1。介绍
间充质干细胞(msc),发现在许多成人组织,负责组织修复和再生后受伤或疾病(
1]。与胚胎干细胞(ESCs), msc是肿瘤发生的较少,有更严格的mesendodermal lineage-specific分化细胞,成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、基质成纤维细胞和内皮细胞
1- - - - - -
4]。此外,msc可以调节免疫反应和移植物抗宿主疾病的患者已经被成功运用
5]。因此,msc是有前途的候选人为干细胞疗法治疗许多成人和儿科疾病,如镰状细胞病(
6[],风湿性疾病
7),淋巴瘤(
8),和心脏衰竭
9]。在骨,MSC移植已被用于正确的骨骼畸形和伤害。儿童,成骨不全症(OI)是一种严重的遗传性疾病的间充质细胞赤字I型胶原蛋白是重要的基质沉积和矿化
10]。没有治疗OI;然而,异基因骨髓移植已被证明成功加速线性增长和增加全身骨密度OI儿童(
10]。
尽管骨髓msc被用于干细胞疗法(
11,
12),胎盘msc (PMSCs)丰富和现成的,不需要侵入性的技术隔离(
13]。PMSCs隔绝不同车厢的胎盘(羊膜、绒毛膜和胎儿膜)和增殖能力高于骨髓msc (
13]。msc依赖周围的微环境维持干细胞的身份(
14,
15),他们通过严格区分由特定的促进因素multipotency转录网络信号丢失,启动linage-specific祖分化。在成骨细胞分化,runt-related转录因子2 (RUNX2)是移植的起始转录因子基因的转录所需骨基质沉积和矿化包括骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)、I型胶原蛋白,碱性磷酸酶(
16- - - - - -
19]。RUNX2增殖作用被磷酸化的蛋白激酶(MAPK) c端proline-serine-threonine (PST)地区,需要其转录活性和DNA结合成骨基因的启动子区域,如OPN和OCN [
20.,
21]。
干细胞分化条件是由可溶性因子,小分子,激素,生长因子(
15]。胰岛素样生长因子(igf, igf - 1和IGF-2)可以促进和刺激干细胞分化对几个血统从所有三个胚芽层(
22- - - - - -
26),包括成骨细胞分化[
27),
在活的有机体内骨骼发育(
28,
29日]。igf - 1和IGF-2及其受体IGF-1R有强烈的关联与骨生成和成熟的成骨细胞和破骨细胞中大量表达特别自分泌/内分泌机制(
27]。igf - 1和IGF-1R-null老鼠显示欠发达短骨,骨矿物质密度低,和延迟钙化,而IGF-2-null老鼠没有主要骨架缺陷(
28]。因此,igf - 1在成骨分化和IGF-2可能具有不同的功能。
在活的有机体内,低氧fator-1
α——(HIF1
α-)基因敲除小鼠骨小梁体积减少,骨形成率,减少和降低成骨细胞在长骨发育[扩散
30.]。相比之下,HIF1的过度
α在成骨细胞导致血管密度极高,严重的长骨头的发展(
31日]。因此,稳定HIF1低氧张力
α,需要健康的骨骼发育所需基因调控。
在体外、低氧张力促进干细胞增殖、自我更新,multipotency [
32),但抑制成骨细胞分化[
33]。然而,他们再次暴露在室内空气恢复完整的分化和会增强成骨分化(
34,
35]
。因此,长期接触低氧张力抑制干细胞分化,而短期暴露可以发挥作用,指导干细胞命运朝着一个更健壮的成骨分化(
34]。
igf和低氧张力是自然的利基成骨的微环境的组成部分,影响后期所示MSC分化成骨分化成矿时期的(
36,
37]。然而,这两个微环境因素的综合效应的承诺和早期分化阶段还不清楚。在这项研究中,我们使用早产PMSCs研究igf - 1的作用和IGF-2信号结合低氧张力在成骨分化。我们表明,低氧张力抑制PMSC成骨分化,和igf - 1超过IGF-2增强差异化通过特定信号通路介导通过IGF-1R / IR, PI3K MEK1/2, RUNX2磷酸化。
2。材料和方法
2.1。PMSC隔离
PMSCs被隔绝人类胎盘早期妊娠(10 - 13周)。知情同意后,胎盘收集从病人治疗妊娠终止。后立即手术,胎盘是在无菌条件下解剖和收集绒毛膜绒毛的小块。组织样本被切碎的机械,被酶消化的过程由两个步骤(1)胶原酶IV /透明质酸酶和(2)DNase我(3)胰蛋白酶/ EDTA紧随其后。每个酶步骤进行20分钟的37°C,紧随其后的是10分钟洗在PBS溶液4°C补充10%胎牛血清(的边后卫)(Gibco,米西索加)。细胞在消化过程中释放是通过组织网(45
