相声炎性巨噬细胞形状监管成人多能祖细胞的性质

文摘

巨噬细胞和小胶质细胞的主要效应细胞免疫介导的神经炎症疾病。开髓细胞抗炎、组织repair-promoting表型被认为是一种很有前途的战略阻止神经炎症,促进中枢神经系统(CNS)修复。在这项研究中,我们定义的影响成人多能祖细胞(MAPC),一个干细胞群共享共同的中胚层来源间充质干细胞(msc),巨噬细胞的表型和相互之间的相互作用这两种细胞类型。我们表明,MAPC抑制肿瘤坏死因子-α(TNF -分泌α)炎性巨噬细胞部分通过环氧酶2 (cox - 2)依赖机制。反过来,我们证明炎症巨噬细胞触发MAPC的免疫调节特性,包括免疫调节介质的表达增加(例如,诱导一氧化氮合酶(间接宾语)和cox - 2),趋化因子和趋化因子受体。Macrophage-primed MAPC分泌可溶性因子,抑制肿瘤坏死因子-α通过巨噬细胞释放。此外,检查参与组成分泌腺MAPC抑制抗原autoreactive T细胞和T细胞的增殖刺激巨噬细胞的能力。最后,MAPC增加他们的能动性对激活的巨噬细胞分泌的因素。总的来说,这些体外发现揭示亲密互惠MAPC和炎性巨噬细胞之间的相互作用,设计中重要性的MAPC-based治疗策略对神经炎症疾病的骨髓细胞发挥着至关重要的作用。

1。介绍

越来越多的证据表明,干细胞移植港口潜在治疗神经炎症疾病(1]。例如,神经前体细胞(npc)和间充质干细胞(msc)具有免疫调节功能和神经保护性质证明了衰减实验模型的移植后疾病严重程度的中枢神经系统(CNS)疾病有关,也就是说,多发性硬化症(MS)和创伤性脑损伤(TBI)等2- - - - - -5]。

巨噬细胞和小胶质细胞的主要效应细胞神经炎症疾病的发病机理6,7]。髓细胞被认为是主要有害于自身免疫性疾病的中枢神经系统,促进神经炎症脱髓鞘和神经退化8]。炎症和有毒的分泌物,如肿瘤坏死因子-α(TNF -α)、白介素6 (il - 6)、白细胞介素1β(il - 1β)和一氧化氮(NO),部分构成的诱发疾病影响骨髓细胞(女士8,9]。此外,髓细胞能促进神经炎症通过encephalitogenic T细胞的激活和促进他们的招聘中枢神经系统(9,10]。因此,开髓细胞在抗炎和再生表型被认为是一种很有前途的战略阻止疾病进展的神经炎症疾病。

几种类型的成人干细胞已被证明斜髓细胞向神经表现型。例如,msc可以抑制炎症介质的释放,如肿瘤坏死因子-α和巨噬细胞il - 6,同时诱导一个“M2-like”抗炎和修缮的表型在体外和体内11- - - - - -14]。此外,巨噬细胞似乎形状msc增强免疫调节功能和改变他们的迁徙属性(15,16]。这些研究指向亲密互惠干细胞和巨噬细胞之间的相互作用。

多功能成年祖细胞(MAPC)骨骨髓来源干细胞与msc分享共同的中胚层起源。然而,与msc相比,MAPC表现出更快的膨胀率和长期人口的倍增MAPC发生复制衰老的迹象未来治疗使用[提供足够的数量17,18]。此外,MAPC方面表现出优越的体外和体内免疫抑制特性相比,msc (19,20.]。特别是,使用异种的移植方法,人类MAPC (hMAPC)诱导小胶质细胞和巨噬细胞的“M2-like极化实验模型的创伤性脑损伤和脊髓损伤(SCI) (21- - - - - -23]。在另一项研究中,老鼠MAPC (rMAPC)减少金属蛋白酶9的表达(MMP-9)巨噬细胞,从而防止轴突枯死的macrophage-mediated感应SCI (24]。此外,似乎可塑性rMAPC形状,当他们遇到一个炎症环境(25]。这些特性使得MAPC一个有吸引力的替代干细胞移植在中枢神经系统疾病(21- - - - - -24,26]。然而,到目前为止,互惠MAPC和髓细胞之间的相互作用仍有待充分的特点。

