文摘

强直性脊柱炎(AS)是一种自身免疫性疾病,病因不明。间充质干细胞(msc)特异表达细胞凋亡可能导致自身免疫性疾病的发病机制。然而,患者细胞凋亡的msc (ASMSCs)尚未研究。本研究旨在评估骨骨髓来源的细胞凋亡ASMSCs和调查改变ASMSCs凋亡的潜在机制。我们成功地诱导的细胞凋亡ASMSCs和msc健康献血者(HDMSCs)使用的结合肿瘤坏死因子-α(TNF -α)和环己酰亚胺(CHX)。我们发现ASMSCs对待TNF -α和比HDMSCs CHX显示细胞凋亡水平较高。在细胞凋亡,ASMSCs表达更多TRAIL-R2,激活死亡受体途径和线粒体途径通过增加FADD的表达,caspase-8裂解,胞质细胞色素C, caspase-3分开。抑制TRAIL-R2表达式使用shRNA消除了凋亡HDMSCs差异和ASMSCs部分减少HDMSCs ASMSCs细胞凋亡,但最低限度影响。此外,FADD的表达,caspase-8裂解,胞质细胞色素C,裂解caspase-3 HDMSCs之间的可比性,ASMSCs TRAIL-R2后抑制。这些结果表明,增加TRAIL-R2表达式结果增强ASMSCs细胞凋亡和可能导致发病。

1。介绍

强直性脊柱炎(AS)是一种原因不明的自身免疫性疾病,其特征是两个核心病理变化:慢性炎症和病理性骨生成1]。最近的研究集中在发病机理是,和几个危险因素已报告是显著相关的,包括人类白细胞抗原B27 (HLA-B27)遗传易感性2),基因多态性(3),环境诱因(4- - - - - -6),和机械应力7]。然而,这些风险因素都单独负责的发病机制。

间充质干细胞(msc)是一种异构的细胞,可以从许多孤立的组织,包括骨髓。msc发挥至关重要的作用在健康和疾病的免疫调节势,自我更新,和多功能分化能力8,9]。最近的研究表明,msc功能障碍导致许多疾病(10,11]。符合这些报告,我们之前的研究观察msc成骨分化能力的增加从病人(ASMSCs)从健康的捐赠者与msc (HDMSCs) [12),这可能部分解释病理骨生成的。然而,它在很大程度上仍是个未知数ASMSCs是否参与的慢性炎症。

肿瘤坏死因子-α(TNF -α)是一种多效性的细胞因子参与多种生理和病理过程从炎症细胞因子的生产到细胞生存和凋亡[13]。由于它能够刺激炎症,肿瘤坏死因子-生产过剩α被建议的发病机理是(14]。这一假设已被证实的疗效观察与TNF -α阻断剂治疗(15,16]。除了引发炎性反应、肿瘤坏死因子-α也可以诱导细胞生存或凋亡。蛋白抑制剂(如环己酰亚胺,CHX)可以直接TNF -α诱导哺乳动物细胞的凋亡17]。细胞凋亡是一种正常的生理细胞自杀过程,在稳态中起着至关重要的作用。大量的证据支持,免疫细胞的凋亡缺陷可能导致自身免疫性疾病(18]。此外,最近的一项研究表明,增强msc细胞凋亡也可能导致自身免疫性疾病的发病机制19]。因此,研究细胞凋亡的msc可以提高我们对自身免疫性疾病的发病机制的理解,包括。然而,肿瘤坏死因子-α全身的细胞凋亡的ASMSCs尚未研究。

TNF-related凋亡诱导配体受体2 (TRAIL-R2)是一个特定的细胞表面受体,属于肿瘤坏死因子受体超家族20.]。TRAIL-R2表示在许多细胞类型,包括msc (21,22]。在绑定特定的配体,小道,TRAIL-R2发起招募Fas-associated蛋白质与死亡域(FADD)和信号分子(如caspase-8)形成death-inducing信号复杂(光盘)。然后激活下游还存在(比如caspase-3)和导致细胞凋亡23]。