μ米)来获取单个细胞悬液。接下来,细胞分离Percoll(σ)不连续梯度根据Worton修改协议等人的造血干细胞隔离(
38),然后播种在DMEM / F12媒体(Gibco,米西索加)补充10%的边后卫和antibiotic-antimycotic解决方案。4天之后,改变了媒体和媒体留下不依从细胞被洗附着PMSCs形成菌落。PMSC殖民地以流式细胞术存在/缺乏细胞表面标记CD90 CD73 CD105和CD117 / c - kit,发布之前(
39]。
2.2。成骨分化和低氧张力的孵化
细胞培养和维护使用DMEM / F12媒体补充10% ES-FBS FGF-2 (100 ng / mL) (Gibco,米西索加)。在治疗之前,细胞培养在DMEM / F12补充的边后卫仅为10%。治疗后,PMSCs confluency镀在70% nondifferentiation条件(15%的边后卫/ DMEMF12)或在成骨的刺激条件(15%的成骨分化的边后卫,10−850 M地塞米松,
μg / mL抗坏血酸和3.5毫米
β甘油磷酸盐)(干细胞技术、温哥华BC)。IGF - 1或IGF-2治疗,100 ng / mL的IGF添加到降低成骨分化培养基的边后卫基本水平2%;在每个媒体改变igf添加新鲜。不同的相对影响IGF对钙沉积和氧张力治疗相比用茜素红和碱性磷酸酶染色。MEK / ERK通路的信号或被持续抑制PI3K / AKT途径U0126 (5
μ米)或LY294002 (10
μ米)。细胞培养被放置在一个5%的股份有限公司2孵化器或缺氧室,充满了1%的混合O2,5%的公司2,平衡N2多伦多(中行加拿大有限公司)5590年15分钟,以确保使用Hudson饱和氧气监视器(哈德逊,Ventronics部门,泰梅库拉,CA)。此后,美国商会是放置在一个组织文化孵化器在37°C。
2.3。茜素红染色和量化
评估这些形态分化的变化与nondifferentiated细胞,细胞培养14天为30分钟,然后用4%甲醛固定RT,然后,细胞染色茜素红溶液与1% 10分钟在RT或电视台/ BCIP试剂(向量实验室,伯灵顿)按照制造商的协议。染色都是然后用10%氯化十六烷吡啶在10毫米钠可溶性磷酸盐缓冲剂(pH值7.0)如前所述
27]。200年的吸光度
μL随着染色是阅读
λ使用板读者= 570海里。然后吸光度是规范化在微克每口井的总蛋白质含量。
2.4。在PMSCs rt - pcr对胰岛素受体亚型
总RNA提取从分化和nondifferentiated PMSCs使用PureLink RNA迷你包(Ambion,伯灵顿)按照制造商的协议。1 - 3
μ使用上标3 g总RNA reverse-transcribed第一链合成系统rt - pcr(表达载体,伯灵顿)和低聚糖(dT)20.引物。端点PCR反应是运行在25
μ使用埃普多夫96孔板thermocycler L。人类
红外亚型在同一个cDNA样本检测用引物扩增外显子11包括
IR-B(250个基点)或排除
IR-A(214个基点)和放大发表之前
40]。人类
RPL13a水平作为参考内生控制目标mrna的正常化。放大在92°C条件下运行5分钟紧随其后30 92°C的周期为30秒,60°C,持续30秒,30秒72°C。
2.5。免疫印迹
检测蛋白水平变化,10 - 20
μg的每一个细胞溶解产物样品解决了sds - page,然后转移到PVDF膜(微孔,贝德福德,MA)
。5%牛血清白蛋白的膜被封锁或5%的脱脂奶粉1 x TBS (Tris-buffered盐水)在室温下1小时。屁股然后洗1 x TBS 0.1%渐变20 (TBS-T)(3×5分钟)其次是孵化在4°C一夜之间主要抗体按照制造商的协议。的屁股然后洗使用TBS-T(3×10分钟),相应的二级HRP-labelled抗体孵育1小时在rt, ECL Immunocomplexes进行检测和记录使用VersaDOC™成像系统(Bio-Rad)。
2.6。抗体
在这项研究中,下面的抗体被用来检测IGF系统:phospho-p44/42 MAPK (# 4377), p44/42 MAPK (# 9102), phospho-AKT (Ser473 # 4051),和一种蛋白激酶(# 9272)(细胞信号技术,伯灵顿)和IGF-1R
α(在20、sc - 712)和IR -