在这项研究中,我们试图确定体外巨噬细胞之间相互交互和MAPC。我们表明,MAPC抑制巨噬细胞的炎性表型收购后脂多糖(LPS)刺激。同时,macrophage-exposed MAPC获得一个增强T细胞调节表型。此外,MAPC增加他们对经典激活巨噬细胞的炎性环境的能动性。总的来说,这些体外的发现表明亲密MAPC和巨噬细胞之间的相互作用发生,导致MAPC增强治疗的潜力。本研究权证体内验证,可以,从长远来看,适当协助组织目标在临床前自体实验研究。

2。材料和方法

2.1。rMAPC文化和化学物质

刘易斯rat-derived MAPC (rMAPC)提供投资兴建ReGenesys(比利时鲁汶)和维护根据标准协议开发的供应商(37°C / 5%的股份有限公司₂/ 5%啊₂)。细胞被孤立和扩大如前所述25,27]。杜尔贝科rMAPC介质由60%的修改鹰介质(DMEM;欧洲容积Gibco,生命技术,Gent, Belgium) low glucose (1 g/L), 40% MCDB-201 medium (pH 7.2), 1X linoleic acid-bovine serum albumin, 10⁻⁴0.05 M l-ascorbic酸μ地塞米松,55μM 2-mercapto-ethanol(从Sigma-Aldrich, Diegem,比利时)、青霉素100单位/毫升和100年μg / mL链霉素(表达载体,生活技术欧洲容积),1 x insulin-transferrin-selenium (Lonza, Verviers,比利时),10 ng / mL鼠表皮生长因子,10 ng / mL重组人血小板源生长因子(研发系统,阿宾顿,英国),和10³单位/毫升小鼠白血病抑制因子(美国微孔,Billerica的)。最后,媒介与2%胎牛血清(补充的边后卫;Hyclone,欧盟批准了,猫CH30160.03)。细胞培养在人为纤连蛋白(10 ng / mL;Sigma-Aldrich) T175烧瓶(蜂星,他一一Bio-One, Vilvoorde,比利时)或培养皿(Nunc, VWR,鲁汶,比利时)根据所需的目的。

前列腺素E2 (PGE2_,法明岱尔恩佐生命科学,美国纽约)添加了巨噬细胞在特定的实验。PGE2稀释在二甲亚砜(DMSO溶液;Sigma-Aldrich)也使用消极的控制。

2.2。腹膜巨噬细胞、NR8383细胞和髓磷脂碱性蛋白特异性T细胞的生成

腹腔巨噬细胞被孤立的女性刘易斯老鼠通过腹膜灌洗和5毫米乙二胺四乙酸(EDTA);VWR,比利时鲁汶)解决方案在磷酸盐(PBS)如前所述28]。细胞被收集和离心机在1400转10分钟。播种后,细胞被允许坚持3个小时,然后洗了两次,罗斯威尔公园纪念研究所- (RPMI -) 1640(表达载体,生活技术欧洲容积)删除不依从腹膜渗出物细胞。腹膜巨噬细胞、肺泡NR8383 macrophage-like细胞系(29日rpmi - 1640年),是培养补充10%胎牛血清(FCS, Gibco,生活技术欧洲帐面价值、绅士、比利时)和0.5% penicillin-streptomycin混合物(Gibco)。

一代的髓磷脂碱性蛋白(MBP)特异性T细胞,女士的实验模型,实验性自身免疫性脑脊髓炎(运算单元)9),在女性刘易斯诱导大鼠(Janvier、法国)。老鼠皮下注射0.1毫升250解决方案μg / mL豚鼠MBP, 2.5毫克/毫升H37RA heat-killed结核分枝杆菌(美国底特律Difco),和60μL完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich)后爪子。十天postimmunization,老鼠被牺牲和腘和腹股沟淋巴结被切除。组织是通过70年磨μm细胞过滤器来生成一个单一的细胞悬液。MBP-specific T细胞生成所述前(30.]。

所有动物实验伦理委员会批准特大学的动物实验。

2.3。Cocultures

rMAPC的影响巨噬细胞的表型是确定直接和transwell cocultures。巨噬细胞被播种在24-well板块(5×10⁵/),添加了rMAPC比率从1:0.5到1:4。细胞被允许预处理时间为24小时,然后100 ng / mL有限合伙人(Sigma-Aldrich)增加了20小时。评价环氧合酶(COX)观察到的作用效果,10μ吲哚美辛(Sigma-Aldrich)添加与LPS刺激。

