养14天，然后用4%甲醛固定30天 然后，细胞用1%茜素红溶液染色10分钟 根据制造商的协议，在室温下或使用NBT/BCIP试剂（载体实验室，伯灵顿，ON）时的最小值。然后用10%氯化十六烷基吡啶在10%溶液中溶解两种染色 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.0）如前所述[27］.吸光度为200 μ.L可溶性染色在以下时间读取：λ.= 570 nm，使用平板阅读器。然后将吸光度归一化为每孔的总蛋白质含量(以微克计)。

2.4. 骨髓间充质干细胞胰岛素受体亚型的RT-PCR检测

根据制造商的协议，使用Purelink RNA Mini Kit（Ambion，Burlington，On）从分化和非异化的PMSC中提取总RNA。1-3 μ.采用RT-PCR (Invitrogen, Burlington, ON)和oligo (dT)的上标III第一链合成系统逆转录总RNA20.引物。终点PCR反应在25μ.L使用Eppendorf 96孔板热循环仪。人类IR.使用引物扩增外显子11包括被检测到相同的cDNA样品中的同种型IR-B(250 bp)或不包括IR-A(214 bp)，并放大如先前公布的[40］.人类RPL13a水平被用作靶MRNA的标准化的参考内源性控制。扩增条件在92℃下在92℃下运行5分，然后30秒循环30秒，60℃，30秒，72℃，30秒。

2.5. 免疫印迹

为了检测蛋白水平的变化，10-20 μ.g每个细胞裂解物样品通过SDS-PAGE分离，然后转移到PVDF膜上（马萨诸塞州贝德福德市密理博）．用5%牛血清白蛋白或5%脱脂奶粉在1x TBS (tris缓冲盐水)中室温封闭膜1小时。然后将印迹用1x TBS 0.1% Tween 20 (TBS- t)洗涤(3× 5分钟)，然后根据制造商的协议，用一抗在4°C孵育过夜。然后用TBS-T (3× 10分钟)洗涤印迹，rt时用相应的酶标二次抗体孵育1小时。免疫复合物用ECL检测，并用VersaDOC™成像系统(Bio-Rad)记录。

2.6。抗体

在本研究中，使用以下抗体检测IGF系统：磷酸化p44/42 MAPK（#4377）、p44/42 MAPK（#9102）、磷酸化AKT（Ser473，#4051）和AKT（#9272）（细胞信号技术，伯灵顿，ON）和IGF-1Rα.（N-20，SC-712）和IR-α.（N-20，SC-710）（Santa Cruz Biotech。，Santa Cruz，CA）。对于多因素标记，我们使用Oct3 / 4抗体（N-19，SC-8628）（Santa Cruz Biotech。，Santa Cruz，CA）和Sox-2（2683-1）（Epitomics，Burlington，On）。对于成骨分化标记，我们使用了Runx2（＃8486）（Cell Mixicaling Technologies，Burlington，On），磷酸-Runx2（PA5-12988）（Thermo Fisher Scientific，Burlington，On）和OPN（K-20，SC-1059）（Santa Cruz Biotech。，圣克鲁斯，加利福尼亚州）。对于加载控制，我们使用了Pan-Actin AB-5（＃MS-1295）（Thermo Fisher Scientific，Fremont，CA）。用于免疫印迹的二次抗体是山羊抗兔（＃170-6515），抗小鼠（＃170-6516）HRP缀合的抗体（Bio-rad Laboratories，Hercules，Ca）或驴抗山羊抗体（SC-2020）（Santa Cruz Biotech。，圣克鲁斯，加利福尼亚州）。

2.7。统计分析

所有实验从三个独立实验中分三次进行；只要有可能，从早产胎盘中使用三条或更多的PMC原代细胞系。所有图表和分析均使用GraphPad Prism软件5.0（GraphPad软件，加利福尼亚州圣地亚哥）生成。采用Bonferroni事后检验的双向方差分析用于PMSC WST1增殖试验和密度定量。数据以平均值表示 ± 平均值的标准误差（SEM）；当 ．

3.结果

3.1。低氧张力对PMSC成骨分化的影响

在分化条件下，经茜素红染色，PMSCs在室内空气中14天的形态变化更大(图)1（a）和1（b））.与室内空气相比，低氧张力稳定HIF1α.第14天细胞增殖增强(图S) 在线提供https://doi.org/10.1155/2017/4576327）但在同一时间段内抑制成骨分化（图1（a）和1（b））.基于染色的定量，PMSCs在低氧张力抑制的第3天在室内空中的骨质酸样细胞中显示出自发的分化（图1（b））.因此，低氧压力阻止了自发和成骨介质来源的pscs分化。

（一种）“name=
（一种）
（b）“name=
（b）
(c)“name=
(c)
(d)“name=
(d)
（e）“name=
（e）
（F）“name=
（F）
（G）“name=
（G）
图1
低氧胁迫下PMSC的分化及其对成骨分化和多效性的影响。在含15%胎牛血清的无分化或成骨分化条件下，在室内空气(20% O2）或低氧水平（1％O2）.处理被停止后1，3，7，10，和14天的茜素红染色，以确认（a）中PMSC分化的形态和在（b）中（两因素方差分析进行定量， 那 ）. 表示房间空气和每个时间点之间的低氧气张力之间的显着性;小写字母（A，B和C）表示室内空调内的时间点之间的显着性，大写字母（A，B）表示在低氧气张力范围内。（c）免疫印迹显示来自在3,7和14天中分离的细胞裂解物的多能性相关和分化标志物的蛋白质水平。第14天的量化样本显示（D）OCT4，（E）SOX2，（F）RUNX2和（G）OPN在非异化和分化条件下的蛋白质水平。所示量化水平被归一化为β-肌动蛋白，蛋白负载控制(双向方差分析， 那 ）. 指示室内空气与低氧压之间的显著性;#表示在相同氧张力下无分化和分化的显著性。

到监视器PMSC多潜能和分化，多能性相关蛋白OCT4和SOX2和早期成骨承诺转录因子RUNX2和OPN在第3天，第7测量的以后的标记，和14中的水平（图1（c））.尽管PMSCs处于分化状态，但OCT4和SOX2水平在低氧压力下始终高于室内空气(图)1（c））.分化后第14天，OCT4水平在室内空气中轻微升高，在低氧压力下降低(图)1（d）)，而SOX2水平在室内空气和低氧压比无分化条件下略有下降(图1 (e)）.当在室内空气分化将其通过低氧分压降低RUNX2水平增加（图1 (f)）.虽然Runx2在室内空气中的第3天鲁棒地增加，但是通过OPN表达证明，分化和基质形成的后期标记逐渐发生成骨分化（图1 (g)）.再次，低氧张力抑制了OPN水平的增加。因此，低氧张力通过维持较高的多效性(较高的OCT4和SOX2)、降低早期承诺(较低的RUNX2)和后期分化(较低的OPN)来降低成骨分化。

