维护Schwann-Like表型的分化脂肪中提取干细胞需要多种生长因子的协同作用

文摘

区分人类脂肪干细胞(对asc)对雪旺细胞刺激因素撤回时产生一个不稳定的表型。这里,我们着手研究胶质生长因子2 (GGF-2)的作用在维护Schwann-like细胞。ASC Schwann-like细胞分化后,刺激因素撤回,这样细胞仍在媒体补充所有刺激因素,GGF-2孤独,或者接受了完全撤军的所有因素。此外,每个刺激因子也分别从生长培养基中删除。在72小时,基因(存在)和蛋白质(ELISA)许旺细胞的关键因素量化的表达和细胞形态进行了分析。细胞治疗GGF-2独自回到干细胞形态和不刺激脑源性神经营养因子(BDNF)的生产,不管GGF-2在生长介质的浓度。然而,独自GGF-2 Krox20的表达增加,髓鞘形成的主要转录因子参与,相对于这些细胞处理所有刺激因素。细胞缺乏纤维母细胞生长因子无法维持Schwann-like形态,和那些缺乏forskolin BDNF生产差别一个对这些展出。因此,它可能需要多种生长因子的协同作用对asc维持Schwann-like表型分化。

1。介绍

组织工程策略试图利用雪旺细胞的再生潜力(SCs)援助周围神经修复1]。多一直关注干细胞的使用,特别是大量来自脂肪组织(2,3]。脂肪提取干细胞分化成Schwann-like(对asc)细胞(dASC)结合forskolin处理时,神经胶质生长因子2 (GGF-2),纤维母细胞生长因子(FGF-2)和血小板源生长因子(PDGF) [2,3]。dASC拥有许多SC特征,包括一个纺锤状形态、检查参与组成分泌腺相似,能够诱导神经突再生(2- - - - - -4]。

当老鼠dasc已经被成功运用的啮齿动物体内模型中,证据是缺乏关于人类dasc[的功效4]。鉴于原分化协议开发鼠骨髓干细胞,就不足为奇了人类dasc回到他们的干细胞表型在撤出刺激因素(4]。因此,进一步描述dasc临床之前需要翻译。

GGF-2调节是一种可溶性的1 (NRG1),在SCs, NRG1允许SC前体的生存和参与生产髓鞘细胞(5,6]。它最近被显示,鼠标对asc缺乏GGF-2减少SC表型标记的表达(7]。这里,我们是否单独GGF-2足够维持关键Schwann-like属性通过检查dasc保持Schwann-like形态的能力,产生脑源性神经营养因子(BDNF),表达Krox20(髓鞘形成的主要转录因子参与)5]。

2。材料和方法

2.1。细胞收获、隔离和分化

从女性手术患者脂肪组织在南曼彻斯特大学医院,英国。患者完全同意,和程序批准的国家研究伦理委员会(nr 13 / SC / 0499)。先前描述的协议被用于对asc的隔离和分化4]。短暂,脂肪组织是第一个碎刀片,然后接受了60分钟的酶消化使用0.2% (w/v)胶原酶(生活技术,佩斯利,英国)。一个100μm尼龙网(英国英国默克密理博沃特福德)被用来过滤分离组织和间质血管分数(SVF)是通过离心,享年300岁10分钟。SVF孵化1分钟,红细胞裂解缓冲(Sigma-Aldrich)去除红细胞,recentrifuged(10分钟300),以及由此产生的颗粒的ASC镀在75厘米²烧瓶干细胞生长培养基(SCGM)组成的α最低基本培养基(αMEM (Sigma-Aldrich)]补充10% (v/v)胎牛血清的边后卫(英国Uckfield LabTech)], 2毫米谷酰胺(英国通用电气医疗集团,小都,英国),和1% (v/v)penicillin-streptomycin解决方案。雪旺细胞分化,subconfluent ASC文化补充1毫米β巯基乙醇的先决条件(Sigma-Aldrich) 24小时和72小时35 ng / mL all-trans-retinoic酸(Sigma-Aldrich)。预处理后,细胞培养基和SCGM补充14所取代μM forskolin (Sigma-Aldrich)、5.46 nM GGF-2 (Ardsley Acorda疗法的礼物,纽约,美国),10 ng / mL碱性纤维母细胞生长因子(FGF-2 (Peprotech EC、伦敦、英国)],和5 ng / mL血小板源生长因子(PDGF (Peprotech EC、伦敦、英国)]为14天。这个补充媒体用于细胞期间维护文化使直到进一步的实验。

