文摘

疗法基于移植间充质基质细胞(MSC)持有管理承诺的炎症性疾病。恰加斯病在慢性心肌病(CCC),慢性感染所致鲁兹锥体,加剧了免疫反应起着重要的病理生理作用,可以调制MSC。在这里,我们调查的角色galectin-3 (Gal-3),与几个行动beta-galactoside-binding凝集素免疫反应和修复过程中,在免疫调节MSC的潜力。Gal-3击倒在MSC并不影响immunophenotype或分化的潜能。然而,Gal-3击倒MSC显示减少核扩散,生存和迁移。此外,当与CCC腹腔内注射到老鼠体内,Gal-3击倒MSC移植体内受损。控制移植MSC与CCC造成抑制小鼠心脏炎症和纤维化,减少CD45的表达水平,TNFα,il - 1β白介素、干扰素γ,I型胶原蛋白。相比之下,Gal-3击倒MSC未能抑制免疫反应或胶原蛋白合成与CCC老鼠的心。最后,感染t . cruzi表明寄生虫生存在野生型而不是Gal-3击倒MSC。这些发现表明Gal-3 MSC的生存起着至关重要的作用,在CCC扩散、迁移,及治疗的潜力。

1。介绍

间充质基质细胞(MSC)多功能干细胞能够分化成mesoderm-derived细胞谱系,如软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞(1]。描述Friedenstein和他的同事在1970年(2),MSC plastic-adherent细胞呈现呈形态和特点是比表面标记物的表达和演示trilineage分化潜能。MSC可以很容易地获得来自不同器官和组织的成年个体,成为目前研究最多的细胞类型中细胞疗法(1]。

的潜在使用MSC治疗炎症和自身免疫性疾病是基于几个免疫调节的行为描述,包括T和B淋巴细胞的活化,抑制NK细胞、树突细胞和刺激的调节性T细胞分化[3]。MSC的抗炎作用的深入研究,发现由il - 10, TGF -β,PGE2、HGF和被罩(用于人类细胞)或间接宾语(老鼠细胞)。Galectin-3 (Gal-3)也被认为是免疫调节的关键中介行为的人类MSC (4,5]。

Galectins是一组galactoside-binding凝集素调节各种生物过程。Gal-3存在于细胞外和细胞内的隔间,参与细胞黏附、迁移、凋亡、炎症和组织修复(6]。表达式的Gal-3成纤维细胞增殖和细胞外基质的合成相关组件,导致疤痕形成(7- - - - - -9]。在内皮前体细胞,Gal-3促进增殖和血管生成10]。虽然Gal-3在免疫细胞的作用已被广泛研究,行动受到Gal-3表达式在MSC。在炎症和纤维化微环境在组织中高度表达(11),Gal-3可能影响MSC生物学和响应,自然或细胞疗法的场景。

细胞疗法已被调查作为一个潜在的替代治疗恰加斯病的心肌病,慢性心脏衰竭在拉丁美洲的相关原因的结果鲁兹锥体感染(12,13]。一个加剧了针对寄生虫和宿主抗原的免疫反应在CCC的发病机制中起着核心作用,导致进步的心肌细胞的损失,纤维化,心律失常,失去心室功能13]。以前,这是证明了MSC移植到小鼠慢性感染t . cruzi减少引起心肌炎和调制的纤维化14- - - - - -16]。此外,我们表明,Gal-3表达增加的慢性chagasic老鼠和人类样本(17,18]。t . cruzi感染诱发增加Gal-3表达在不同的细胞类型,有利于寄生虫附着,迁移,入侵,减少抗免疫反应(19- - - - - -23]。在这里,我们调查的潜在参与Gal-3 MSC的迁移能力和发挥免疫调节行动CCC的小鼠模型,也调查潜在的行动parasite-host细胞相互作用。