α(在20、sc - 710)(圣克鲁斯生物技术。圣克鲁斯,CA)。对于multipotency标记,我们使用OCT3/4抗体(N-19, sc - 8628)(圣克鲁斯生物技术。圣克鲁斯,CA)和SOX-2 (2683 - 1) (Epitomics,伯灵顿)。成骨分化标记,我们使用RUNX2(# 8486)(细胞信号技术,伯灵顿),phospho-RUNX2 (pa5 - 12988)(热费希尔科学,伯灵顿),和OPN (K-20, sc - 1059)(圣克鲁斯生物技术。圣克鲁斯,CA)。加载控制,我们使用pan-Actin Ab-5女士(# - 1295)(热费希尔科学,Fremont, CA)。二次抗体用于免疫印迹是山羊anti-rabbit (# 170 - 6515), anti-mouse (# 170 - 6516) HRP-conjugated抗体(Bio-Rad实验室、大力神、CA),或驴抗体抗体(sc - 2020)(圣克鲁斯生物技术。圣克鲁斯,CA)。
2.7。统计分析
所有的实验都是在从三个独立的实验各一式三份;只要有可能,三个或更多PMSC主要从早产胎盘线使用。所有使用GraphPad棱镜生成图表和分析软件5.0 (GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。双向方差分析与Bonferroni事后测试是用于PMSC WST1扩散试验和微量化。数据表示为平均值±标准平均误差(SEM);值被认为是重要的时候
P
<
0.05
。
3所示。结果
3.1。低氧张力对PMSC成骨分化的影响
在分化的条件下,PMSCs大形态变化超过14天的室内空气茜素红染色(数字
1(一)和
1 (b))。与室内空气相比,低氧张力稳定HIF1
α在第14天和增强细胞增殖(图
1
可以在网上
https://doi.org/10.1155/2017/4576327),但抑制成骨分化在同一时间(数字
1(一)和
1 (b))。基于量化的染色,PMSCs显示自发分化成osteogenic-like细胞在第三天室内空气由低氧张力抑制(图
1 (b))。因此,低氧张力使自发和成骨的medium-derived PMSCs分化。
PMSC分化在低氧张力对成骨分化与multipotency及其影响。PMSCs nondifferentiation培养14天或成骨分化条件下室内空气中含有15%的边后卫(20%啊2)或低氧含量(1% O2)。治疗停止后1、3、7、10、14天茜素红染色证实(a) (b) PMSC分化形态和量化(双向方差分析,
P
<
0.05
,
N
=
4
)。
∗
表明室内空气和低氧张力之间的意义在每个时间点;小写字母(a、b和c)表示时间点之间的意义在房间空调,大写字母(a, b)表明在低氧张力。(c)免疫印迹显示pluripotency-associated蛋白质含量和分化标记细胞溶解产物分离3、7、14天。量化的第14天样本显示蛋白质含量(d) OCT4、(e) SOX2 RUNX2 (f), (g)在nondifferentiation OPN和分化情况。量化水平显示被规范化
β肌动蛋白,蛋白质加载控制(双向方差分析,
P
<
0.05
,
N
=
3
)。
∗
室内空气和低氧张力之间的指示意义;#表示意义nondifferentiation和分化在相同的氧张力之间的关系。
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监控PMSC multipotency分化,OCT4 pluripotency-associated蛋白的水平和转录因子RUNX2 SOX2和早期成骨的承诺和后来的测量标记OPN在第三天,7和14(图
1 (c))。尽管PMSCs分化条件下,OCT4 SOX2水平都高于低氧张力与室内空气(图
1 (c))。在分化在第14天,OCT4水平略增加房间的空气,减少低氧张力(图
1 (d)),而SOX2水平略有减少室内空气和低氧张力相比nondifferentiation条件(图
1 (e))。RUNX2水平在分化增加室内空气由低氧张力降低(图
1 (f))。当RUNX2强劲增加室内空气的第三天,成骨分化发生逐渐OPN表达的经验显示,一个分化的标志和矩阵的形成(图
1 (g))。同样,低氧张力抑制OPN水平的增加。因此,低氧张力降低成骨分化维持较高multipotency(高OCT4和SOX2)和降低早期承诺(低RUNX2)和后向成骨的谱系分化(低OPN)。
3.2。可逆性抑制作用的低氧张力在成骨分化
我们评估是否低氧张力不可逆块PMSC分化之后,他们再次暴露在室内空气暴露于低氧张力。通过引入PMSCs进入室内空气过去7天的区别,茜素红染色增加到类似的水平在室内空气(数字
2(一个)和
2 (b)(左)。这种效应被碱性磷酸酶染色也证实,这甚至比室内空气(数字提高到更高水平
2(一个)和