2.2。实验装置

dasc被镀到12-well板块每口井的100000个细胞的密度(除非另有说明)在生长介质和维护所有48小时的刺激因素。媒体当时取代根据个人实验(见下文),和细胞培养72小时后,结果下面描述的措施进行评估。实验和技术使用一式三份。媒体在48小时内更换αMEM只有GGF-2 (dASC补充^{−/ + GGF})浓度的0.273 nM, 2.73 nM, 5.46 nM, 10.92海里。单独的每个因素(dASC撤军^{+ /−(GGF forskolin, FGF或PDGF)})也进行了,在每种情况下,正常生长介质(dASC积极控制⁺)和消极的控制(dASC撤军的因素⁻)使用。

2.3。形态学分析

光学显微镜和phalloidin染色的细胞进行实验端点。染色是根据先前描述的方法(4]。短暂,5000细胞/镀是为了更好地可视化个体细胞形态。端点,细胞用磷酸盐缓冲盐水洗净(PBS)解决方案和固定为4% (w/v)多聚甲醛在室温下15分钟。与0.2% (permeabilisation之后v/v)Triton x - 100 (Sigma-Aldrich) 20分钟,细胞被染色和Alexa 488 - 20分钟在黑暗中共轭phalloidin(1: 40岁,生活技术,美国)。PBS洗后,细胞成像使用奥林巴斯IX51荧光显微镜在4 x放大。15细胞图像在每个实验条件,和纵横比(AR)为每个细胞(细胞长度最长/最小单元宽度)确定使用图像J(美国国立卫生研究院)。

2.4。实时聚合酶链反应(qPCR)

细胞被收集在RNAprotect试剂,RNA提取使用RNeasy +迷你工具根据制造商的指示(试剂盒)。RNA是量化使用NanoDrop nd - 100分光光度计(美国热费希尔科学)。RT2第一链工具包(试剂盒)被用来反向转录RNA。RT2 qPCR SYBR绿色Mastermix和Corbett转子基因6000实时周期计被用来执行qPCR(试剂盒)。引物序列是Krox20[向前序列:5′-AACGGAGTGGCCGGAGAT-3′,反向序列:5′-ATGGGAGATCCAACGACCTCT条t - 3′(Sigma-Aldrich)], 18岁(试剂盒(猫号码pph05666e - 200)]和脑源性神经营养因子(试剂盒(猫号码pph00569f - 200)]。所有反应都是一式四份,并使用以下协议:激活HotStart DNA聚合酶通过加热在95°C 10分钟,其次是45 95°C的周期为15秒,30秒55°C, 72°C,持续30秒。融化曲线分析,以确定引物的特异性。分析qPCR数据,ΔΔCt法,正常化数据管家基因,18岁。

2.5。酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA试剂盒检测脑源性神经营养因子在细胞培养上清液(美国RayBiotech)是根据制造商的指示使用。板块在450 nm阅读使用一个容易uvm - 340微型板块分光光度计(Biochrom)。蛋白质的浓度计算出的样本插值对标准曲线的吸光率值获得使用重组脑源性神经营养因子的蛋白质。

2.6。统计分析

单向方差分析(与图基测试)和未配对t检验进行使用Graphpad Prism 7.0软件(Graphpad软件有限公司、美国)。< 0.05的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。dASC^{−/ + GGF}回到干细胞形态

未分化的ASC(阿拉伯航运,图1(一))刺激dASC⁺(图1 (b))产生细胞细长,纺锤状形态。dASC^{−/ + GGF}干细胞的形态恢复,dASC也是如此^{+ /−FGF}和dASC⁻(数据1 (c),1 (d),1 (e)),而dASC^{+ /−GGF},dASC^{+ /−forskolin},dASC^{+ /−PDGF}保留他们的纺锤形状(数字1 (f),1 (g),1 (h))。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

图1

GGF-2仅是不够的纺锤状形态,和FGF-2生产Schwann-like形态是必要的。(一个)显示一个未分化的细胞夷为平地,外观呈。(b) dASC⁺伸长和纺锤形。(c) dASC^{−/ + GGF}茎状的形态恢复,(d) dASC^{+ /−FGF}和(e) dASC⁻,同时dASC (f)^{+ /−GGF},(g) dASC^{+ /−forskolin},(h) dASC^{+ /−PDGF}保留所有纺锤状外观。所有的细胞都在10倍放大拍摄。

有更多的纺锤状dASC⁺(图2(一个)dASC相比)^{- / + GGF}(图2 (b))。dASC⁺AR dASC相比有显著提高^{−/ + GGF}(图2 (c))。细胞的相对频率的AR dASC确认^{−/ + GGF},有一个减少细胞的频率 (图2 (d))。

(一)

(b)

(c)

(d)

图2

细胞治疗所有刺激因素增加比例相比GGF-2单独对待。(一)纺锤状细胞在dASC清晰可见⁺phalloidin-stained细胞。细胞在4 x放大拍摄。(b) dASC^{−/ + GGF}phalloidin-stained细胞表现出更少的纺锤状细胞。(c) dASC⁺AR dASC相比有显著提高^{−/ + GGF}在dASC (4.752±0.144⁺在dASC和4.248±0.107^{−/ + GGF},,)。(d)共有249 dASC⁺细胞和304年dASC^{−/ + GGF}细胞进行分析,确定每个基于“增大化现实”技术的相对频率。有一个更高比例的细胞在dASC^{−/ + GGF}集团在dASC(分别为63%和53%⁺)和一个更高比例的纺锤状细胞dASC (AR≥5)⁺集团在dASC(分别为47%和37%^{−/ + GGF})。