2.4。接触rMAPC巨噬细胞上清液和一代的媒体

巨噬细胞与100 ng / mL LPS刺激了12小时,和上层清液(SN)收集,过滤0.45μm过滤器,用于rMAPC 12小时。浮在表面的未经处理的巨噬细胞被用作控制。定义不同的信使核糖核酸(mRNA)表达式,rMAPC孵化了SN的±LPS-activated巨噬细胞或有限合伙人(7.5×10⁵细胞/)。接触的SN LPS-activated巨噬细胞测量延长到18个小时没有使用格里斯试剂测定(Promega,鲁汶,比利时)。

准备double-conditioned媒体(DCM), rMAPC (5×10⁴细胞/),以前接触的SN LPS-activated为12小时,巨噬细胞可以分泌可溶性因子24小时50μL巨噬细胞培养基(96孔板)。在具体实验中,rMAPC被刺激的重组大鼠肿瘤坏死因子-α,il - 1β和il - 6 (100 ng / mL;所有从Peprotech,英国伦敦)部分模仿LPS-activated巨噬细胞的SN。这个条件培养基被指定为“许可——“条件培养液(LCM)。Nonstimulated rMAPC single-conditioned媒体(CM)提供。代条件的代表性媒体rMAPC见附加图可以在网上https://doi.org/10.1155/2017/2353240。所有的媒体都通过一个0.45收集和过滤μm过滤器。

2.5。应用溶性因素派生rMAPC巨噬细胞和T细胞

巨噬细胞(1.5×10⁵/好/ 96孔板)暴露在有限合伙人(100 ng / mL)和条件从rMAPC媒体24小时。这一时期后,可溶性介质在浮在表面的测量。同时,确定M1和M2的mRNA表达标记,NR8383细胞(7.5×10⁵细胞/好/ 24-well板)被播种的媒体有或没有极化刺激。控制条件包括细胞与M1刺激新鲜的培养基(100 ng / mL有限合伙人),M2刺激{100 ng / mL白介素4 (il - 4)、150 ng / mL白介素13 (IL-13),和250 ng / mL白介素10 (il - 10)},或没有任何刺激(M0)。

定义rMAPC-derived条件的影响媒体对抗原T细胞,MBP-reactive T细胞(2.5×10⁵)和辐照胸腺细胞(2.5×10⁵细胞/嗯,3000 rad)被播种在96 - U-plates在厘米,DCM,或中国大陆和暴露在10μg / mL MBP。条件媒体稀释1:1用新鲜的T细胞培养基。T细胞培养基的一致性是如前所述25]。控制条件包括T细胞和胸腺细胞播种在1:1 nonconditioned和T细胞的混合物中有或没有MBP。48小时后,1μCi³H胸苷(PerkinElmer沃尔瑟姆,妈,美国)每增加了18个小时。这段时间后,细胞收获细胞收获机(自动)和胸苷掺入测量β板液体闪烁计数器(PerkinElmer)。刺激细胞扩散指数计算是基于个人情况没有添加外源性刺激(MBP)。

2.6。迁移分析

迁移rMAPC向LPS-activated巨噬细胞分泌的可溶性因子的评估使用8μ米直径孔transwell化验。为了避免假阳性迁移对增加血清浓度(31日),巨噬细胞被播种在巨噬细胞中含有1% FCS,而不是之前的10%,与LPS刺激24小时。从巨噬细胞条件培养基被播种的下部24-well插入。rMAPC (3×10⁴细胞在DMEM /)暂停低葡萄糖1 g / L (Gibco)含1% FCS在参议院。Nonconditioned巨噬细胞培养基补充1% FCS为负而rMAPC介质作为积极的控制(25]。细胞被允许迁移14小时37°C。然后,媒体在众议院被删除和插入和4%多聚甲醛溶液固定(PFA) 20分钟,然后用PBS (Lonza)两次。随后,细胞被沾0.1%结晶紫(Sigma-Aldrich)在乙醇溶液10分钟。细胞顶部的插入删除使用棉签。插入与PBS洗,允许空气干燥,每口井的三个图片。使用ImageJ软件,照片转换为8位图像和迁移分数表示为总建筑面积的比例以及[32]。

2.7。抗原回忆试验

定义条件的影响媒体rMAPC巨噬细胞呈现抗原的能力,巨噬细胞(5×10⁴/好/ 96孔板)和25个脉冲μg / mL MBP从rMAPC在媒体的存在条件。18个小时后,条件媒体被移除和1.5×10⁵二乙酸carboxyfluorescein succinimidyl酯(CFSE;英杰公司)标记MBP-specific T细胞(2μ米)被添加(T细胞/巨噬细胞比率3:1)。4天后,T细胞流式细胞仪收集和处理。T细胞是沾染了老鼠anti-CD3 (eBioscience,维也纳,奥地利)和7 aminoactinomycin D(7法;研发系统,阿宾顿,英国)来评估细胞死亡。