在这项研究中,我们调查了细胞凋亡ASMSCs和可能的潜在机制。我们的结果表明,ASMSCs更容易TNF -α/ CHX-induced比HDMSCs由于细胞凋亡增加TRAIL-R2表达式。我们推测,TRAIL-R2表达的增加导致ASMSCs的增强细胞凋亡,这可能导致发病。

2。材料和方法

2.1。招募的病人和健康的捐赠者

本研究通过孙逸仙纪念医院的伦理委员会,中山大学,广州,中国。有28个健康的捐赠者和22名患者(根据纽约修改标准诊断[24])同意参加本研究(参与者的详细特征提出了补充表1在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/4521324)。从每个参与者书面知情同意了。最小化的影响治疗,所有患者停止任何治疗前2周骨髓穿刺。

2.2。msc隔离、扩张和识别

从髂骨骨髓msc的所有研究对象和使用密度梯度离心法纯化如前所述[25]。鹰resuspended杜尔贝科的修改后的介质(美国Gibco DMEM)含10% heat-inactivated胎牛血清(四季青的边后卫,中国),msc被播种在25厘米²烧瓶和培养孵化器有限公司为5%₂在37°C。去除悬浮细胞,中取代了48小时后,每3天之后。在80 - 90%融合,贴壁细胞恢复使用含有0.53毫米的0.25%胰蛋白酶EDTA(美国Gibco)和山肩在75厘米²烧瓶,通道1所示。msc扩展和段落4用于实验。表面标记的msc使用流式细胞术(FCM)检测,这是对BD涌入细胞分选仪(美国BD)。CD14-APC、CD29-PE CD44-FITC、CD45-APC CD105-FITC, HLA DR-PerCP抗体(美国从BD)使用。

2.3。细胞增殖实验

msc在同一通道被播种在96 -孔板在DMEM 10%的边后卫。中没有细胞作为消极的控制。msc的增殖能力检测使用细胞计数Kit-8 (Dojindo、日本)后,制造商的指示。

2.4。细胞凋亡诱导

msc在6-well板块分别播种密度1×10⁵细胞在DMEM / 10%的边后卫。24小时后,中被移除,msc与磷酸盐(PBS)清洗三次。相同的msc样本分别培养6小时有四个不同类型的媒体:新鲜DMEM的边后卫(对照组)、10%新鲜DMEM和10%的边后卫和20 ng / mL TNF -α(肿瘤坏死因子-α集团),新鲜的DMEM的边后卫和10 10%μg / mL CHX (CHX组),和新鲜的DMEM和10%的边后卫,20 ng / mL TNF -α,10μg / mL CHX (TNF -α/ CHX组)。6小时后,msc被实验的收获。

2.5。PE-Annexin V和FCM MSC的检测细胞凋亡

凋亡细胞被染色使用PE-Annexin V凋亡检测设备(美国BD)根据制造商的协议。首先,这些细胞被洗PBS和resuspended绑定缓冲。第二,100年μL的解决方案被转移到一个5毫升文化管。第三,5μL (PE-Annexin V和5μ7-AAD被添加到细胞的L。混合物轻轻涡和孵化在黑暗中在室温下15分钟。然后,400年μL(绑定缓冲被添加到每个管和FCM分析细胞凋亡是立即执行。数据分析使用FlowJo软件。

2.6。蛋白质组分析器抗体阵列分析

apoptosis-related蛋白的表达在msc被发现使用蛋白质组分析器™人类细胞凋亡数组工具包(美国研发ARY099)根据制造商的指示。短暂,等量的蛋白质从HDMSCs和ASMSCs孵化与膜在一夜之间在4°C。膜的清洗和孵化与重组检测抗体鸡尾酒1小时。之后,再次洗膜和孵化Streptavidin-HRP 30分钟。最后,使用化学试剂混合蛋白表达检测。数组的强度进行了分析使用VisionWorks®夺得LS图像采集和分析软件(德国耶拿分析仪器公司AG)、德语)。重复的强度点平均然后标准化使用参考点。