2。材料和方法

2.1。动物的过程

六到八周大的女性C57BL / 6小鼠被用于这项研究。提出了所有的动物和维护在动物设施中心的生物技术和细胞疗法,圣拉斐尔医院,与控制房间温度(22±2°C)和湿度(55±10%),连续气流,和12 h光/ 12 h黑暗周期(6 am-6 pm)和提供啮齿动物的饮食和水随意。小鼠动物实验,根据美国国立卫生研究院的指导方针处理得到事先批准的和研究动物在圣拉斐尔医院伦理委员会。

2.2。隔离和MSC的文化

骨髓细胞得到胫骨和股骨的冲洗和杜尔贝科的修改鹰的培养基培养(DMEM;ThermoFisher科学、沃尔瑟姆,妈,美国),10%胎牛血清(ThermoFisher科学),和1%的青霉素和链霉素(ThermoFisher科学)湿润孵化器在37°C和5%大气CO₂。媒介是改变每2 - 3天,confluency文化达到90%时,细胞通过trypsin-EDTA 0.25%解决方案(ThermoFisher科学)。

2.3。Galectin-3击倒

稳定Gal-3击倒通过MSC或J774巨噬细胞通过与慢病毒载体转导携带shRNA目标序列Lgals3基因或炒控制(Lgals3_shRNA1 5′-GATTTCAGGAGAGGGAATGAT-3′;一个Lgals3_scrbl_shRNA 5′-AGGTATGAGTCGAGATTGAGA-3′),如前所述[18]。培养基代替和一个额外的细胞培养48 h,正在评估GFP报告基因表达用倒置荧光显微镜(Eclipse Ti-E;尼康,日本东京)。这些细胞被扩展和可拆卸的效率为每个成分被共焦显微镜和qPCR分析评估。

2.4。流式细胞术分析

immunophenotyping, MSC线路通过离心机和颗粒在PBS resuspended。总共5×10⁵细胞用于标签用下面的抗体浓度的1/50:Sca1PE-Cy7 (BD生物科学,圣何塞、钙、美国),CD45-PerCP (eBioscience、圣地亚哥、钙、美国),CD44-PE (BD生物科学),CD90-APC (BD生物科学),CD34-AlexaFluor647 (BD生物科学)和控制同形像。细胞在100年被孵化μL(绑定缓冲(ThermoFisher科学)和annexin-V-FITC 7-AAD(美国BD生物科学,圣何塞,CA) 15分钟在黑暗中在潜伏期后沿,与PBS细胞被洗两次,进行了数据采集和分析使用LRSFortessa流式细胞分析仪(BD生物科学)。至少10000事件是获得和分析。

2.5。Trilineage分化分析

脂肪形成的、成骨的chondrogenic分化进行了使用商用设备,遵循制造商的指示(ThermoFisher科学)。脂肪形成的分化,细胞培养在24-well板块脂肪形成的感应中,StemPro脂肪形成分化工具包。在分化14天,发现了脂质包体固定在4%多聚甲醛和油红染色方案。成骨分化的细胞在一个特定的成骨分化培养基培养,StemPro成骨分化工具包。一半的分化培养基是改变每两天。富含钙的基质沉积和茜素红染色法观察到2%。chondrogenic分化,细胞培养21天在chondrogenic分化培养基,StemPro软骨形成分化工具包。蛋白合成评估与阿尔新蓝染色后的解决方案。捕获的图像与一个倒置显微镜(Eclipse Ti,尼康、东京、日本)。

2.6。内皮细胞分化

MSC对内皮细胞的分化是由孵化的细胞EGM-2介质(Lonza、巴塞尔、瑞士),如前所述[15]。内皮管形成试验进行观察capillary-like镀三维结构的分化细胞基底膜基质(美国纽约康宁,康宁公司)。使用一个捕获的图像倒置显微镜(Eclipse Ti,尼康)。

2.7。扩散分析

不同的MSC增殖率的比较评价,这些细胞被镀在96 -孔板,在密度为10⁴细胞/好,在200年的最后一卷μL,一式三份,并在DMEM培养补充10%的边后卫。24小时后,板与1脉冲μCi甲基-³为18 H, H胸苷(PerkinElmer)和扩散被测量评估³通过使用变色龙H-thymidine吸收β板计数(Hydex;芬兰图尔库)。