2 (b),对吧)。此外,他们再次暴露在室内空气减少OCT4和SOX2水平相比,低氧张力(数字
2 (c)和
2 (d)和S
2
)。RUNX2水平也强劲增长后他们再次暴露在室内空气(数字
2 (e)和S
2
)。这些数据表明,低氧张力可以减少,但并不阻止PMSCs成骨分化。
低氧张力预处理对PMSC成骨分化的影响和multipotency。PMSCs培养在nondifferentiation或成骨分化条件包含15%的边后卫在室内空气(20% O2)或低氧含量(1% O2)如图14天
1。治疗低/房间,PMSCs在低氧培养7天,紧随其后的是7天房间的空气(第三个面板所示)。茜素红或碱性磷酸酶染色法是用来检测钙沉积和酶表达的变化如图所示的形态(a)和(b)量化(双向方差分析,
P
<
0.05
,
N
=
4
);小写字母(a、b和c)表明意义之间的氧张力影响nondifferentiation条件之内,大写字母(a, b, c)表明在分化的条件。从免疫印迹如图
2
,蛋白质含量在(c) OCT4量化,(d) SOX2, (e) RUNX2的水平。量化水平显示被规范化
β肌动蛋白,蛋白质加载控制(双向方差分析,
P
<
0.05
,
N
=
3
)。
∗
室内空气和低氧张力之间的指示意义;小写字母(a、b和c)表明意义之间的氧张力影响nondifferentiation条件之内,大写字母(a、b和c)表明在分化的条件。
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3.3。胰岛素样生长因子对PMSC成骨分化的影响在低氧张力
igf的作用在调节分化过程研究通过添加一个新的剂量的igf - 1或IGF-2 (100 ng / mL)与每个介质变化对室内空气或低氧张力条件下14天(数字
3(一个)和
3 (b))。nondifferentiation条件,增加茜素红染色表明自发分化的增加室内空气(增强与igf - 1和7天14 IGF-2)(图
3 (c))和在低氧张力(只在第三天与igf没有进一步增加)(图
3 (e))。在分化的条件下,igf (igf - 1超过IGF-2)增强成骨分化形态,在室内空气和低氧张力,增加的数量的钙化中心和高阶的细胞组织强烈茜素红染色(图所示
3 (b)和
3 (g))。有趣的是,igf - 1和IGF-2室内空气增强染色强度从第三天开始,第七天达到最大,而控制(IGF-free条件)要求达到同一水平(图14天
3 (d))。低氧张力减少PMSC分化和抑制igf - 1或IGF-2(图的影响
3 (f))。
PMSC分化在低氧张力由igf监管。PMSCs培养在nondifferentiation或分化条件含有2%的边后卫的存在与否100 ng / mL的igf - 1或IGF-2,房间的空气(20%啊2)或低氧含量(1% O2)。治疗停止后3、7和14天(a - b)茜素红染色法和量化(c - d)(双向方差分析,
P
<
0.05
,
N
=
4
)。没有igf X表示意义之间不同的日子;#表示IGF加法的意义而没有IGF的同一天。(g)钙化中心组织和细胞分化PMSCs与茜素红染色从14天显示在更高的放大倍数。
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igf的影响在PMSC multipotency和分化标记也决定用免疫印迹(图
3
)。在室内空气,igf (IGF-2超过igf - 1)保持高OCT4水平在天3和7,这14天(图消失了
4(一)(左)。在低氧张力,igf保持较高水平的OCT4分化(图
4(一),对吧)。SOX2在第三天只增加了igf - 1在室内空气(图
4 (b)(左)。在低氧张力,igf - 1和IGF-2维持低水平的SOX2在分化(图
4 (b),对吧)。相比之下,RUNX2增加了igf - 1和IGF-2分化的早期阶段(3天),并保持在较高水平只有在第14天igf - 1(图
4 (c)(左)。低氧张力废除这对RUNX2 igf - 1作用(图
4 (c),对吧)。然而,似乎影响igf - 1增加RUNX2水平由低氧张力,推迟后的预处理研究暴露于室内空气(图
2
)。OPN增加了第14天房间的空气没有igf(图
4 (d)(左),而igf - 1增加OPN水平第七天,进一步增加了只有在室内空气(图14天
4 (d)(左)。另一方面,IGF-2相反igf - 1和OPN水平降低造成的。低氧张力抑制OPN水平增加,也阻止了IGF-1-mediated增加室内空气(图所示
4 (d),对吧)。这些数据支持,igf - 1在成骨分化具有重要作用,和更高的氧张力需要促进成骨分化。