2.7。定量实时聚合酶链反应(存在)

msc的总RNA提取使用试剂盒试剂(美国表达载体)和转录成cDNA使用PrimeScript™RT大师混合(豆类、日本)。为每个样本中存在进行了一式三份在LightCycler®480 PCR系统(瑞士罗氏公司)使用SYBR®预混料交货Taq™(豆类、日本)如前所述26]。GAPDH是用作看家基因。相关基因的引物补充表所示。数据标准化基于GAPDH表达式,以及方法被用来分析每个基因的相对表达。

2.8。免疫印迹

msc细胞溶解和蛋白质是量化描述(13]。线粒体和细胞质蛋白质从msc孤立使用细胞线粒体隔离设备(Beyotime,中国)所描述的27]。沸腾后样品加载缓冲区(Beyotime,中国),等量的蛋白质提取分离和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(微孔,德国)。膜被封锁和孵化一夜之间在4°C主要抗体β肌动蛋白,pro-caspase-3 /裂解caspase-3、FADD TRAIL-R2, caspase-8裂解,TNFR1, Fas(美国从春秋国旅),细胞色素C(研发、美国)。洗涤三次后,膜与辣根过氧化物酶- 1小时孵化(合)共轭二次抗体(圣克鲁斯,美国)。止动剂西方化学发光合衬底(微孔、德国)是用于检测antibody-antigen复合物。

2.9。慢病毒结构和感染

慢病毒编码的短发卡RNA(成分)TRAIL-R2建立了目标序列的5′-GCAAATATGGACAGGACTATA-3′(Lv-TRAIL-R2)。负控制成分的序列5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3′(Lv-NC)。慢病毒是由cotransfecting pGLVH1 GFP /普罗(基因制药、中国)和包装质粒(pGag /波尔,上一页,和pVSV-G)到293年t细胞。文化上层清液含慢病毒转染后过滤和集中72小时。慢病毒(1×10⁹你/毫升)和聚凝胺(5μg / mL)被添加到中期和msc孵育24小时感染复数(MOI) 50。相关实验6小时后细胞凋亡诱导。

2.10。统计分析

实验和分析分别完成不同作者在本研究上市。使用SPSS 22.0软件进行统计分析(美国芝加哥)。数据表示为平均值±标准偏差(SD)。两组之间的差异是由学生的决定t以及,差异三个或更多组由方差分析。P值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。HDMSCs和ASMSCs有相同的形态、表型和增殖率

典型的msc, HDMSCs和ASMSCs plastic-adherent,纺锤状细胞(图1(一))持续表达CD29、CD44、和CD105但不是CD14、CD45、或HLA-DR(图1(b))。HDMSCs和ASMSCs扩散同样与10%的边后卫DMEM(图1 - 7天1(c))。HDMSCs之间没有差异被发现和ASMSCs形态、表型或增殖率。

3.2。ASMSCs HDMSCs相比表现出更高水平的细胞凋亡与肿瘤坏死因子-治疗后α/ CHX

凋亡细胞被染色和藻红蛋白- (PE)膜联蛋白V / 7-amino-actinomycin (7-AAD)和通过流式细胞术(FCM)。负膜联蛋白V和7-AAD染色显示细胞不发生细胞凋亡。膜联蛋白V-positive 7-AAD-negative细胞早期凋亡被认为是;膜联蛋白V - 7-AAD-positive细胞在晚期凋亡或已经死了。图2表明治疗与肿瘤坏死因子-α/ CHX造成重大的HDMSCs ASMSCs和凋亡细胞凋亡率ASMSCs HDMSCs的将近两倍。肿瘤坏死因子-α单独或CHX治疗没有引起明显的细胞凋亡在6小时内,类似于对照组,没有区别HDMSCs和ASMSCs被发现在这三个组。这些结果表明ASMSCs HDMSCs相比更容易受到细胞凋亡与肿瘤坏死因子-治疗后α/ CHX。考虑到肿瘤坏死因子-α或CHX本身并不能诱导msc的重要细胞凋亡在6小时内,只有TNF -的结果α/ CHX组和对照组为下面的实验报告。