2.8。流式细胞术

条件的影响媒体rMAPC巨噬细胞的内吞作用的特性是评估使用异硫氰酸荧光素(FITC)——标记右旋糖酐珠子(Sigma-Aldrich)。为此,从rMAPC孵化条件媒体一夜后,巨噬细胞暴露在100年μg / mL FITC-labeled右旋糖酐珠子2小时。巨噬细胞暴露在冰珠被沿着正确的背景水平由自发生成粘珠子的细胞膜。在不同的实验,细胞被沾anti-rat CD86 (eBioscience)和平均FL2 CD86大门内信号被用来评估CD86表达。在coculture实验中,细胞被沾anti-CD11 b / c(美国BioLegend,圣地亚哥,CA)连同anti-CD86,意思表达的FL2通道是用来测量CD86表达。

2.9。基因表达分析

RNA是孤立RNeasy迷你包(Venlo试剂盒,荷兰)和转录是互补脱氧核糖核酸(互补)使用量子工具包(VWR,鲁汶,比利时)后,制造商的指示。半定量实时聚合酶链反应(qPCR)进行检测基因表达的变化。反应进行的StepOnePlus™实时PCR系统(应用生物系统公司)在微安培快光96 -反应板总量的10μL /反应。掌握组合由1 x快SYBR绿色主人混合(应用生物系统公司),10毫米的底漆(设计引物3 (33];Eurogentec,列日,比利时),nuclease-free水,12.5 ng cDNA模板。放大后,融化曲线分析检测的特异性qPCR产品。补充表中列出所使用的引物序列。2^−ΔΔCt方法相对量化每个基因的表达(34]虽然数据规范化为每个实验最稳定的参考基因后geNorm分析(35]。

2.10。测量的介质和亚硝酸盐的形成

细胞因子测定与夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)。肿瘤坏死因子-α(eBioscience)和il - 6(研发系统,明尼阿波利斯,美国)ELISA使用制造商的指示后,使用分光光度计和吸光度测量450海里(Bio-Rad基准、Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。亚硝酸盐的测定使用格里斯试剂系统(Promega,鲁汶,比利时)制造商的指令后,在540 nm和吸光度测定。

2.11。统计分析

数据分析与Windows GraphPad Prism 5.00版本(GraphPad软件,圣地亚哥,加利福尼亚,美国www.graphpad.com),给出了均值±SEM。达和皮尔森综合正常测试是用来评估是否遵循正态分布的数据。两组之间的比较,未配对学生的t以及或Mann-WhitneyU测试使用。单向方差分析(方差分析)其次是Dunnett多重比较测试或克鲁斯卡尔-沃利斯随后邓恩的多重比较检验使用,取决于参数或非参数的数据,对比多个组。差异与值≤0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。rMAPC释放没有当Cocultured炎性巨噬细胞

ΝΟ多通道功能的神经炎症疾病。虽然没有高水平的可能损害为少突胶质细胞和神经元36),没有也可以抑制autoreactive T细胞的增殖(30.]。在这部分的研究中,我们试图确定没有释放cocultures rMAPC和巨噬细胞。我们的数据显示,没有水平增加直接和transwell cocultures炎性巨噬细胞和rMAPC(数字1(一)和1 (b))。Nonstimulated巨噬细胞没有公布检测水平的(数据未显示)。确定的细胞来源没有在cocultures rMAPC孵化了SN LPS-activated巨噬细胞(图1 (c))。我们观察到rMAPC释放不高于水平已经出现在上层清液由于LPS刺激巨噬细胞(图1 (d))。符合这一发现,rMAPC显示增加mRNA的表达伊诺在接触SN LPS-activated巨噬细胞相比rMAPC刺激与SN nonstimulated巨噬细胞或有限合伙人(图1 (e))。