PMSC multipotency和差异化监管下由igf低氧张力。PMSCs培养14天在成骨分化条件下含2%的边后卫的存在与否100 ng / mL的igf - 1或IGF-2室内空气(20%啊2)或低氧含量(1% O2)。治疗停止后3、7和14天。免疫印迹,如图
3
,被用来量化蛋白质含量的变化(一)OCT4、(b) SOX2, (c) RUNX2和(d) OPN igf引起的。量化水平正常化
β肌动蛋白,蛋白质加载控制(双向方差分析,
P
<
0.05
,
N
=
3
)。没有igf X表示意义之间不同的日子;#表示IGF加法的意义而没有IGF的同一天。
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3.4。胰岛素样生长因子受体的作用在PMSC成骨分化低氧张力
igf - 1和IGF-2信号可以通过胰岛素样生长因子- 1受体(IGF-1R)或胰岛素受体(IR)促进增殖和分化。房间的空气,IGF-1R并未改变分化和不受igf,而红外是区分PMSCs和调节增加了igf - 1(数字
6(一),
6 (b),
6 (c))。在低氧张力,IGF-1R分化条件下增加但降低igf - 1和IGF-2(图
5 (b),对吧),而没有改变在红外分化条件(图
5 (c))。红外光谱中存在两个亚型,IR-A IR-B,可以确定干细胞的分化状态。更高比例的IR-B: IR-A可能表明一个更向成骨的谱系分化状态。在PMSCs IR-B: IR-A比率很低在nondifferentiated PMSCs(图
6 (d))。在分化,IR-B: IR-A逐渐增加房间的空气而不是在低氧张力(图
6 (e))。这是造成的表达升高IR-A比IR-B在低氧张力(图
4
,对吧)。igf - 1或IGF-2增加了IR-B: IR-A比早些时候在第三天在室内空气的天7和14,减少与低氧张力一致的比率越低(数字
6 (f)和
6 (g))。
氧张力和igf - 1的影响或IGF-2信号下游激酶在成骨分化的细胞表面受体。相似的数据
4和
6,PMSCs培养14天在成骨分化条件下含2%的边后卫的存在与否100 ng / mL的igf - 1或IGF-2室内空气(20%啊2)或低氧含量(1% O2)。治疗停止后3、7和14天。免疫印迹,在图
3
,被用来量化蛋白质含量(a) p-ERK1/2, p-AKT (b)和(c) p-RUNX2三天。这些激酶/磷蛋白质激酶/磷蛋白质水平和规范化
β肌动蛋白(双向方差分析,
P
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0.05
,
N
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3
)。没有igf X表示意义之间不同的日子;#表示IGF加法的意义而没有IGF同一天;
∗
表明室内空气和低氧张力之间的意义。
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IGF-1R和IR水平及其亚型(IR-A和IR-B)在区分PMSCS受氧张力和igf。PMSCs nondifferentiation培养14天或成骨分化存在与否的条件下含2%的边后卫100 ng / mL的igf - 1或IGF-2室内空气(20%啊2)或低氧含量(1% O2)。治疗停止后3、7和14天。使用免疫印迹检测水平的(a) IGF-1R和缺乏igf IR。量化的免疫印迹,如图
3
显示,igf - 1或(b) IGF-1R IGF-2影响和(c)红外三天。水平被归一化
β肌动蛋白,蛋白质加载控制(双向方差分析,
P
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0.05
,
N
=
3
)。没有igf X表示意义之间不同的日子;#表示IGF加法的意义而没有IGF的同一天。通过端点PCR, mRNA水平IR-A与IR-B测量比例计算和归一化总红外(d) 0 PMSCs无差别的天,没有igf (e)分化,与igf - 1 (f)分化,(g)与IGF-2分化(双向方差分析,
P
<
0.05
,
N
=
3
)。
∗
室内空气和低氧张力之间的指示意义;小写字母(a, b)表示意义之间的时间点在房间空调,大写字母(a)表明在低氧张力。
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3.5。下游胰岛素样生长因子信号调节成骨分化