3.2。低氧张力对成骨分化的抑制作用的可逆性

我们评估了低氧张力是否不可逆地阻断PMSC分化通过在暴露于低氧气张力之后通过再暴露于室内空气而进行分化。通过将PMSCS引入房间空气，在过去7天的分化中，茜素红染色增加到室内空气中的相似水平（图2（a）和2 (b)(左)。碱性磷酸酶染色也证实了这一效应，其水平甚至高于室内空气(图)2（a）和2 (b),对吧)。此外，再暴露于室内空气减少OCT4和SOX2水平相比，低的氧张力（图2 (c)和2 (d)和S ）.当再次暴露在室内空气中时，RUNX2水平也显著增加(图)2（e）和S ）.这些数据表明，低的氧张力能降低，但不会阻止私营军保公司的成骨分化。

（一种）“name=
（一种）
（b）“name=
（b）
(c)“name=
(c)
(d)“name=
(d)
（e）“name=
（e）
图2.
低氧预处理对PMSC成骨分化和多能性的影响。在含有15%FBS的非分化或成骨分化条件下，在室内空气（20%O2）或低氧水平（1％O2)，持续14天，如图所示1．对于低/室处理，在低氧中培养PMSC 7天，然后在室内空气中进行7天（在第三面板中）。茜素红或碱性磷酸酶染色用于检测钙沉积和酶表达的变化，如（a）的形态学上所示，并在（b）中量化（双向Anova， 那 ）;小写字母（a，b和c）表示nondifferentiation条件，大写字母内的氧气张力的作用之间的显着（A，B，C）表示分化的条件内。从图小号所示的免疫印迹 (c) OCT4、(d) SOX2和(e) RUNX2的蛋白水平。所示量化水平被归一化为β-肌动蛋白，蛋白负载控制(双向方差分析， 那 ）. 指示室内空气与低氧压之间的显著性;小写字母（A，B和C）表明非异化条件下的氧张力效应之间的意义，大写字母（A，B和C）表示在分化条件下。
3.3。胰岛素样生长因子对低氧张力下PMSC成骨分化的影响

在室内空气或低氧压力条件下，每改变一次培养基，加入新鲜剂量的IGF-1或IGF-2 (100 ng/mL)，持续14天，研究igf在介导分化过程中的作用(图)3(一个)和3（b））.在非异化条件下，茜素红染色的增加表明室内空气中自发分化的增加（在第7天增强，IGF-1和IGF-2的第14天）（图3 (c))在低氧紧张状态下更少（仅在第3天，两种IGF没有进一步增加）（图3 (e)）.在分化条件下，igf (IGF-1高于IGF-2)在形态学上增强了成骨分化，在室内空气和低氧压力下都是如此，这可以通过增加钙化中心的数量和更高层次的细胞组织显示出来——如强烈的茜素红染色所示(图)3（b）和3 (g)）.有趣的是，IGF-1和IGF-2中的室内空气增强染色强度开始在第3天，并在第7天达到最大，而控制（游离IGF-条件）所需的14天达到相同的电平（图3 (d)）.低氧压降低了PMSC的分化，抑制了IGF-1或IGF-2的作用(图)3 (f)）.

（一种）“name=
（一种）
（b）“name=
（b）
(c)“name=
(c)
(d)“name=
(d)
（e）“name=
（e）
（F）“name=
（F）
（G）“name=
（G）
图3.
低氧张力下的PMSC分化由IGF调节。在室内空气中在存在或不存在100ng / ml的IGF-1或IGF-2的情况下，在含有2％FBS的非异细胞化或分化条件下培养PMSCs在室内空气中（20％O.2）或低氧水平（1％O2). 在（a-b）茜素红染色3、7和14天后停止治疗，并在（c-d）中进行量化（双向方差分析， 那 ）.X表示没有igf的不同天数间的显著性;#表示当天添加IGF与未添加IGF相比的显著性。(g)高倍镜下可见第14天茜素红染色的分化PMSCs的钙化中心和细胞组织。

igf对PMSC多能性和分化标志物的影响也通过免疫印迹法进行了测定(图S) ）.在室内空气中，igf (IGF-2高于IGF-1)在第3天和第7天保持较高的OCT4水平，在第14天消失(图)4(一)(左)。在低氧压力下，igf在分化过程中保持较高的OCT4水平(图)4(一)(右)。SOX2在第3天室内空气中仅通过IGF-1增加（图4 (b)(左)。在低氧压力下，IGF-1和IGF-2在分化过程中维持较低水平的SOX2(图)4 (b),对吧)。相比之下，RUNX2在分化早期(第3天)由IGF-1和IGF-2增加，仅在第14天由IGF-1维持在较高水平(图)4 (c)(左)。低氧压消除了IGF-1对RUNX2的影响(图4 (c),对吧)。然而，似乎上RUNX2水平增加IGF-1效应是由低氧张力暴露于室内空气（图年代后延迟，在预处理研究 ). 在没有IGFs的情况下，第14天在室内空气中OPN增加（图4 (d)而IGF-1仅在室内空气中增加了第7天的OPN水平，并在第14天进一步增加(图)4 (d)(左)。在另一方面，IGF-2相反IGF-1和引起OPN水平的降低。低氧分压抑制在OPN水平的任何增加，并且还防止在室内空气中所示的IGF-1介导的增加（图4 (d),对吧)。这些数据支持该IGF-1在成骨分化中具有重要作用，并且需要更高的氧气张力来促进成骨分化。

（一种）“name=
（一种）
（b）“name=
（b）
(c)“name=
(c)
(d)“name=
(d)
图4
igf在低氧压力下调控PMSC的多能性和分化。在含2%胎牛血清、IGF-1或IGF-2 100 ng/mL或不含IGF-1或IGF-2的室内空气(20% O2）或低氧水平（1％O2）.3、7和14天后停止治疗。免疫印迹，见图S ，用于量化(a) OCT4， (b) SOX2， (c) RUNX2和(d) OPN随时间的变化。量化水平归一化为β-肌动蛋白，蛋白负载控制(双向方差分析， 那 ）.X表示没有igf的不同天数间的显著性;#表示当天添加IGF与未添加IGF相比的显著性。
3．4．胰岛素样生长因子受体在低氧张力下PMSC成骨分化中的作用

IGF-1和IGF-2可通过胰岛素样生长因子-1受体（IGF-1R）或胰岛素受体（IR），以促进增殖和分化信号。在室内空气，IGF-1R没有在分化改变，并没有因胰岛素样生长因子的影响，而IR在分化私营军保增加和上调由IGF-1（图图6（a）那6（b）,6 (c)）.在低氧压力下，IGF-1R在分化条件下升高，而IGF-1和IGF-2均降低(图)5 (b)而在分化条件下，IR没有变化(图)5（c））.IR以IR- a和IR- b两种亚型存在，可以决定干细胞的分化状态。较高的IR-B: IR-A比值可能表明成骨谱系的分化程度更高。在pscs中，未分化的pscs中IR-B: IR-A比值较低(图)6 (d)）.Upon differentiation, the level of IR-B : IR-A increased gradually in room air but not in low oxygen tension (Figure6（e））.这是由于低氧压力下IR-A的表达高于IR-B(图S) ,对吧)。在室内空气中，IGF-1或IGF-2较早地在第3天增加了IR-B: IR-A比值，而在第7天和第14天则降低了IR-B: IR-A比值，而在低氧压力下则始终保持较低的比值(图)6（f）和6（g））.