3.2。rMAPC抑制肿瘤坏死因子的释放α通过巨噬细胞部分COX-2-Dependent机制

成体干细胞在抑制炎症的性质都具有潜力经典激活巨噬细胞,甚至直接向一个“M2-like表型(12,14,37]。直接和transwell cocultures rMAPC和LPS-stimulated巨噬细胞的影响建立了确定rMAPC巨噬细胞炎症介质的释放。rMAPC抑制肿瘤坏死因子的释放α通过激活巨噬细胞在剂量依赖性的方式(图2(一个))。Nonstimulated巨噬细胞没有产生TNF -可检测水平α(数据没有显示)。一个类似的抑制TNF -α释放时观察到的细胞接触rMAPC和巨噬细胞被使用transwell插入(图2 (b))。rMAPC没有产生TNF -可检测水平α治疗后的SN±LPS-activated巨噬细胞(数据没有显示)。

前列腺素E2 (PGE2)是众所周知的调节巨噬细胞的表型。有趣的是,其病原反应酶的表达参与代PGE2,环氧酶2 (cox - 2)是诱导msc和MAPC炎症条件下(12,14,25]。通过使用cox - 2抑制剂,我们表明,降低TNF -α巨噬细胞释放的直接接触与rMAPC cocultures部分废除(图2 (c))。相比之下,抑制cox - 2没有明显抵消肿瘤坏死因子水平降低α在transwell cocultures(图2 (d))。确认PGE2的能力降低TNF -α释放,巨噬细胞暴露在PGE2和LPS刺激。我们证明PGE2抑制肿瘤坏死因子的释放α剂量依赖性的方式LPS-stimulated巨噬细胞(图2 (e))。最后,我们发现rMAPC cox - 2 mRNA表达的增加,但不是COX-1,当暴露在SN LPS-activated巨噬细胞相比rMAPC对待SN从天真的巨噬细胞或有限合伙人(图2 (f)和数据未显示)。后者发现强烈表明,macrophage-driven rMAPC cox - 2的表达是参与调节巨噬细胞的表型。

3.3。rMAPC增加il - 6分泌反应激活巨噬细胞

与肿瘤坏死因子-α和类似于不,il - 6水平的增加直接和transwell cocultures巨噬细胞和rMAPC(数字3(一个)和3 (b))。cox - 2抑制剂的应用没有任何影响il - 6分泌(数据没有显示)。符合这一发现,PGE2并不影响由巨噬细胞释放il - 6与TNF -α(图3 (c))。定义在cocultures il - 6的细胞来源,rMAPC孵化了SN LPS-activated巨噬细胞在短期内。然后,新媒体应用24小时,这是用于测量il - 6水平(图3 (d))。Macrophage-primed rMAPC增加了il - 6分泌(DCM),虽然幼稚或cytokine-primed rMAPC没有产生可检测的il - 6水平(图3 (e))。同时,il - 6的mRNA表达rMAPC rMAPC SN对待相比增加巨噬细胞或有限合伙人(图3 (f))。这些结果指向rMAPC作为额外的细胞源释放il - 6在LPS-stimulated cocultures。感兴趣的,没有观察到il - 6生产nonstimulated cocultures,表明LPS刺激巨噬细胞必须由rMAPC诱导释放il - 6。

3.4。Macrophage-Primed rMAPC分泌因素调节巨噬细胞表型

越来越多的证据表明,炎症条件促进干细胞的免疫调节功能(38]。探索是否rMAPC影射炎性巨噬细胞相互地影响巨噬细胞生理学、double-conditioned中生成。为此,rMAPC最初引发SN LPS-activated巨噬细胞,模拟炎症介质释放的“M1-like”巨噬细胞在免疫介导的疾病,然后允许在他们的上层清液分泌因素(补充图)。巨噬细胞暴露在double-conditioned媒体rMAPC (DCM)(图4(一))分泌TNF -αLPS刺激后(图4 (b))。这种效果并不是由于增加巨噬细胞的细胞死亡(没有显示)。Single-conditioned媒体(CM)显示没有影响,表明启动的必要性rMAPC调节TNF -α由巨噬细胞分泌水平。il - 6水平没有影响(图在任何条件4 (c))。检测rMAPC-derived条件的影响媒体对极化的mRNA表达标记,我们使用macrophage-like细胞系,NR8383。DCM并未引起的自发表达M1(进气阀打开,CD86和TNF -α;数据4 (d),4 (e),4 (f))或M2标记{精氨酸酶1 (__arg1)和碳碳图案配体18 (CCL18);数据4 (g)和4 (h)在NR8383细胞}。然而,当NR8383细胞同时孵化与有限合伙人或M2-inducing DCM,刺激细胞因子(il - 4、il - 10 / IL-13),我们观察到的mRNA表达增加__arg1、M2巨噬细胞典型的标记(数字4(我)和4 (j))。增加mRNA的表达CCL18 NR8383细胞培养观察扩张型心肌病中只有LPS刺激后(数据没有显示)。