2.8。细胞迁移分析

MSC在井24-well板,镀的细胞密度5×10⁴细胞/厘米²。活细胞成像都使用了轻歌剧含量高成像系统(珀金埃尔默)控制温度(37°C)和大气CO₂(5%)。数字相差图像获得10倍放大(10 x高NA客观)使用轻歌剧的自动数字相位对比算法。图像采集的时间间隔设置为10分钟在16 h。细胞图像分割使用Find和谐3.5.2软件的构建块(珀金埃尔默),它提供了一个专用的数字相衬显微镜的图像分割算法。分段细胞受到细胞跟踪使用跟踪对象的构建块。属性描述细胞迁移的每个时间点计算,如位移。代表的平均平方位移图所示。伤口愈合的体外试验,MSC在6-well培养板,直到单层成立。吸管的技巧被用于制造一个沿着好抓,和地区拍摄时间点0和3天后差距的距离测量。

2.9。t . cruzi感染和细胞移植

Trypomastigotes myotropic哥伦比亚t . cruzi压力来源于文化LLC-MK2感染细胞上清液,如前所述[24]。然后,C57BL / 6小鼠感染与1000年腹腔内注射t . cruzitrypomastigotes PBS。证实了感染寄生虫血症后感染后不同时间点。

六个月后感染,老鼠被随机分为三组:控制MSC, Gal-3击倒MSC,或生理盐水。管理方案由一个每周的腹腔内注射暂停10⁶MSC,或者相同体积的生理盐水(100μL)。小鼠安乐死与氯胺酮麻醉下颈椎脱位(100毫克/公斤)和甲苯噻嗪(10毫克/公斤),7日一周的开始治疗后,进行分析。

体外感染,MSC或J774巨噬细胞被孵化t . cruzitrypomastigotes (为24小时)。然后,水井洗,媒介所取代。细胞被固定,与DAPI染色寄生虫量化在轻歌剧系统(PerkinElmer),或提交透射电子显微镜法处理和分析。超微结构分析,细胞被固定在4°C 12 h 3%戊二醛溶液在PBS (Sigma-Aldrich), 0.1钠甲次砷酸盐缓冲,清洗和后缀四氧化锇1% 30分钟。使用分级脱水是由一系列丙酮的解决方案,那么样本嵌入在环氧树脂Polybed812(电子显微镜科学,哈特菲尔德,PA,美国)。超薄部分得到使用EM UC7超微切片机(徕卡,位于德国)和与醋酸双氧铀及柠檬酸铅。使用透射电子显微镜分析了部分JEM1230 JEOL(日本东京)在80千伏。

2.10。实时逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)

分离细胞、心脏和脾脏样本进行总RNA提取使用试剂盒试剂(热科学)。本文用分光光度法测定RNA浓度。接下来,互补脱氧核糖核酸形成的,从1开始μ使用高容量cDNA g RNA逆转录工具包(热科学),遵循制造商的指示。RT-qPCR化验的表达水平进行检测Tbet(Mm_00450960_m1),肿瘤坏死因子(Mm_00443258_m1),Ifng(Mm_00801778_m1),Col1a1(Mm_0801666_g1),Il1b(Mm_0043228_m1),白细胞介素6(Mm_00446190_m1),Ptprc(Mm_01293577_m1)。RT-qPCR放大混合物中含有20η(10 g模板cDNA、Taqman主组合μL),探测器在最后一卷20μL(所有从热科学)。反应是在复制一个ABI7500序列检测系统上运行在标准的热循环条件下(热科学)。平均Ct(周期阈值)从重复的测量值被用来计算目标基因的表达,与内部控制——正常化Gapdh (mm99999915_g1),使用2−DCt公式。实验与变异系数大于5%被排除在外。nontemplate控制和nonreverse转录控制也被包括在内。