（一种）“name=
（一种）
（b）“name=
（b）
(c)“name=
(c)
图5
成骨分化过程中氧张力和IGF-1或IGF-2对细胞表面受体下游激酶信号传导的影响。与数字相似4.和6.在含2%胎牛血清、IGF-1或IGF-2 100 ng/mL或不含IGF-1或IGF-2的室内空气(20% O2）或低氧水平（1％O2). 3、7和14天后停止治疗。免疫印迹，如图S所示 ，用于定量(a) p-ERK1/2， (b) p-AKT和(c) p-RUNX2的蛋白水平。这些激酶/磷蛋白被归一化到它们的总激酶/磷蛋白水平β肌动蛋白(双向方差分析, 那 ）.X表示没有igf的不同天数间的显著性;＃表示IGF此外，在当天的IGF没有比较的意义; 表示室内空气和低氧张力之间的意义。
（一种）“name=
（一种）
（b）“name=
（b）
(c)“name=
(c)
(d)“name=
(d)
（e）“name=
（e）
（F）“name=
（F）
（G）“name=
（G）
图6
IGF-1R和IR水平及其同种型（IR-A和IR-B）在鉴别私营军保被氧张力和胰岛素样生长因子调节。PMSCs were cultured for 14 days in nondifferentiation or osteogenic differentiation conditions containing 2% FBS in the presence or absence of 100 ng/mL of IGF-1 or IGF-2 in room air (20% O2）或低氧水平（1％O2）.3、7和14天后停止治疗。免疫印迹用于检测在没有胰岛素样生长因子的随时间的（a）IGF-1R和IR的水平。免疫印迹的定量，在图所示的小号 ，示出了（b）上的IGF-1R的IGF-1或IGF-2的效果和（c）IR超过三天。水平标准化成β-肌动蛋白，蛋白负载控制(双向方差分析， 那 ）.X表示没有igf的不同天数间的显著性;#表示当天添加IGF与未添加IGF相比的显著性。通过终点PCR，测量IR-A与IR-B的mRNA水平并计算比率并标准化为（d）未分化的第0天PMSC，（E）差异，（f）与IGF的分化-1，（g）与IGF-2的差异（双向ANOVA， 那 ）. 指示室内空气与低氧压之间的显著性;小写字母（a，b）表示室内空调内的时间点之间的显着性，大写字母（a）表示在低氧气张力范围内。
3．5．下游胰岛素样生长因子信号介导成骨分化

IGF受体信号转导的下游激酶p-ERK1/2和p-AKT是介导IGF效应的主要信号激酶。在PMSCs中，p-ERK1/2在室内空气分化过程中逐渐下降，而在低氧压力下，在第3天和第7天维持较高水平(图)5(一个)）.无论氧张力如何，在第14天检测到ERK1/2水平显著下降。IGF-1或IGF-2的添加导致室内空气和低氧压力下p-ERK1/2水平进一步降低(图)5(一个)）.在室内空气中，甚至igf存在时，p-AKT均无显著变化(图5 (b)(左)。在另一方面，IGF-1分化期间增加在低氧分压P-AKT的水平（图5 (b),对吧)。在成骨分化期间，RUNX2通过MAPK（MEK1 / 2）磷酸化，其可以影响其DNA结合和蛋白质 - 蛋白质相互作用。仅在室内空气中，在没有IGF的情况下，P-Runx2水平在第14天升高，而另外增加IGF-1或IGF-2分别增加p-runx2水平至〜8和4折（图5（c）(左)。在低氧胁迫下，RUNX2磷酸化在整个分化过程中没有上调(图)5（c）,对吧)。

要指定的信令在介导PMSC分化激酶的作用，U0126和LY294002被用来抑制MEK1 / 2和PI3K，ERK1 / 2和AKT的上游激酶，分别。14天后，茜素红染色通过294002比U0126更低（图7(一)和7（b））不影响PMSC活力（图S ）.U0126并没有改变pscs分化时OCT4和SOX2的水平(图)7（c）和7（d））;然而，RUNX2和OPN在低氧分压（图分别增加7（e）和7 (f)）.这表明通过低氧张力抑制骨质发生分化可以由MEK1 / 2信号传导介导。LY294002减少OCT4，SOX2，RUNX2和OPN，在差异化条件下，但在低氧气张力方面有更多如此7（c）那7（d）那7（e）,7 (f)）.因此，PI3K信号在私营军保公司，保持多，促进成骨细胞分化的双重角色。

（一种）“name=
（一种）
（b）“name=
（b）
(c)“name=
(c)
(d)“name=
(d)
（e）“name=
（e）
（F）“name=
（F）
（G）“name=
（G）
（h）“name=
（h）
(我)“name=
(我)
图7
PMSC分化是通过MEK1/2、PI3K信号通路及其对ERK1/2、AKT、RUNX2磷酸化的抑制作用介导的。在含2%胎牛血清的室内空气(20% O2）或低氧水平（1％O2）.在14天内，细胞持续暴露于(5μ.M) U0126或(10μ.M)分化培养基中的LY294002。在14天时停止治疗，并用茜素红染色以确认(a)抑制剂对PMSC分化形态的改变，并在(b)中进行量化(双向方差分析， 那 ）.免疫印迹，见图S ，用于量化信号抑制诱导的（c）OCT4、（d）SOX2、（e）RUNX2、（f）OPN、（g）p-ERK1/2、（h）p-AKT和（i）p-RUNX2的蛋白质水平。量化水平标准化为β-肌动蛋白，蛋白质负载控制;此外，每个磷蛋白归一化到其总蛋白(双向方差分析， 那 ）. 指示室内空气与低氧压之间的显著性;#表示DMSO对照和抑制剂之间的显著性。