总的来说,这些结果表明,监管活动rMAPC对巨噬细胞是由巨噬细胞释放的因素。

3.5。Macrophage-Primed rMAPC抑制Autoreactive T细胞增殖

autoreactive T细胞的增殖与疾病严重程度密切相关的神经炎症条件(39,40]。据报道,作为促炎启动增强骨髓间充质抑制T细胞增殖的能力(25,38),我们评估是否macrophage-mediated启动rMAPC也增强了他们的抑制myelin-reactive T细胞的能力。为此,MBP-reactive T细胞暴露在同源抗原和rMAPC double-conditioned媒体。此外,MBP-reactive T细胞暴露在条件培养液的rMAPC TNF -α,il - 1βil - 6,通常由炎症巨噬细胞分泌的细胞因子(41]。我们的数据表明,细胞因子- (LCM)和巨噬细胞(DCM)影射rMAPC抑制MBP-reactive T细胞的增殖(图类似的程度5)。

3.6。rMAPC-Derived可溶性因素干扰巨噬细胞的抗原表达能力

巨噬细胞是专门的抗原递呈细胞”。髓鞘抗原的加工和随后的演讲巨噬细胞促进神经炎症和疾病进展(42]。定义是否可溶性因素来源于影射rMAPC影响T细胞刺激巨噬细胞的能力,巨噬细胞和MBP的脉冲条件媒体之前coculture MBP-reactive T细胞。巨噬细胞暴露在double-conditioned媒体(DCM)和licensed-conditioned介质(LCM)显示能力降低刺激T细胞与巨噬细胞暴露于控制条件(图6(一))。双-或licensed-conditioned媒体并不影响巨噬细胞的内吞作用的能力(图6 (b))。这一发现表明,减少了MBP的吸收并不构成巨噬细胞刺激T细胞的能力受损。有趣的是,巨噬细胞培养在DCM和LCM显示减少表面CD86的表达(图6 (c))。同样,巨噬细胞显示减少表面CD86的表达直接接触与rMAPC coculture LPS刺激后(图6 (d))。这些发现表明,rMAPC影响T细胞刺激巨噬细胞通过减少costimulatory分子的表达能力(6,7]。

3.7。rMAPC能动性增加对巨噬细胞分泌炎症介质

迁移对炎性细胞出现在该网站发布的梯度组织损伤的一个重要特性是成体干细胞的存在(15,25]。我们观察到一个增强的迁移对炎症macrophage-conditioned rMAPC介质条件培养基相比得到了nonstimulated巨噬细胞(图7(一))。一个增强的主题趋化因子受体的表达,CCR1和CCR3 rMAPC也许可以解释观察到的增加rMAPC迁移(数据7 (b)和7 (c))。的受体CCR1和CCR3 CCL5,这是一种通常由经典分泌趋化因子激活巨噬细胞(10]。这些观察表明,rMAPC增加他们的能动性炎症激活巨噬细胞产生的梯度。此外,rMAPC CCL2 mRNA表达的增加,CCL5, CXCL10,在暴露于SN LPS-activated巨噬细胞(补充图)。整体而言,这些结果表明,检查参与组成分泌腺rMAPC接触经典活化的巨噬细胞可以帮助建立与体内的免疫细胞相互作用通过改变他们的迁徙和chemoattractive表型。

4所示。讨论

干细胞移植是一种很有前途的治疗方法治疗神经炎症和神经退行性疾病。女士在移植等中枢神经系统炎症性疾病,创伤性脑损伤,科学,和中风,干细胞是可能遇到的髓细胞在中枢神经系统和外围。髓细胞在这些疾病主要效应细胞(6,9,43,44]。扭曲髓细胞减少炎性表型被认为是一种很有前途的治疗策略。在这项研究中,我们表明,巨噬细胞和rMAPC相似,但功能不同的附着干细胞群msc与优越的特性,密切相互作用从而影响彼此的炎症和迁徙的表型。特别是,我们发现rMAPC抑制经典激活巨噬细胞的炎症特征。亦然,rMAPC获得免疫调节和迁移表型暴露在可溶性炎性巨噬细胞释放的因素。这些同源的互惠rMAPC和巨噬细胞之间的相互作用可能存在炎症的抑制特性,因此进一步使用rMAPC治疗神经炎症疾病。