2.11。组织学和形态学分析

心被收集和缓冲福尔马林固定在10%。核心部分是由光学显微镜分析石蜡包埋后,紧随其后的是标准的苏木精和伊红()),或者小天狼星红染色。天狼星红点的部分是完全数字化使用共焦显微镜A1 +(尼康)。纤维化的比例是由分析整个部分沾小天狼星红点的心脏部分,半自动的形态学量化使用Pro + v.7.0形象。两个被调查人员进行了分析。

2.12。免疫荧光分析

疣状Gal-3表达进行检测的MSC镀在盖玻片。与多聚甲醛固定细胞4%和孵化一夜之间在4°C的主要抗体山羊anti-Gal-3,稀释1:400(美国圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)。第二天,部分被孵化1 h和phalloidin共轭Alexa萤石488 (1:200;ThermoFisher科学)与二级混合抗体抗体免疫球蛋白Alexa萤石568 (1:1000;ThermoFisher科学)。被KI67评估增殖细胞染色(anti-Ki67 1: 1000;ThermoFisher科学),其次是anti-rabbit免疫球蛋白Alexa萤石568 (1:1000 ThermoFisher科学)。死细胞被沾染了π(BD生物科学)。核沾染了4,6-diamidino-2-phenylindole (VECTASHIELD安装介质与DAPI h - 1200;向量的实验室,英国剑桥郡)。 The presence of fluorescent cells was determined by observation using an A1+ confocal microscope (Nikon).

2.13。统计分析

连续变量表示为±SEM手段。使用学生的未配对参数数据进行了分析t以及,两组之间的比较,1路的方差分析,其次是Bonferroni事后多重比较检验测试,使用Prism 6.0 (GraphPad软件)。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

来源于MSC的骨线与慢病毒载体转导产生的含有针对Gal-3 shRNA序列基因或不属预定目标的加密序列。Gal-3表达式的MSC行进行评估,以确认可拆卸的效率通过共焦显微镜和qPCR分析(数据1(一),1 (b),1 (c))。Gal-3细胞质和细胞核内的表达野生型(图1(一))和控制vector-transduced MSC。细胞转导的向量序列包含shRNA Gal-3击倒显示显著减少Gal-3表达式(图1 (b))。这一发现被证实在mRNA水平定量RT-qPCR分析(图1 (c))。

MSC行然后为了确保维护特征的表型和生物学性质定义MSC。Immunophenotyping通过流式细胞术显示出类似的模式表达的表面标记不同的细胞系,与MSC标记CD44阳性染色,CD90,本来,低频率的表达造血细胞谱系标记CD45和CD34(图1 (d))。接下来,我们评估了multipotential trilineage的MSC分化测定体外。根据特定的培养基,诱导MSC Gal-3击倒和控制线路能够有效地进行成骨,chondrogenic和脂肪形成的分化(图2(一个))。此外,击倒的Gal-3 MSC capillary-like形式结构不干扰他们的能力在endothelium-inducer培养基培养(图2 (b))。

接下来,分析了msc增殖率和生存。我们发现目前Gal-3击倒MSC增殖率下降相比,控制,作为衡量³H-thymidine合并(图3(一个))。此外,细胞发生细胞凋亡的数量高于Gal-3击倒MSC,控制相比,孵化后10μM H₂O₂(图3 (b))。

Galectin 3是已知影响cell-extracellular基质蛋白绑定和细胞迁移过程(25,26]。调查是否Gal-3击倒干扰MSC的迁移,我们评估了体外迁徙能力Gal-3击倒MSC和控制体外细胞系。Gal-3击倒了减少迁移在伤口愈合体外试验相比,控制MSC(数字4(一),4 (b),4 (c),4 (d),4 (e))。此外,利用位移细胞跟踪延时图像分析,我们发现Gal-3击倒的减少引起的流动MSC相比控件(数字4 (f),4 (g),4 (h))。