通过ERK1/2和AKT的磷酸化来评估抑制剂的作用。每48小时添加U0126和LY294002可减少ERK1/2和AKT的磷酸化（图S） ）， 分别。在分化的第14天，U0126在室内空气中降低了P-ERK1 / 2水平，而不是低氧气张力（图7 (g)）.LY294002在室内空气中抑制AKT磷酸化，甚至低氧气张力条件下降（图7 (h)），但Ly294002在低氧气张力下增加了P-ERK1 / 2水平（图7 (g)）.Runx2磷酸化在室内空气中没有U0126的影响，但用Ly294002减少（图7(我)）.在低氧气张力中，在分化期间仅用U0126增加p-runx2（图7(我)）.因此，MEK1/2和PI3K信号的平衡是介导成骨分化的必要条件，特别是在低氧压力下，因为它们的失调会导致PMSC分化。

4。讨论

成功使用干细胞进行细胞治疗需要优化干细胞存活率和效力体外，防止细胞死亡体内接受(41.］.在本研究中，我们使用低氧张力和igf来确定它们对PMSCs向成骨谱系的承诺和分化的联合作用(图)8.). 我们发现低氧张力增加了PMSC增殖，诱导更高的OCT4和SOX2水平，阻止分化和矿化，并减少IGF介导的早期成骨分化。低氧胁迫也增加了分化的PMSCs中IGF-1R的水平。相比之下，在IR-B升高的室内空气中，胰岛素受体表达增加，与IR-A相反，IR-A因低氧张力而增强。分化后，RUNX2水平随着多能性相关蛋白的丢失而升高。只有在室内空气中，RUNX2被磷酸化，并被IGF-1和IGF-2增强，这可能解释了更强劲的成骨分化水平。


图8
igf和低氧张力的PMSC成骨分化。总结图显示了干细胞在室内空气与低氧环境下的分化模型。PMSCs仅在室内空气中可向成骨细胞分化，而维持低氧张力的PMSCs则阻碍了这一分化过程。(A)低氧胁迫下，无分化状态维持自我更新(增殖增加)，IGF-2维持OCT4和SOX2的高表达。(B)分化培养基中，PMSCs分化不畅，OCT4和SOX2升高，RUNX2降低，室内空气暴露后恢复。(C)室内空气中，OCT4和SOX2较低，RUNX2较低，出现自发分化。(D)在分化培养基中，PMSCs完全向RUNX2和OPN较高的成骨祖细胞分化，IGF-1增强了这种分化。细胞形态和茜素红染色增加时，PMSCs失去多能性，并致力于成骨谱系。

在体外，成骨分化遵循三个阶段的过程:分化阶段(第0-5天)，基质形成阶段(第5-12天)，矿化阶段(第12-19天)[37］.在这项研究中，我们调查的私营军事和保安分化（0-14天）的承诺和基质形成阶段低氧分压的组合胰岛素样生长因子的作用。在这个过程中，RUNX2强烈前成骨细胞中，未成熟的成骨细胞和早期成骨细胞[检测18.那42.］.我们证明RUNX2在室内空气中早期分化表达，并受到低氧压力的抑制。OPN作为一种晚期成骨分化标志物，在低氧压力下也受到抑制。igf仅在室内空气中增强PMSC的分化(IGF-1的作用大于IGF-2)，低氧压力消除了它们的作用。此前，IGF-1被证明可以增加RUNX2的水平[26]，并且类似地在私营军保公司，IGF-1和IGF-2增加RUNX2水平早在3天并维持升高的在第14天同样的水平，OPN升高早7天用IGF-1，其在一天进一步增加14。

IGFs通过促进生长、抑制凋亡、上调基质成熟（增加I型胶原）和矿化来增强分化功能[36］.体内，使用过表达IGF-1的MSCs通过加速骨细胞分化促进骨折愈合[43.］.MSCs在分化过程中通过IGF-1R信号传导是由PI3K/AKT调控的，而不是由MAPK信号传导(在一个正反馈环路中)，MAPK信号也抑制成骨细胞的凋亡[29那43.]. 在这项研究中，我们发现PI3K的抑制导致多能性标记物（OCT4和SOX2）和成骨标记物（RUNX2和OPN）的显著减少，支持PI3K不仅是维持多能性所必需的，而且也是调节PMSC分化所必需的。

RUNX2通过与成骨分化基因(如OCN和OPN)启动子区域的同源DNA位点结合发挥转录活性[44.］.RUNX2由MEK / ERK途径磷酸化体外[20.] 和体内[45.]触发其转录活性。在PMSC中，IGF-1和IGF-2在PMSC分化的第14天增加RUNX2的磷酸化，从而增强分化和成骨基因转录。这些数据表明，IGF-1比IGF-2更是PMSCs完成分化过程所需的有效生长因子。在骨髓间充质干细胞中，通过MEK/ERK的FGF2信号显示可诱导RUNX2磷酸化，从而激活OCN启动子[21］.此外，在HBME细胞中，IGF-1通过MEK/ERK途径在顺序激活过程中诱导RUNX2 DNA结合活性[46.］.因此，在细胞表面受体信号传导（例如，IGF-1R）和磷酸化RUNX2之间MAPK通路所连接到推进成骨分化。与此相反，一个报告显示，MEK1 / 2信号是抑制一种用于在神经纤维瘤病的I型小鼠模型骨分化[47.]，表明骨质发生分化需要抑制MEK1 / 2信号传导。有趣的是，MEK1 / 2抑制在低氧气张力下PMSCs中的润且磷酸化水平升高和磷酸化水平;但是，它无法拯救矿化。因此，MEK1 / 2信号传导可以是氧张力，其可以通过降低RUNX2和OPN水平来抑制低氧张力的骨质发生分化。

在小鼠和人胚胎干细胞中示出了Oct4和Sox2在维持pluri-/ Multi引起和抑制分化中的转录网络。在MESCS中，中胚层谱系规范由OCT4和SOX2确定：平衡表达维持多能性，而OCT4相对于SOX2的上调诱导缺陷偶联的谱系统和下调，相对于SOX2诱导神经外胚层谱系统[48.那49.］.在人类ESCs中，OCT4维持胚胎干细胞状态并抑制胚外分化，而SOX2则需要抑制向间胚层分化[50.]. 在PMSCs中，成骨分化增加了OCT4的表达，降低了SOX2的表达，正如中胚层分化谱系中所预期的那样，仅当放置在室内空气中时。低氧张力上调OCT4和SOX2，即使在分化条件下也能维持更多的多能状态，类似于先前的研究[51.］.此外，我们观察到区分私营军保公司上调OCT4之前分化，这可能是促进分化很重要。事实上，在胚胎干细胞，OCT4是必需的体内和体外分化过程和OCT4缺陷细胞无法分化[52.］.