巨噬细胞分泌大量的炎症介质,促进神经炎症和神经退行性变的。肿瘤坏死因子-α高度表达的实质和循环骨髓细胞在神经炎症6和促进神经退化是众所周知的45]。使用msc与先前的研究,我们的数据表明,rMAPC抑制肿瘤坏死因子的分泌α由LPS-stimulated巨噬细胞(11,12]。rMAPC分离和巨噬细胞没有废除的抑制TNF -α分泌,表明rMAPC减少释放产生的可溶性因子TNF -α巨噬细胞。rMAPC移植后,这减少了TNF的表达α可能会降低寡树突胶质细胞损伤中枢神经系统内,从而降低疾病进展(45,46]。

通过对cox - 2抑制剂,PGE2的病原反应酶的形成,我们进一步提供证据表明rMAPC部分调节TNF -α由巨噬细胞分泌COX-2-dependent的方式。符合这一发现,激活macrophage-conditioned介质明显增加的cox - 2 mRNA水平rMAPC和PGE2政府减少释放肿瘤坏死因子-α巨噬细胞。先前的研究表明,PGE2的关键中介msc和MAPC的免疫抑制特性12,25,47,48]。然而,在我们的实验中,肿瘤坏死因子的水平α并没有完全恢复后抑制cox - 2,表明其他机制可能在观察到的效应发挥协同作用。这些机制可能包括il - 6、il - 10和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm - csf) (49,50]。此外,肿瘤坏死因子的水平α还未恢复,cox - 2被抑制在transwell化验。这表明其他协同机制协助抑制巨噬细胞炎性表型,如整合蛋白绑定相应的巨噬细胞表面的受体(51]。此外,PGE2的免疫抑制作用似乎增强当rMAPC和巨噬细胞在附近52]。尽管其他研究也表明,PGE2抑制il - 6生产鼠标腹膜巨噬细胞(12],PGE2并不影响巨噬细胞il - 6的分泌在我们的实验。这可能是由于增加的il - 6水平rMAPC cocultures,抑制巨噬细胞il - 6的伪装。的影响rMAPC应该进一步研究巨噬细胞il - 6的分泌。最终,完全废除cox - 2 mRNA表达,例如,使用核,可以提供一个更好的理解在MAPC-mediated PGE2的免疫抑制作用。

我们的数据进一步表明,可溶性因子释放的炎症巨噬细胞促进cocultures rMAPC il - 6分泌的。据报道,macrophage-associated msc增加il - 6分泌(15]。然而,尽管msc il - 6分泌增加巨噬细胞(11,50),rMAPC LPS-stimulated巨噬细胞il - 6生产没有影响的实验。il - 6具有双向作用,因为它可以支持和抗炎作用。il - 6控制炎症的级联反应而愈合过程也是必要的免疫抑制小鼠基于其诱导的能力“M2——“极化巨噬细胞(53- - - - - -55]。自il - 6已被建议作为关键分子msc向一个促进巨噬细胞的极化“平方米”表型和PGE2 upregulation msc il - 6的依赖,需要进一步探讨其作用[50,56]。rMAPC总的来说,il - 6分泌的炎症环境意味着阿森纳的免疫调节机制,在触发事件与免疫激活有关。

在炎症性疾病、巨噬细胞和小胶质细胞分泌促炎细胞因子的分泌,可以增强免疫调节分子通过成年干细胞类型(16,56]。rMAPC我们发现没有分泌增加,以及提升mRNA大量伊诺rMAPC在治疗中来自炎性巨噬细胞。我们之前已经证明rMAPC增加免疫调节和神经保护属性,当他们遇到一个神经炎症环境(25]。值得注意的是,除了免疫调节(25,30.,38),没有可以诱导神经元和少突细胞损伤57]。尽管rMAPC没有增加其他促炎细胞因子的表达,如肿瘤坏死因子-α,没有斜向炎症巨噬细胞表型,我们不能排除促炎“MSC1-like”表型的诱导rMAPC [58]。

除了抑制巨噬细胞炎性表型的因素由macrophage-primed分泌和cytokines-primed rMAPC还与巨噬细胞的T细胞刺激能力干预可能通过抑制costimulatory分子CD86的表达。值得注意的是,cytokine-primed rMAPC-conditioned介质不影响巨噬细胞的T细胞刺激能力程度类似于macrophage-primed条件培养基,同时诱导的抑制表面CD86表达。这表明比用于其他介质(TNF -重组形式α,il - 1β和il - 6)对观察到的效果。此外,它表明额外的机制可能调解的效果rMAPC macrophage-associated T细胞刺激活动超出costimulatory分子的抑制。清道夫受体抑制,如CD36 CD14,参与抗原的识别可能是一个额外的机制和值得进一步调查,因为它已被证明为msc (59]。