3.3。ASMSCs表明裂解蛋白表达增加的Caspase-3, TRAIL-R2, FADD和增加TRAIL-R2和FADD细胞凋亡的基因表达

探索机制参与细胞凋亡之间的差异HDMSCs ASMSCs, 35 apoptosis-related蛋白被发现使用蛋白质组分析器™人类细胞凋亡数组工具包。结果表明,ASMSCs有更高的裂解caspase-3表达但pro-caspase-3表达低于HDMSCs治疗后肿瘤坏死因子-α/ CHX,这进一步证实了ASMSCs细胞凋亡的增加。此外,表达水平明显高于TRAIL-R2和FADD也比HDMSCs ASMSCs中找到。无显著差异,其余31蛋白质的表达水平HDMSCs和ASMSCs之间(图中被发现3(a))。存在和免疫印迹分析进行确认的结果蛋白质组分析器™人类细胞凋亡阵列分析。TRAIL-R2和FADD的信使rna表达水平一致的结果蛋白质组分析器™人类细胞凋亡阵列分析,但总caspase-3的信使rna表达水平。总caspase-3 mRNA表达无显著差异被发现与HDMSCs ASMSCs要么有或没有TNF -α(图/ CHX治疗3(b))。的蛋白表达水平裂解caspase-3、pro-caspase-3 TRAIL-R2, FADD符合人类蛋白质组分析器™凋亡的结果数组分析(图3(c))。因为caspase-3提升者通过其裂解细胞凋亡形式,比较总caspase-3 mRNA水平HDMSCs和ASMSCs可能表明ASMSCs之间更容易受到凋亡相比HDMSCs caspase-3的乳沟,而不是通过增加caspase-3的mRNA表达的增加。

3.4。死亡受体的细胞凋亡和线粒体通路均参与msc

细胞凋亡过程主要是通过死亡受体途径和线粒体途径(博士)。的乳沟caspase-8并从线粒体细胞色素C的释放到细胞质中,分别代表通路博士和线粒体通路的激活。确定这两个途径参与了细胞凋亡改变ASMSCs,我们测量了信使rna表达水平的总caspase-8和总细胞色素C,以及活动形式的相应的蛋白质:裂解caspase-8和胞质细胞色素C。我们的研究结果表明,两总caspase-8和细胞色素C的mRNA表达与肿瘤坏死因子-治疗后增加α/ CHX。ASMSCs表达明显高于mRNA水平的总比HDMSCs caspase-8,虽然没有发现差异HDMSCs和ASMSCs之间总细胞色素C(图4(一))。蛋白表达的胞质细胞色素C和裂解caspase-8增加治疗后肿瘤坏死因子-α/ CHX,与HDMSCs相比,ASMSCs表现出更高的表达这两种蛋白质(图4 (b))。因为细胞色素C需要释放到细胞质中细胞凋亡发生,总细胞色素C的信使rna表达水平不一样有意义的胞质蛋白表达。我们还检测到的基因和蛋白质表达TNFR1 Fas,两个重要的受体,除了TRAIL-R2,与FADD交互。然而,尽管基因和蛋白表达水平与肿瘤坏死因子-治疗后增加α/ CHX,没有发现差异基因或蛋白表达在两组之间,要么有或没有TNF -α(图/ CHX治疗4(一)和4 (b))。这些结果共同表明博士途径和线粒体通路参与ASMSCs改变细胞凋亡;TNFR1和Fas博士占FADD的增加表达的途径。