为了测试如果Gal-3击倒能损害MSC治疗行动在体内,细胞腹腔注射到小鼠慢性感染t . cruzi,恰加斯病的慢性心肌病模型(图5(一个))。首先,MSC迁移到脾脏的能力和心脏是评估移植后不久,由qPCR GFP mRNA表达分析。检测到GFP表达在脾脏早在30分钟后细胞移植和增加3 h时间点。然而,GFP mRNA表达检测含量明显降低小鼠的脾脏移植Gal-3击倒MSC控制MSC相比,30分钟和3 h后细胞管理。检测到了可以忽略不计的GFP的心在同一时间点(图5 (b))。

接下来,我们进行细胞移植的长期影响t . cruzi来华的老鼠。组老鼠每周收到ip注射10⁶MSC-wild-type或Gal-3击倒细胞为五个星期。一辆车被注射相同体积的生理盐水对照组(图5(一个))。7周后开始治疗,组织学和分子评价小鼠安乐死。

组织学分析心脏部分显示多病灶的炎性浸润的存在主要是由单核细胞t . cruzi来华的老鼠(图5 (c),5 (d),5 (e),5 (f))。CD45 PTPRC-which编码的水平,pan-leukocyte标记在心脏样本减少小鼠与野生型MSC的心,但不是Gal-3击倒MSC(图5 (g))。同样,与野生型MSC治疗,但不是Gal-3击倒MSC,减少基因的表达与炎症相关的心,如il - 1β、il - 6和TNFα(数据5 (h),5(我),5 (j))。干扰素的表达水平γ和T-bet Th1反应,被野生型MSC治疗显著降低。然而,Gal-3击倒MSC治疗没有降低干扰素γ或T-bet表达式,相比,感染控制(数字5 (k)和5(左))。

分析小天狼星红点的心脏部分t . cruzi来华的老鼠显示广泛的纤维化(数字领域6(一),6 (b),6 (c))。纤维化的内容在两组之间的心没有改变,胶原蛋白合成,以胶原蛋白I型(Col1a1与野生型MSC)基因表达降低,但不与Gal-3击倒MSC(数字6 (d)和6 (e))。

Gal-3以来之前与感染的过程t . cruzi(27),我们假设需要Gal-3寄生虫生命周期也在MSC。为了测试这个假设,MSC线路已提交到体外t . cruzi感染。我们发现Gal-3表达式是48和72 h后增加t . cruzi野生型感染MSC(图7(一))。此外,野生型MSC和Gal-3击倒MSC被成功感染了t . cruzi,呈现类似的寄生虫感染的比例和数量的每个细胞感染后24小时。然而,在感染后48和72 h, Gal-3击倒MSC提出的比例显著降低感染和每个细胞的寄生虫数量(图7 (b))。在同一时间点进行评估,没有观察到的差异对增殖(KI67的百分比⁺之间)和死细胞(PI染色),受感染的MSC(数据未显示)。为了评估如果这是一个特异性效应,也感染了J774巨噬细胞。Gal-3击倒的比例也降低感染和每个细胞的寄生虫数量J774巨噬细胞(数字7 (c)和7 (d))。

透射电子显微镜进行了超微结构分析的MSC感染t . cruzi,这表明t . cruzi有效地规避parasitophorous液泡和繁殖在野生型细胞溶质MSC(数字8(一个),8 (c),8 (e))。相比之下,t . cruzi仍在液泡Gal-3击倒MSC和经常被观察到毁于第二天(数字8 (b),8 (d),8 (f))。

4所示。讨论

Gal-3多功能凝集素与不同,表达的整合,和偶尔反对行动,在不同的细胞类型,在细胞外和细胞内的隔间(6]。粘附、增殖和迁移过程是一直深受Gal-3表达在不同的细胞类型,并增加Gal-3表达发挥作用在肿瘤细胞迁移和入侵的28]。在目前的研究中,我们表明,Gal-3击倒在MSC与迁移和增殖能力下降有关。依照最近的一项研究使用这些结果来源于MSC从小型猪的骨头(29日]。在这里,我们表明,Gal-3扮演关键角色支持细胞增殖、迁移、和生存,影响治疗效果观察移植后慢性恰加斯病心肌病小鼠模型。