下游激酶IGF受体信号p-ERK1/2和p-AKT主要信号激酶调解IGF作用。PMSCs, p-ERK1/2逐渐减少室内空气的分化进程,同时保持较高的低氧张力在天3和7(图
5(一个))。ERK1/2水平明显降低检测14天不管氧张力。的igf - 1或IGF-2导致室内空气进一步减少p-ERK1/2水平和低氧张力(图
5(一个))。p-AKT没有明显改变房间的空气,甚至在igf的存在(图
5 (b)(左)。另一方面,igf - 1的水平增加在低氧张力p-AKT分化(图
5 (b),对吧)。在成骨分化,RUNX2通过MAPK磷酸化(MEK1/2),从而影响其DNA结合蛋白质-蛋白质之间的关系。只有在室内空气,p-RUNX2水平升高在第14天igf的缺席,而igf - 1的增加或IGF-2增加p-RUNX2水平~ 8 ~ 4折,分别(图
5 (c)(左)。在低氧张力,RUNX2磷酸化调节整个分化(图
5 (c),对吧)。
指定信号激酶的作用在调节PMSC分化,U0126 LY294002被用来抑制MEK1/2 PI3K,上游激酶ERK1/2和AKT,分别。14天之后,茜素红染色法是通过LY294002比减少了U0126(数字
7(一)和
7 (b))在不影响PMSC可行性(图
5
)。U0126没有改变的水平OCT4 SOX2在区分PMSCs(数字
7 (c)和
7 (d));然而,RUNX2和OPN在低氧张力增加(数据
7 (e)和
7 (f))。这表明成骨分化的抑制低氧张力可能由MEK1/2信号。LY294002减少OCT4、SOX2 RUNX2, OPN在分化条件,但在低氧张力(数据
7 (c),
7 (d),
7 (e),
7 (f))。因此,PI3K信号在PMSCs-to维护multipotency具有双重作用,促进成骨分化。
PMSC分化是通过MEK1/2和PI3K信号及其介导的抑制影响ERK1/2, AKT, RUNX2磷酸化在低氧张力。PMSCs培养14天在成骨分化条件下室内空气中含有2%的边后卫(20%啊2)或低氧含量(1% O2)。在14天,细胞不断暴露于(5
μ米)U0126或(10
μ米)在媒体分化LY294002。治疗方法是停在14天与茜素红染色证实(a)抑制剂和量化PMSC分化形态变化(b)(双向方差分析,
P
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0.05
,
N
=
4
)。免疫印迹,如图
7
,被用来量化蛋白质含量(c) OCT4、SOX2 (d), (e) RUNX2 OPN (f) (g) p-ERK1/2 p-AKT (h),(我)p-RUNX2诱导信号抑制。量化水平正常化
β肌动蛋白,蛋白质加载控制;另外,每个磷蛋白质是归一化总蛋白(双向方差分析,
P
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0.05
,
N
=
3
)。
∗
室内空气和低氧张力之间的指示意义;#表示意义之间DMSO控制和抑制剂。
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抑制剂的影响被磷酸化ERK1/2和AKT的评估。每48小时U0126和LY294002减少ERK1/2的磷酸化和AKT(图
6
),分别。14天的分化,U0126 p-ERK1/2水平降低室内空气,而不是在低氧张力(图
7 (g))。LY294002抑制一种蛋白激酶磷酸化房间的空气和更低的低氧张力条件下(图
7 (h)),但LY294002增加p-ERK1/2水平低氧张力(图
7 (g))。与U0126 RUNX2磷酸化是影响室内空气但与LY294002下降(图
7(我))。在低氧张力,p-RUNX2增加只有U0126在分化(图
7(我))。因此,MEK1/2的平衡和PI3K信号需要调解成骨分化,特别是在低氧张力,misregulation会导致PMSC分化。
4所示。讨论
成功使用干细胞进行细胞治疗需要一个优化干细胞生存和效力
在体外,防止细胞死亡
在活的有机体内接受(
41]。在这项研究中,我们使用了低氧张力和igf来决定他们的承诺和分化的综合效应PMSCs向成骨的血统(图
8)。我们发现低氧张力增加PMSC增殖,诱导OCT4和SOX2水平更高,阻止了分化和矿化,并减少了IGF-mediated成骨分化的早期发病。低氧张力也在分化PMSCs IGF-1R水平的增加。相比之下,胰岛素受体表达增加与高架IR-B室内空气,对面IR-A由低氧增强紧张感。在分化,RUNX2 pluripotency-associated蛋白质含量增加而损失。只有在室内空气,RUNX2磷酸化和增强igf - 1和IGF-2这可以解释更健壮的成骨分化水平。