3.5。慢病毒编码shRNA-TRAIL-R2部分抑制ASMSCs的细胞凋亡,但HDMSCs对细胞凋亡的影响有限

因为ASMSCs表达比HDMSCs TRAIL-R2在细胞凋亡过程中,我们构造Lv-TRAIL-R2探索TRAIL-R2扮演的角色在ASMSCs的细胞凋亡。GFP-positive细胞共焦显微镜下观察,和转导效率HDMSCs和ASMSCs(图之间的可比性5(一个))。Lv-TRAIL-R2抑制基因和蛋白表达TRAIL-R2 HDMSCs和ASMSCs(图5 (b))。FCM结果表明Lv-TRAIL-R2可以减少ASMSCs的细胞凋亡,但对细胞凋亡的影响有限HDMSCs(图6(a))。存在表明Lv-TRAIL-R2抑制FADD的表达和总caspase-8 ASMSCs但有限影响总caspase-3和总细胞色素c。与此同时,Lv-TRAIL-R2并不影响HDMSCs的四个相关的基因的表达。抑制TRAIL-R2表达式后,没有发现明显的差异基因表达与HDMSCs ASMSCs(图6(b))。此外,Lv-TRAIL-R2并不影响的蛋白质含量caspase-3裂解,裂解caspase-8, FADD、胞质细胞色素C在ASMSCs HDMSCs但减少它们。此外,没有明显差异的蛋白表达caspase-3裂解,裂解caspase-8, FADD、胞质细胞色素C HDMSCs之间被发现和ASMSCs后抑制TRAIL-R2表达式(图6(c))。因此,抑制TRAIL-R2表达一定程度上减少ASMSCs的细胞凋亡,但对HDMSCs有限的影响。

4所示。讨论

异常msc提出了参与的发病机制,并更好的理解ASMSCs障碍可以改善的理解。在这项研究中,ASMSCs形态、表型,类似于HDMSCs和扩散率。然而,ASMSCs更容易TNF -α/ CHX-induced HDMSCs相比凋亡。TRAIL-R2 ASMSCs表达水平较高,激活博士和线粒体通路通过增加FADD的表达水平,caspase-8裂解,和胞质细胞色素c抑制TRAIL-R2表达式使用shRNA消除细胞凋亡HDMSCs之间的差异和ASMSCs ASMSCs通过减少细胞凋亡。

msc与multilineage多功能基质细胞分化能力和免疫调节特性。我们以前的研究表明,msc与发病机理和治疗(12,28]。我们发现ASMSCs拥有异常成骨的能力,这可能导致的发病机制。此外,我们还发现,外源的静脉注入骨骨髓来源msc是可行的和安全的治疗。然而,体内微环境如何与msc仍然未知。

作为是一个复杂的自身免疫性疾病伴有血清水平升高的各种炎性细胞因子(14,29日]。在这些细胞因子中,TNF -α是最重要的球员之一的发病机制。生理上,肿瘤坏死因子-α炎症是很重要的对于一个正常反应,但生产过剩的TNF -α可以是有害的。血清水平和骶髂关节TNF的表达α升高的病人,包括那些在早期阶段的(30.,31日]。此外,生产过剩的TNF -α建议与疾病活动和占的发病机制(32]。肿瘤坏死因子- - - - - -的重要性α进一步证实了TNF的功效-α抑制剂治疗(16]。由于肿瘤坏死因子——的重要性α在研究,肿瘤坏死因子-之间的互动α和msc可以帮助模拟msc在体内微环境。先前的研究表明,肿瘤坏死因子-α以各种方式影响着msc。肿瘤坏死因子-α可以调节msc的免疫抑制作用和抑制成骨的能力33]。此外,肿瘤坏死因子-α在msc可以改变体内平衡调节细胞凋亡和生存之间的平衡(13]。相反,msc影响TNF -的生产α通过引起巨噬细胞采取抗炎表型(34]。msc的障碍和肿瘤坏死因子的生产过剩α可能导致免疫失调。最近的一项研究表明,肿瘤坏死因子-α全身的细胞凋亡的msc可能导致系统性红斑狼疮的发病机制(19]。在我们的研究中,我们发现ASMSCs更容易TNF -α全身的细胞凋亡与HDMSCs相比,就是明证裂解的细胞凋亡率和较高的表达增加caspase-3蛋白质。然而,如何调节异常的细胞凋亡导致的发病机制仍不确定。