氧张力逐渐被认为是在细胞增殖，迁移，代谢，和分化的干细胞小生境的一个重要因素。In bone fractures, oxygen level can go as low as 0.1% (~0.76 mmHg) [37那53.］.Also, oxygen tension at the fracture site of the femoral head can be low at 17.3–19.9 mmHg and even lower at 1 cm away from fracture site (12.5–12.8 mmHg) [54.］.低氧诱导因子(HIF)系统负责下调成骨细胞承诺基因的表达，如RUNX2 [37]，并且由于抑制负责矿化和基质形成的下游基因（OPN和OCN）的表达，完全分化被掩盖[37］.然而，很少有矛盾的报告表明，低氧张力可能有利于MSCs的骨质发生分化和矿化，其被称为依赖于初始隔离后干细胞膨胀期间使用的氧气张力[55.］.另一报告还认为，矿化在低氧张力发生;然而，RUNX2和碱性磷酸酶水平降低，与在室内空气相比[56.］.在本研究中，低氧张力阻碍了PMSCs的完全分化和钙化，但RUNX2水平较未分化状态升高。与室内空气相比，暴露在较高的氧张力下，碱性磷酸酶染色水平升高，证明了这种抑制被逆转(图)2）.事实上，干细胞预处理显示出改善的愈合和移植后骨折的骨的存活[34］.低氧张力抑制分化(稳定的HIF1)α.)抑制成骨分化所需的代谢开关[57.]，其依赖于线粒体功能和有氧呼吸（的上调与HIF1的下调α.）58.］.因此，在未分化的MSCs中糖酵解不足以产生ATP，因为分化的MSCs会转向氧化磷酸化，以满足分化过程、基质沉积和矿化的高能量需求[57.］.

低氧张力抑制了igf介导的pscs的成骨分化，这可能是由于配体/受体信号下调。在之前的一份报告中，我们注意到低氧压会上调IGF-1R和IR的水平[59.];因此，IGF配体可能被受体所遮挡。igf结合蛋白(igfbp)，如IGFBP-1和IGFBP-3，在低氧张力下上调，它们与igf的结合亲和力可以阻断igf与其受体之间的相互作用[60.那61.］.最近的一份报告显示，siRNA研究表明，在脂肪来源和骨髓干细胞中，上调缺氧反应IGFBP-3可降低低氧压力下的成骨分化和矿化[62.］.同样在PMSCs中，IGFBP-3通过低氧张力（数据未示出）上调，因此，它可以与IGF-1结合并通过IGF-1R活化抑制其作用，从而消除了所提出的IGF-1诱导的骨质发生分化在房间空气中。这种机制需要调查。

IGF-1R和IR信号通路对出生后骨骼的生长和周转是必不可少的。在骨质疏松患者中，原发性成骨细胞IGF-1R信号通路受损，与IGF-1刺激解耦[63.]，导致降低的增殖率和分化，因此骨质损失。在胰岛素依赖性糖尿病患者中，低胰岛素水平可导致骨质增长，脆性骨折的风险增加，骨愈合不良[64.那65.］.在小鼠中，敲除成骨细胞中的IGF-1R导致骨小梁体积减少，矿化缺陷[66.］.另一方面，缺乏IR在成骨细胞中的小鼠的小梁骨具有减少;但是，与IGF-1R敲除不同，骨骼通常是矿化的[67.］.因此，IGF-1R信号对偶联基质生物合成维持矿化至关重要。确实，IGF-1R或IR的存在影响骨中成骨细胞的数量/丰度，其中IGF-1R的缺失并不改变成骨细胞的数量，但IR的敲除会严重减少骨中成骨细胞的数量[66.那67.］.有趣的是，来自成骨细胞的IGF-1R的条件敲低大大增加了通过IR的胰岛素反应性，通过促进增殖和矿化可以部分地补偿IGF-1R [68.］.即使IR可以补偿IGF-1R损失，IGF-1R对于增加这些信号相互作用对于正常的骨生长和营业额来说是必不可少的。在两种IR同种型之间，IR-B在区分MSC和成熟的成骨细胞中大量表达，而IR-A在增殖细胞中大量表达[69.］.因此，IR的IR-B与IR-A的较高比例差异为差异化成骨细胞[69.］.在我们的PMSCs中，我们发现在分化条件下，低氧压会使IR-A升高;然而，IR-B是室内空气中的主要亚型。与IR-A不同，IR-A介导细胞增殖、动脉粥样硬化和癌症的有丝分裂作用，IR-B负责促进新陈代谢、细胞分化和延长寿命的代谢作用[70］.这表明，成骨细胞分化表达更高IR-B水平地利用更多的葡萄糖代谢为以及可能容纳在分化细胞的更高的能量需求。

综上所述，我们的研究表明PMSCs可以成功地向成骨谱系分化;因此，它们可能是成体骨髓间充质干细胞的替代来源。低氧预适应和使用igf(主要是IGF-1)刺激PMSCs是很有前途的策略，以产生成骨祖细胞的组织再生治疗骨病和修复。此外,体内在使用这些策略的动物模型研究将需要确定私营军保公司的成功移植在OI或骨折再生疗法。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