此外,我们观察到发布的可溶性因子macrophage-primed rMAPC直接抑制抗原T细胞增殖程度类似于cytokine-primed rMAPC。先前的研究结果证明需要MAPC与单核细胞为了抑制T细胞的稳态扩散60]。这种效果是由于il - 1β由hMAPC端依赖PGE2的分泌。符合这一发现,我们曾发现,il - 1β增加cox - 2 mRNA在rMAPC [25]。总的来说,我们认为这些免疫调节机制可以通过激活巨噬细胞,引发集体这些观察证实了概念的“许可”MAPC增强他们的旁分泌作用25,58,61年),使他们作为一个理想的移植细胞类型神经炎症条件。

迁徙和chemoattractive移植细胞对骨髓细胞的性质是非常重要的为他们调解他们的免疫调节特性62年]。我们观察到巨噬细胞释放可溶性分子吸引rMAPC和增加在rMAPC趋化因子和趋化因子受体的表达。CCR1的增加和CCR3同意观察他们的表情是引起肿瘤坏死因子-α和il - 1βrMAPC (25]。这个结果是有用的为直接接触交互或旁分泌机制的有效性63年]。

5。结论

巨噬细胞有双峰行动谷中枢神经系统疾病;在中枢神经系统脱髓鞘事件驱动巨噬细胞和小胶质细胞激活从而导致疾病发病机理(6,64年,65年),巨噬细胞清除髓碎片促进remyelination烟对收购的形态学抗炎和神经保护表型(30.,66年- - - - - -68年]。因此,高度重视阐明MAPC如何调节的骨髓细胞类型的特点因为静脉注射移植细胞可能在附近局部髓细胞在中枢神经系统和外围37,61年,69年]。总的来说,我们表明,炎症巨噬细胞能够调节rMAPC体外免疫调节的特性,从而保证确认的体内研究。一个假想的三角形炎性巨噬细胞和MAPC产生相互影响,导致T细胞增殖减少由于MAPC旁分泌的影响,或者由于巨噬细胞的减少导致免疫发病机理的延续能力,应考虑实验细胞疗法的设计方案,本研究的新颖性(图8)。有效适应MAPC的微环境将有利于他们使用针对骨髓细胞介导神经炎症被认为是一个重要的步骤在持续MAPC-based临床试验(70年]。

信息披露

部分这项研究已经发表在国际会议和作为补充》期刊上发表。两个抽象作为补充剂,出版物的数据如下:地中海的回复2013;8 (6 s): S81-S81和Neuroimmunomodulation2014;21 (1):S7-S7。上市抽象不包括在引用列表中。

的利益冲突

投资兴建ReGenesys杰夫?)是一个雇员,Athersys inc .)在他的欧洲子公司目前隶属于Promethera生物科学。Robert w .梅斯是一个员工Athersys Inc . Robert院长以前的雇员Athersys Inc .)虽然他目前隶属于蓝色石头疗法。其余的作者宣称他们没有利益冲突。

作者的贡献

Stylianos Ravanidis进行了实验和写的手稿。Stylianos Ravanidis珀斯f . j .转向架,尼尔斯车辆疾驰当前研究的实验设计。珀斯f . j .转向架Raf Donders,杰夫?),罗伯特·院长罗伯特·w·梅斯提供了研究材料和辅助的解释结果。杰罗姆·j·a·亨德里克•和罗伯特·w·梅斯参加了这项研究的概念和设计。Piet Stinissen和罗伯特·w·杰罗姆•j•a•梅斯进行彻底的手稿。尼尔斯车辆疾驰监督这项研究给手稿的最终批准。

确认

作者愿进一步感谢女士Katrien Wauterickx和女士Christel Bocken(生物医学研究所,特大学)技术援助。此外,作者要感谢欧文莱森(UHasselt)导致实时PCR实验。最后,作者感激地感谢大卫Craeye和维亚•克里斯泰尔Gijbels投资兴建ReGenesys(员工)的技术和科学输入有关rMAPC的文化和特性。当前经济研究是由比利时夏科的基础。

补充材料

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