细胞凋亡,也定义为程序性细胞死亡,是各种疾病的发病机制的关键,包括自身免疫性疾病(18]。维持免疫耐受和免疫内稳态在很大程度上是依赖于细胞凋亡。有缺陷的免疫细胞的凋亡可能导致缺陷autoreactive细胞间隙或延迟消除自身抗原,而免疫抑制细胞的过度凋亡(比如msc)也可能导致免疫hyperactivation。因此,这两种情况可能导致自身免疫性疾病(19,35]。患者,ASMSCs细胞凋亡的增加可能会导致细胞数量的减少和免疫抑制的潜力,最终导致自身免疫性疾病。此外,由于msc可以降低TNF -α也生产,msc细胞凋亡的增加可能导致TNF -α生产过剩。此外,肿瘤坏死因子-α生产过剩细胞凋亡进一步MSC,形成一个恶性循环导致的慢性炎症。因此,增加ASMSC凋亡可能的关键病机,并进一步研究细胞凋亡在ASMSCs特异表达的机制可能有助于阐明发病机制的。

TRAIL-R2是一个特定的细胞表面受体参与细胞凋亡。TRAIL-R2-mediated细胞凋亡引起了关注由于其作用优先杀死肿瘤细胞的同时,仍能保留正常细胞。在我们的研究中,我们观察到显著增加表达TRAIL-R2 ASMSCs治疗后与TNF -α/ CHX。抑制TRAIL-R2表达一定程度上减少ASMSCs的细胞凋亡,但影响有限HDMSCs的细胞凋亡,这表明TRAIL-R2超表达是在ASMSCs增加细胞凋亡的主要原因。然而,这个结果是令人困惑的原因有两个。首先,据报道,TRAIL-R2主要是由其特定的配体激活,小道(20.]。然而,在我们的研究结果表明,TRAIL-R2 msc可以激活TNF -α/ CHX。事实上,此前曾报导过类似的结果,但机制尚不清楚36]。考虑到过度TRAIL-R2可导致细胞凋亡甚至没有配体(22),我们推测,TNF -α可能调解proapoptotic影响不仅通过自己的受体(TNFR1),但也通过增加TRAIL-R2的表达。第二,骨骨髓来源据说成年msc对TRAIL-R2-mediated凋亡[21]。然而,在我们的研究中,HDMSCs耐TRAIL-R2-mediated凋亡,ASMSCs没有。多个TRAIL-R2-mediated凋亡机制抵抗,失调等敌对的受体,异常O-glycosylation,抑制过度的适配器,已确定(37]。还需要进一步的研究来说明相关的具体机制的差异HDMSCs阻力和ASMSCs TRAIL-R2。此外,基于发现TRAIL-R2通路没有导致正常细胞的凋亡,ASMSCs可能被认为是不正常的细胞。因此,它是合理的假设他生的而非自体MSC移植可能是最好的治疗。

在这项研究中,我们表明,TRAIL-R2 upregulation ASMSCs导致增强的细胞凋亡。ASMSCs细胞凋亡的增加可能会降低免疫抑制这些细胞的潜力和可能导致发病。然而,仍有一些局限性。肿瘤坏死因子-如何的问题α激活TRAIL-R2的表达,为什么HDMSCs耐TRAIL-R2-mediated凋亡而ASMSCs不是,无论我们的结果可以重复体内仍然悬而未决。未来的研究应该关注这些问题,并进一步阐明的机理。

相互竞争的利益

作者没有潜在的利益冲突声明。

作者的贡献

振华Liu都高,彭王同样贡献了这项工作。

确认

作者感谢博士张亮深刻的讨论。这项研究得到了国家自然科学基金(81401850)、广东省科技项目(2015 b020228001 2015 b090903059),工程技术研究中心和综合诊断和治疗强直性脊柱炎的广东高等教育机构(GCZX-A1301)。

补充材料