MSC炎症的迁移和导航网站的过程还知之甚少,可能涉及不同的粘附分子,趋化因子和受体,如趋化因子受体CXCR4 / SDF-1轴(30.]。Gal-3最近被发现通过抑制促进迁移的MSC RhoA-GTP活动,增强p-AKT (ser473)表达式,和监管p-Erk1/2水平(29日]。基于这些数据在我们的研究结果,它是合理的建议Gal-3 MSC移植和归巢中起着重要作用,这可能会有一些影响在细胞移植环境。

在慢性恰加斯病模型,Gal-3表达式通过MSC与增加迁移从腹腔到脾脏。脾脏也作为炎症性单核细胞的储层特征,移民的被膜下的红髓和填充炎症网站(31日]。通过脾脏,MSC可以发挥免疫调节行动,与系统性的影响,观察到以前[32]。除了调节淋巴细胞数量,MSC还被证明促进扩大监管的单核细胞和粒细胞,称为myeloid-derived抑制细胞(MDSC),通过HGF分泌33]。通过迁移到心脏组织t . cruzi老鼠,MDSC被证明抑制T淋巴细胞在炎性浸润[34]。事实上,i.p。移植MSC显示迁移到心脏可以忽略不计,但仍能够促进免疫调节与检测影响心脏病。老鼠与Gal-3击倒MSC移植,然而,在观察脾脏细胞迁移,减少炎症和纤维化留在盐控制水平。

恰加斯病心肌病在慢性阶段,不同的机制相关的免疫反应中发现心脏而加剧,包括寄生虫持久性和自身免疫13]。移植MSC的能力减少心脏炎症在实验t . cruzi受感染的老鼠在研究中表明,系统性和地方运送路线申请细胞移植(14- - - - - -16,35]。在这里,我们表明,移植MSC的差别引起的对这些炎性细胞因子直接参与疾病发病机理,如肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ(13]。心脏组织的免疫调节效应观察高不相关招聘和自导MSC的心脏组织,支持的假设这些细胞在淋巴器官产生系统性调节行动如脾脏,在我们观察MSC的迁移。这证实了我们发现Gal-3击倒MSC移植效率明显降低脾脏免疫调节作用,施加低于野生型MSC。

关于寄生虫的持久性,心中除了它的存在,它已经表明,组织丰富的基质细胞,如脂肪组织,是水库的t . cruzi(13,36]。MSC作为水库的作用t . cruzi人类疾病的设置是可能的,但尚未确定。在这里,我们表明,MSC有效地感染了t . cruzi随着时间的推移,复制感染的体外。此外,我们发现Gal-3不干涉入侵过程,但它是参与寄生虫生活周期的进一步措施。我们的数据是按照以前的工作,描述一个角色的Gal-3一步parasitophorous液泡的寄生虫逃避巨噬细胞的胞质,一个关键的步骤t . cruzi生命周期(21]。

Gal-3表达增加了t . cruzi感染宿主细胞在目前的研究中,并在以前的报告(27]。已经证明Gal-3过度引起的感染寄生虫的循环很重要,因为它可以促进过程,如细胞外基质粘附,宿主细胞,从parasitophorous液泡和逃税20.,37]。然而,Gal-3过度引起的t . cruzi也一直与调制的不同方面的抗免疫反应,通过抑制血浆细胞分化和免疫球蛋白生产22),促进未成熟胸腺细胞的释放(23]。是否Gal-3表达增加了MSC贡献调制的急性感染的免疫反应t . cruzi是一个问题,需要进一步调查。

5。结论

总之,Gal-3感染的机制t . cruzi和免疫调节的中介行为由MSC恰加斯病慢性心肌病模型。Gal-3击倒MSC存活率降低、迁移和移植能力,导致疗效降低。因此,Gal-3有潜力被应用作为一个预测生物标志物,作为质量控制的一部分,在细胞制剂在治疗上应用,但这值得进一步调查。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作得到了资助CNPq, FAPESB, FINEP。作者要感谢克劳迪奥·佩雷拉博士Figueira技术援助的透射电子显微镜分析。