CIHR补助111024支持这项工作。

补充材料

图S1。无论分化条件如何，PMSC增殖在低氧张力中更活跃。在室内空气中含有2％FBS的非分化或骨质发生分化条件下培养PMSCs 14天（20％O.2）或低氧水平（1％O2）.(A)在第14天对稳定的HIF-1α进行免疫印迹，以确认这些培养物中的低氧压(B)在(3,7,14天)后停止治疗，使用血球计计数细胞。(双向方差分析，P<0.05, N=6)， *在室内空气与低氧压之间显著;#为在相同氧张力下无分化与分化的意义。图S2。氧预处理对多能性相关和成骨分化标记物的影响。PMSCs在两种室内空气(20% O2)或低氧(1% O2）.在预处理实验中，PMSCs在低氧压力下处理7天，然后在室内空气中处理7天。在IGF-1或IGF-2存在或不存在100 ng/mL的条件下培养PMSCs。用免疫印迹法检测这些不同处理的蛋白裂解液中OCT4、SOX2和RUNX2的水平。ß-ACTIN作为蛋白负载对照。图S3。IGFs调节PMSC多能性和向成骨谱系的分化。在含2%胎牛血清、或不含100 ng/mL IGF-1或IGF-2的室内空气(20% O2）或低氧水平（1％O2）.3、7、14天后停止治疗。免疫印迹法显示多能性相关OCT4和SOX2、承诺标志物RUNX2及其磷酸化蛋白p-RUNX2、后期标志物OPN、IGF-1R、IR p-AKT和p-ERK1/2下游信号激酶的蛋白水平。ß-ACTIN作为加载控制。图S4。胰岛素受体亚型(IR-A和IR-B) mRNA在室内空气或低氧胁迫下PMSC分化中的表达。在含2%胎牛血清和100 ng/mL IGF-1或IGF-2的室内空气(20% O2）或低氧水平（1％O2）.3、7、14天后停止治疗。采用末端PCR检测IR- a和IR- b mRNA水平，并归一化至室内空气和低氧压力下的总IR。(双向方差分析，P<0.05, N=3)。图S5。MEK1/2和PI3K抑制剂对PMSC活力的影响。PMSCs在含2%胎牛血清的无分化(ND)或成骨分化(Diff)条件下培养14天(20% O2）或低氧水平（1％O2). 在14天内，连续暴露于（5µM）U0126或（10µM）LY294002。在第14天停止治疗，通过WST1试剂测定细胞活力(双因素方差分析，P<0.05，N=4），*在室内空气和低氧张力之间有显著性差异。图S6。抑制MEK1/2和PI3K可下调ERK1/2和AKT的磷酸化。在室内空气中处理PMC超过48小时，即PMC分化过程中介质变化之间的时间段。在抑制3、6、12、24和48小时后，通过添加（5µM）U0126或（10µM）LY294002（存在2%FBS）停止治疗。免疫印迹显示的p-ERK和p-AKT水平被标准化为总激酶水平和ß-肌动蛋白水平(双向方差分析，P<0.05，N=4），a在抑制期间的时间点之间具有显著性。图S7。在低氧张力下存在MEK1/2和PI3K抑制剂的PMSC分化。在含有2%FBS的非分化或成骨分化条件下，在室内空气（20%O2）或低氧水平（1％O2）.在14天内，细胞持续暴露于培养基中(5µM) U0126或(10µM) LY294002。免疫印迹法检测多能性相关OCT4、SOX2、承诺标志物RUNX2、后期分化标志物OPN、信号激酶ERK1/2、AKT(磷酸化和总磷酸化)水平。ß-ACTIN作为加载控制。