PMSC成骨分化的igf和低氧张力。总结图显示干细胞分化模型室内空气与低氧。PMSCs只能分化成成骨的血统在室内空气,同时保持在低氧PMSCs紧张会阻碍这一分化的过程。(A)在低氧张力,nondifferentiation条件维持自我更新(更高的增殖)和IGF-2 OCT4和SOX2可以保持更高的表达式。(B)在媒体分化,PMSCs显示一个阻碍分化高OCT4 SOX2和降低RUNX2,复苏后室内空气接触的。(C)在室内空气,自发分化发生RUNX2 OCT4 SOX2和较低的低。(D)在媒体分化,PMSCs完全区分对成骨细胞的祖细胞具有较高RUNX2 OPN,这增强了igf - 1。细胞形态和茜素红染色增加PMSCs失去multipotency成骨的血统和提交。
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在体外成骨分化遵循一个三相过程:分化期(0 - 5),一个矩阵形成阶段(5 - 12天),和一个矿化阶段(12 - 19天)
37]。在这项研究中,我们调查的角色igf结合低氧张力的承诺和矩阵PMSC分化形成阶段(0 - 14天)。在这个过程中,RUNX2强烈preosteoblasts中发现,未成熟的成骨细胞,早期成骨细胞(
18,
42]。我们证明RUNX2表示在早期分化在室内空气和抑制低氧张力。OPN,成骨分化标记,也压抑了低氧张力。igf增强PMSC分化只在室内空气(比IGF-2 igf - 1的影响更大),低氧张力废除它们的效果。此前,igf - 1是显示增加RUNX2的水平(
26在PMSCs],同样,igf - 1和IGF-2 RUNX2增加水平早在第三天,在第14天保持高位。此外,OPN与igf - 1升高早在第七天,这进一步增加了14天。
igf加强分化功能通过促进经济增长,抑制细胞凋亡,移植矩阵成熟(I型胶原蛋白增加)和矿化
36]。
在活的有机体内,使用msc, igf - 1的过表达,从而提高骨折愈合加速骨细胞分化[
43]。信号通过IGF-1R在msc分化是由PI3K / AKT而不是通过MAPK信号(以积极的反馈回路),还能抑制细胞凋亡在成骨细胞(
29日,
43]。在这项研究中,我们表明,抑制PI3K引起显著减少multipotency标记(OCT4和SOX2)和成骨的标记(RUNX2和OPN)支持,PI3K不仅维持multipotency还需要调节PMSC分化。
RUNX2施加其通过绑定到其同源基因转录活动网站在成骨分化基因的启动子区域(如OCN和OPN) (
44]。RUNX2磷酸化的MEK / ERK通路
在体外(
20.),
在活的有机体内(
45),触发其转录活性。PMSCs、igf - 1和IGF-2增加在第14天RUNX2的磷酸化PMSC分化,从而加强分化和成骨基因转录。超过IGF-2,这些数据表明,igf - 1是一个强有力的生长因子PMSCs要求完成分化过程。在骨髓msc、FGF2通过MEK / ERK信号显示诱导RUNX2磷酸化,激活一个OCN启动子(
21]。在HBME细胞,igf - 1诱导RUNX2 DNA结合活性的顺序激活过程中MEK / ERK途径(
46]。因此,细胞表面受体之间的MAPK通路连接信号(例如,IGF-1R)和RUNX2磷酸化促进成骨分化。相反,一个报告显示,MEK1/2 osteoprogenitor分化的信号是抑制神经纤维瘤病1型小鼠模型(
47),这表明抑制MEK1/2信号需要成骨分化。有趣的是,MEK1/2抑制RUNX2总数和磷酸化水平的提升和OPN PMSCs低氧张力;然而,它不能拯救矿化。因此,MEK1/2信号可以依赖于氧张力可能抑制成骨分化的低氧张力降低RUNX2和OPN水平。
OCT4的转录网络和SOX2在维护pluri——/ multipotency和抑制分化已被证明在老鼠和人类胚胎干细胞。在制中,中胚层血统规范是由OCT4 SOX2:平衡维持多能性表达,而相对于SOX2 OCT4 upregulation诱发mesendodermal血统的OCT4差别规格和对这些相对于SOX2诱发神经外胚层的血统规范(
48,
49]。在人类的ESCs OCT4保持胚胎干细胞状态和压制胚胎外的分化,而SOX2需要抑制分化向mesendodermal [
50]。PMSCs,成骨分化的表达增加OCT4 SOX2的表达减少,如预期中胚层分化谱系,只有当放置在室内空气。低氧张力调节OCT4和SOX2分化条件下保持更多功能状态,类似于之前的研究(