  1. 补充材料

参考文献

  1. EY韦斯，R。A.坎德尔和W。L斯坦福，“干细胞在骨修复中的应用，”骨骼放射学，卷。37，不。7，pp。601-608,2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
  2. M.F.Pittenger，A.M.Mackay，S. C. Beck等，“成人人间充质干细胞的多百百吉潜力”，科学(纽约，纽约)，卷。284，没有。5411，PP。143-147,1999。视图:谷歌学者
  3. J. Oswald, S. Boxberger, B. Jørgensen等人，“间充质干细胞可以在体外分化为内皮细胞，”干细胞(代顿，俄亥俄州)第22卷第2期3，第377-384，2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
  4. Xu T.， M. Zhang, T. Laurent, M. Xie, and S. Ding，“简明综述:调节谱系特异性干细胞和祖细胞的化学方法，”干细胞转化医学，第2卷，第2期5，页355-361,2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
  5. M. B. Koh和G.吸，“细胞治疗：承诺兑现？”生物制品:国际生物标准化协会杂志，卷。40，不。3，第214-217，2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
  6. R霍里和M。RAbboud，“镰状细胞病儿童和成人的干细胞移植：更新，”血液学专家综述，第4卷，第4期。3, pp. 343-351, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
  7. A.Tyndall，“在各种成人和儿科风湿病中的自体干细胞移植应用”，小儿科学研究，卷。71，没有。4，第2部分，第233-438,2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
  8. M. S.开罗，W. Woessmann和J.帕格尔，“在儿童和青少年淋巴瘤的造血干细胞移植的发展，”血液和骨髓移植生物学:美国血液和骨髓移植学会杂志， vol. 19, Supplement 1, pp. S38-S43, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
  9. M. D. Files和R. J. Boucek，“干细胞进展在小儿心脏病中的‘准备就绪’应用”，儿科的现状，第24卷，第2期5，页577-583,2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
  10. E. M. Horwitz，P.L.Gordon，W.K.Koo等，“分离的同种异体骨髓衍生的间充质细胞被植入并刺激骨质发生患者的生长：对骨细胞治疗的影响：美国国家科学院学报，第99卷，第5期。13，第8932-8937页，2002。视图:出版商的网站|谷歌学者
  11. S. Perez Lopez和J. Otero Hernandez，“干细胞治疗的进展”，实验医学与生物学进展，第741卷，第290-313页，2012年。视图:出版商的网站|谷歌学者
  12. G. Q.戴利，“无极和干细胞疗法的危险，”细胞干细胞，第10卷，第5期。6, pp. 740-749, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
  13. P. S. In 't Anker, S. A. Scherjon, C. Kleijburg-van der Keur等，“从人类胎盘中分离胎儿或母亲来源的间充质干细胞，”干细胞(代顿，俄亥俄州)第22卷第2期7，页1338-1345,2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
  14. d·t·斯卡登的《干细胞生态位作为行动实体》自然，卷。441，没有。7097，第一〇七五年至1079年，2006年。视图:出版商的网站|谷歌学者
  15. D. L. Jones和A. J. Wagers，《没有地方像家:干细胞生态位的解剖和功能》，《自然评论分子细胞生物学》，第9卷，第5期。1，第11-21页，2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
  16. J. A.考夫曼，“RUNX转录因子和细胞增殖和分化之间的发展的平衡，”细胞生物学国际，卷。27，不。4，pp。315-324,2003。视图:谷歌学者
  17. P. Ducy， " Cbfa1:成骨细胞生物学中的分子开关"发展动力学:美国解剖学家协会的官方出版物，第219卷，第2期4，页461-471,2000。视图:出版商的网站|谷歌学者
  18. T. Komori，“Runx2，骨骼发展中的多功能转录因子”细胞生物化学杂志，卷。87，没有。1，pp。1-8,2002。视图:出版商的网站|谷歌学者
  19. J. B. Lian和G. S. Stein，“Runx2/Cbfa1:骨形成的多功能调节因子”，目前医药设计，第9卷，第5期。32，pp。2677-2685,2003。视图:谷歌学者
  20. G.小，D.江，P. Thomas等人，“MAPK信号通路激活和磷酸化的成骨细胞特异性转录因子，核心结合因子”生物化学杂志号，第275卷。6、2000年。视图:谷歌学者
  21. G. Xiao, D. Jiang, R. Gopalakrishnan, R. T. Franceschi，“成纤维细胞生长因子2诱导骨钙素基因需要MAPK活性和成骨细胞转录因子Cbfa1/Runx2的磷酸化，”生物化学杂志第277期39，pp。36181-36187，2002。视图:出版商的网站|谷歌学者
  22. M阿亚图拉希，M。索莱马尼，B。杰拉米扎德和M。HImanieh，“胰岛素样生长因子1（IGF-I）促进人骨髓间充质干细胞的肝分化，”细胞生物学国际，卷。35，不。11，pp。1169-1176，2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
  23. S. M. Piecewicz, A. Pandey, B. Roy, S. H. Xiang, B. R. Zetter, S. Sengupta，“胰岛素样生长因子促进胚胎干细胞中的血管发生”，普罗斯一体，第7卷，第5期2, article e32191, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
  24. L. M. Scavo, M. Karas, M. Murray，和D. Leroith，“胰岛素样生长因子- i在人间充质干细胞向脂肪细胞分化过程中刺激细胞生长和脂肪生成，”临床内分泌与代谢杂志，第89卷，第7期，第3543-3553页，2004年。视图:出版商的网站|谷歌学者
  25. L陈W。江，J。Huang等人，“胰岛素样生长因子2（IGF-2）增强BMP-9诱导的成骨分化和骨形成。”骨矿物研究杂志：美国骨矿物学学会官方杂志，第25卷，第11期，第2447-24592010页。视图:出版商的网站|谷歌学者
  26. H. Koch, J. A. Jadlowiec，和P. G. Campbell，“胰岛素样生长因子- i诱导人类间充质干细胞中早期成骨细胞基因表达”干细胞和发展，卷。14，不。6，第621-631，2005。视图:出版商的网站|谷歌学者
  27. J. Middleton, N. Arnott, S. Walsh，和J. Beresford，“成人骨赘组织中的成骨细胞和破骨细胞表达胰岛素样生长因子I和II和1型IGF受体的mrna，”骨头，第16卷，第3期，第287-293页，1995年。视图:谷歌学者
  28. C. J. Rosen，“胰岛素样生长因子I和骨矿物密度：动物模型和人类观察研究的经验，”最佳实践与研究临床内分泌与代谢，第18卷，第3期，第423-435页，2004年。视图:出版商的网站|谷歌学者
  29. T. Niu和C. J. Rosen，《胰岛素样生长因子- i基因与骨质疏松症:一项批判性评估》基因，第361卷，第38-56页，2005。视图:出版商的网站|谷歌学者
  30. “低氧诱导因子1 α和2 α在长骨发育中发挥不同和重叠的功能，”细胞生物化学杂志，第109卷，第1期，第196-204页，2010年。视图:出版商的网站|谷歌学者
  31. Wang Y.， Wan C.， Deng L. etal .，“在骨骼发育过程中，低氧诱导因子α途径将血管生成与成骨结合，”临床研究杂志，第117卷，第117号6, pp. 1616-1626, 2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
  32. T. Ezashi, P. Das和R. M. Roberts，《Low O2紧张局势和防止胚胎干细胞的分化，”美国国家科学院学报，卷。102，没有。13，第4783-4788，2005年。视图:出版商的网站|谷歌学者
  33. 问：林，Y. J. Lee，Z. Yun，“缺氧的差异化”生物化学杂志，卷。281，不。41，pp。30678-30683，2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
  34. E. Volkmer，B. C. Kallukalam，J. Maertz等人，“低氧预人类间充质干成骨分化的细胞克服了缺氧诱导的抑制，”组织工程A部分，第16卷，第5期。1，页153-164,2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
  35. M. G. Valorani，E. Montelatici，A. Germani等人，“预培养人类脂肪组织间充质干缺氧条件下的细胞增加了它们的成脂和成骨分化潜能，”细胞增殖第45卷第5期3, pp. 225-238, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
  36. T. Thomas, F. Gori, T. C. Spelsberg, S. Khosla, B. L. Riggs，和C. A. Conover，“双势人骨髓基质细胞对胰岛素样生长因子的反应:对结合蛋白生产、增殖和对成骨细胞和脂肪细胞的承诺的影响”，内分泌学，第140卷，第11期，第5036-5044页，1999年。视图:出版商的网站|谷歌学者
  37. C尼古拉耶，J。范德佩佩尔和J。Pvan Leeuwen，“人类成骨细胞中氧诱导的转录动力学在矿化开始时最为显著，”细胞生理学杂志，卷。228，没有。9，pp.1863-1872,2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
  38. R. G. Worton, E. A. McCulloch和J. E. Till，《造血干细胞与培养中形成菌落的细胞的物理分离》，细胞生理学杂志，卷。74，没有。2，pp.171-182,1969。视图:出版商的网站|谷歌学者
  39. A. Youssef, C. Iosef, and V. K. Han，“低氧压力和IGF-I通过不同的信号通路促进来自不同妊娠的胎盘间充质干细胞(PMSCs)的增殖和多能性。”内分泌学，卷。155，没有。4，pp。1386-1397,2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
  40. S. F. Andres，J.G.Simmons，A.T.Mah，M.A.Santoro，L.Van Landeghem和P. K. Lund，“胰岛素受体同种型在肠道干细胞，祖细胞，分化谱系和肿瘤中切换：IR-B限制增殖的证据，”细胞科学杂志，卷。126，第24部分，第5645-5656，2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
  41. J. Wagner, T. Kean, R. Young, J. E. Dennis, and a.i. Caplan，“优化间充质干细胞治疗”，生物技术目前的意见，卷。20，没有。5，pp。531-536，2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
  42. T.小森，“骨骼发育和RUNX2细胞外基质蛋白基因的调控，”细胞和组织研究，第339卷，第2期。1，页189 - 195,2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
  43. F. Granero-Molto, T. J. Myers, J. A. Weis等，“表达胰岛素样生长因子- i (MSCIGF)的间充质干细胞在Irs1基因敲除小鼠中促进骨折愈合和恢复新骨形成:MSCIGF自分泌和旁分泌再生效应的分析。”干细胞(代顿，俄亥俄州)，第29卷，第10期，第1537-15481011页。视图:出版商的网站|谷歌学者
  44. 【关键词】成骨细胞;转录调控;细胞、组织、器官，卷。189年，没有。1-4，pp.144-152,2009。视图:谷歌学者
  45. C. Ge, G. Xiao, D. Jiang, R. T. Franceschi，“细胞外信号调节激酶mapk通路在成骨细胞分化和骨骼发育中的关键作用”，细胞生物学杂志，卷。176，不。5，pp。709-718,2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
  46. M. Qiao, P. Shapiro, R. Kumar, and a . Passaniti，“胰岛素样生长因子-1通过磷脂酰肌醇3激酶/ erk依赖和akt不依赖的信号通路调控内皮细胞内源性RUNX2活性”生物化学杂志，第279卷，第41号，第42709-42718页，2004年。视图:出版商的网站|谷歌学者
  47. J德拉克罗伊斯恩东，D。M史蒂文斯，G。Vignaux等人，“MEK抑制和BMP2联合治疗可促进Nf1Osx-/-小鼠的成骨细胞分化和骨愈合。”骨与矿物研究杂志，第30卷，第2期1, pp. 55-63, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
  48. 6 . M. Thomson, S. J. Liu, L. N. Zou, Z. Smith, A. Meissner, S. Ramanathan，“胚胎干细胞的多能性因子调节向胚层分化”，细胞，卷。145，没有。6，pp。875-889，2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
  49. M. Behbahaninia, W. L. Ramey, M. K. Sindhwani, M. Y. Kalani，“多能因子Sox2和Oct4的差异表达调节神经元和间充质谱系”，神经外科，第69卷，第2期4、2011年第N19条。视图:出版商的网站|谷歌学者
  50. Z王，E。奥隆，B。纳尔逊，S。拉齐斯和N。Ivanova，“NANOG、OCT4和SOX2在人类胚胎干细胞中的独特谱系规范作用，”细胞干细胞，第10卷，第5期。4, pp. 440 - 454,2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
  51. S. B. Park, K. W. Seo, a . Y. So等人，“SOX2在通过Dickkopf-1和c-MYC的间充质干细胞谱系测定和增殖中具有关键作用，”细胞死亡和分化，卷。19，没有。3，pp。534-545,2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
  52. A. Radzisheuskaya, B. Chia Gle, R. L. dos Santos等，“确定的Oct4水平控制多能性进入和分化到所有胚胎谱系的细胞状态过渡”自然细胞生物学，第15卷，第5期。6，第579-590页，2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
  53. D. C.周，L.A。温宁，W. M.米勒和E. T. Papoutsakis，在骨髓造血隔室“建模PO（2）分布。II。修改Kroghian车型，”生物物理期刊第81卷第1期2，页685-696,2001。视图:出版商的网站|谷歌学者
  54. Y渡边，Y。特拉岛，N。竹中，M。小林和T。松下，“通过测量股骨颈骨折后的髓内氧张力预测股骨头缺血性坏死，”骨科创伤杂志第21卷第2期7，页456-461,2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
  55. C. Fotia, A. Massa, F. Boriani, N. Baldini, and D. Granchi，“长时间暴露在缺氧环境中可提高脂肪来源干细胞的成骨潜能”，细胞生物化学杂志，第116卷，第116期7, pp. 1442-1453, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
  56. Js李，J。CT.帕克。WKim等人，“在缺氧条件下培养的人骨髓干细胞表现出改变的特征并增强了体内组织再生。”骨头，卷。78，pp。34-45,2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
  57. L.C.Shum，N.S. White，B. N.Mills，K.L.L.Bentley和R. A.ELISEEV，在骨质发生分化期间间充质干细胞的能量代谢，“干细胞和发展，第25卷，第2期，第114-122页，2016年。视图:出版商的网站|谷歌学者
  58. sH徐振中。T陈和Y。HWei，“缺氧对人间充质干细胞代谢开关和成骨分化的抑制作用，”干细胞(代顿，俄亥俄州)，卷。2013年3月31日。视图:出版商的网站|谷歌学者
  59. A. Youssef和V.K. Han，“低氧张力通过胰岛素样生长因子-1受体和胰岛素受体调节胰岛素样生长因子-1或-2信号传导，以保持胎盘间充质干细胞中的干细胞同一性”内分泌学，卷。157，pp。1163-1174,2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
  60. I. Damerill，K.K.K. Biggar，M. Abu Shehab，S.S.Li，T.Jansson和M.B.Gupta，“缺氧增加了MTOR抑制介导的IGFBP-1磷酸化”分子内分泌，第30卷，第2期2，第201-216，2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
  61. RL张，J。W林博士。J谢等人，“长期低氧暴露增强了IGFBP-3蛋白的合成和分泌，导致H9c2心肌细胞凋亡。”生长因素，卷。33，不。4，pp。275-281,2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
  62. JH金，S。M尹，S。USong等人，“缺氧通过IGFBP3上调抑制间充质干细胞的自发矿化和成骨分化，”国际分子科学杂志，第十七卷，第二期9日,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学者
  63. S. Perrini，A. Natalicchio，L. Laviola等人，“胰岛素样生长因子-I信令异常与从患有骨质疏松症的受试者中的成骨细胞受损的细胞增殖，”内分泌学，卷。149，没有。3，pp。1302-1313,2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
  64. S. A. Kemink，A. R. Hermus，L.M。斯温克尔斯，J.A. Lutterman，和A. G. Smals，“骨质减少在胰岛素依赖型糖尿病;患病率和病理生理学方面，”内分泌学研究杂志，卷。23，不。5，pp。295-303,2000。视图:出版商的网站|谷歌学者
  65. M.Janghorbani，D.Feskanich，W.C.Cierett和F. Hu，对糖尿病患者的前瞻性研究和髋部骨折风险：护士健康研究，“糖尿病护理，第29卷，第2期7, pp. 1573-1578, 2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
  66. M. Zhang, S. Xuan, M. L. Bouxsein等，“胰岛素样生长因子(IGF)受体基因的成骨细胞特异性敲除揭示了IGF信号在骨基质矿化中的重要作用，”生物化学杂志第277期46，页44005-44012,2002。视图:出版商的网站|谷歌学者
  67. K.Fulzele，R.C.谜语，D.J.Inirolamo等，“成骨细胞中的胰岛素受体信号传导调节产后骨采集和身体成分”细胞，卷。142，没有。2，pp。309-319,2010。视图:谷歌学者
  68. K. Fulzele, D. J. DiGirolamo, Z. Liu, J. Xu, J. L. Messina, and T. L. Clemens，“破坏成骨细胞中胰岛素样生长因子1受体增强胰岛素信号和作用，”生物化学杂志，第282卷，第35号，第25649-25658页，2007年。视图:出版商的网站|谷歌学者
  69. S. Avnet, F. Perut, M. Salerno, L. Sciacca，和N. Baldini，“胰岛素受体亚型在人类成骨细胞发生中表达不同。”分化;生物多样性研究，第83卷，第83期5，页242-248,2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
  70. “胰岛素受体亚型和胰岛素受体/胰岛素样生长因子受体杂种在生理和疾病中的作用”，A. Belfiore, F. Frasca, G. Pandini, L. Sciacca, R. Vigneri，内分泌检查，第30卷，第2期6，pp。586-623，2009。视图:出版商的网站|谷歌学者

版权所有©2017 Amer Youssef和Victor K. M. Han。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。

更多相关文章

PDF 下载引用 引文
下载其他格式更多的
埃普
XML
订购印刷品命令
意见1237.
下载698.
引用

相关文章

年度文章奖:由主编评选的2020年杰出研究贡献。阅读获奖物品．