51]。同时,我们观察到,区分PMSCs调节OCT4分化之前,这对促进分化可能是重要的。事实上,在ESCs OCT4所需
在活的有机体内和
在体外细胞分化过程和OCT4-deficient无法区分(
52]。
氧张力越来越被认为是一个重要因素的干细胞利基增殖,迁移,新陈代谢,和分化。在骨折,氧气水平可以低至0.1%(~ 0.76毫米汞柱)
37,
53]。此外,氧张力在股骨头骨折部位可以在17.3 - -19.9毫米汞柱低和更低1厘米(12.5 - -12.8毫米汞柱)[远离骨折的部位
54]。低氧诱导因子(HIF)系统负责表达下调基因表达成骨细胞的承诺,比如RUNX2 [
37),一个完整的分化模糊是由于抑制下游基因的表达负责矿化和矩阵的形成(OPN和OCN) (
37]。然而,很少有矛盾的报告表明,低氧张力可能有利于成骨分化和矿化的msc被称为依赖于所使用的氧张力在干细胞扩张后初始隔离(
55]。另一份报告还指出,矿化发生在低氧张力;然而,RUNX2和碱性磷酸酶水平相对较低,相比之下,那些在室内空气
56]。在这项研究中,低氧张力阻碍PMSCs的完整的分化和钙化,但在nondifferentiation RUNX2水平升高与条件。这种抑制在暴露于高氧张力所证明的碱性磷酸酶染色水平升高与室内空气(图
2)。事实上,干细胞预处理是显示提高骨折愈合和生存的骨移植后(
34]。分化的抑制低氧张力(稳定HIF1
α)抑制代谢成骨分化所需的开关(
57],它依赖于线粒体的upregulation HIF1的差别和有氧呼吸(对这些基因的功能
α)[
58]。因此,糖酵解在未分化的msc ATP生产是不够的,作为区分msc切换到氧化磷酸化来满足能源需求高分化过程、基质沉积和矿化
57]。
低氧张力抑制增强IGF-mediated PMSCs成骨分化,可由于配体/受体。差别信号对这些在以前的报告中,我们发现低氧张力上调IGF-1R和红外的水平
59];因此,它是可能的,IGF受体配体是模糊。IGF-binding蛋白(IGFBPs),如IGFBP-1 IGFBP-3,由低氧张力调节,和他们的亲和力igf可以阻止igf及其受体之间的相互作用(
60,
61年]。最近的一份报告证明了核研究的upregulation hypoxia-responsive IGFBP-3在减少脂肪和骨髓干细胞成骨分化和矿化低氧张力(
62年]。PMSCs, IGFBP-3由低氧张力调节(数据未显示),因此,它可能与igf - 1通过IGF-1R激活和抑制其行动,废除IGF-1-induced成骨分化了房间的空气。这种机制需要调查。
IGF-1R和红外信号通路对产后骨骼生长和营业额是不可或缺的。骨质疏松症患者,主要造骨细胞受损IGF-1R信号与igf - 1刺激(
63年),导致较低的扩散率和分化,因此骨质流失。在胰岛素依赖型糖尿病患者中,胰岛素水平低会导致骨量减少,脆弱性骨折的风险增加了,可怜的骨愈合(
64年,
65年]。成骨细胞的基因敲除小鼠,IGF-1R导致减少骨小梁体积与有缺陷的矿化(
66年]。另一方面,老鼠缺乏成骨细胞骨小梁减少红外;但是,与IGF-1R淘汰赛,骨矿化(通常
67年]。因此,IGF-1R信号耦合矩阵生物合成来维持矿化至关重要。的确,IGF-1R或红外存在影响成骨细胞数量/丰富的骨头,在缺乏IGF-1R不会改变成骨细胞的数量,但廉价的红外严重降低成骨细胞在骨的数量
66年,
67年]。有趣的是,有条件的可拆卸的成骨细胞的IGF-1R大大增加他们的胰岛素反应通过红外可以部分弥补IGF-1R通过促进增殖和矿化(
68年]。虽然红外可以弥补IGF-1R损失,IGF-1R是必不可少的增加这些信号交互正常的骨骼生长和营业额。两个红外亚型,IR-B区分msc和成熟的成骨细胞中大量表达而IR-A是增殖细胞中大量表达
69年]。因此,红外高比率的增加IR-B IR-A在分化成骨细胞(
69年]。PMSCs,我们表明,IR-A分化条件下由低氧张力升高;然而,IR-B是室内空气的主要同种型。与IR-A介导促有丝分裂的行为参与细胞增殖增加,动脉粥样硬化,和癌症,IR-B负责代谢行动来促进新陈代谢,细胞分化,增加寿命
70年]。这表明,高分化成骨细胞表达IR-B利用更多的葡萄糖代谢水平和可能在区分细胞适应更高的能源需求。
总之,我们已经表明在这项研究中,PMSCs可以成功区分向成骨的血统;因此,他们可能是一个替代来源为成人骨髓msc。预处理在低氧张力和igf(主要是igf - 1)刺激PMSCs承诺策略来生成成骨的祖细胞组织再生和修复治疗骨疾病。此外,
在活的有机体内研究在动物模型中使用这些策略将被要求确定再生疗法的成功嫁接PMSCs OI或骨折。