3.2。dASC^{−/ + GGF}有dASC表型相似吗⁻

dASC^{−/ + GGF}调节Krox20表达式dASC相比⁺(图3(一个)),但未能保持BDNF生产水平无论GGF-2浓度(图3 (b))。在每种情况下,表达的模式是类似于dASC⁻。

(一)

(b)

图3

Krox20基因表达和细胞BDNF生产维护仅在GGF-2相似的细胞刺激因子撤回。(一)dASC⁻有一个4.351±0.552倍的表达增加Krox20 (,,);dASC^{−/ + GGF [0.273 nM)}细胞增加了4.599±0.568倍(,,);dASC^{−/ + GGF [2.73 nM)}细胞增加(4.23±0.527倍,,);dASC^{−/ + GGF [5.46 nM)}细胞增加(3.657±0.468倍,,);和dASC^{−/ + GGF [10.92 nM)}细胞3.648±0.148 (,,)比dASC Krox20表达式⁺细胞。dASC之间没有显著差异表达^{−/ + GGF}和dASC⁻。(b) dASC⁺相比10±0.440 ng / mL分泌BDNF在dASC 4.32±0.184 ng / mL⁻在dASC 3.673±0.314 ng / mL^{−/ + GGF [0.273 nM)}在dASC 3.695±0.266 ng / mL^{−/ + GGF [2.73 nM)}在dASC 4.351±0.257 ng / mL^{−/ + GGF [5.46 nM)},在dASC 4.243±0.208 ng / mL^{−/ + GGF [10.92 nM)}(对所有实验团体dASC相比⁺,,)。

3.3。Forskolin BDNF生产是必要的

dASC^{+ /−forskolin}和dASC^{+ /−PDGF}有显著降低基因表达BDNF相比其他组(图4(一))。dASC^{+ /−forskolin}也大大降低了BDNF蛋白的生产相比,所有其他组(图4 (b))。

(一)

(b)

图4

Forskolin可能参与脑源性神经营养因子的生产。(a)的PCR分析BDNF表达dASC显示^{+ /−forskolin}和dASC^{+ /−PDGF}表达下调BDNF的表达相比,所有其他团体(褶皱改变dASC 0.705±0.051⁻在dASC, 0.302±0.047^{+ /−forskolin}在dASC, 0.761±0.035^{+ /−GGF}在dASC, 0.749±0.037^{+ /−FGF}在dASC和0.41±0.017^{+ /−PDGF}相比1在dASC±0.044⁺。分析表明,dASC (b) ELISA蛋白质^{+ /−forskolin}脑源性神经营养因子的差别有很多对这些生产相比其他组(4.354±0.120 ng / mL dASC吗^{+ /−forskolin}而在dASC 7.784±0.413 ng / mL⁻12在dASC±0.435 ng / mL^{+ /−GGF}在dASC 10.33±0.197 ng / mL^{+ /−FGF}在dASC 12.46±0.158 ng / mL^{+ /−PDGF},在dASC 14.48±0.128 ng / mL⁺;,)。

4所示。讨论

的使用对asc在周围神经损伤已经证明真正的承诺在实验模型2,3];然而,临床翻译是阻碍了快速缺乏稳定在人类dasc当生长因子治疗撤回(4]。鉴于SC生物学NRG1信号的重要性,我们假定GGF-2足以维持dasc撤军后其他生长因子。我们的研究结果表明,这种表型的维护要复杂得多,依靠多种生长因子的协同行动。这将是至关重要的前理解潜在的临床使用的干细胞治疗周围神经损伤。

我们发现GGF-2就无法保持dasc的纺锤状形态。有趣的是,细胞缺乏FGF-2也回归uASC-like形态。刺激老鼠SCs FGF-2体外诱导轴形状特征,对asc和培养与FGF-2维持一个纺锤状形态(8,9]。这表明FGF-2可能参与生产Schwann-like形态。

我们发现dASC^{−/ + GGF}降低了BDNF生产dASC相比⁺一样,dASC^{+ /−forskolin}。我们可以因此表明GGF-2是不够孤独产生脑源性神经营养因子,但forskolin,协同BDNF生产与其他因素可能是必要的。Forskolin行为通过细胞内的环磷酸腺苷(营),和最近的一项研究发现,营地反应元件结合蛋白(分子)是在对asc BDNF生产(10,11]。作者发现老鼠对asc刺激forskolin迅速增加了BDNF生产和磷酸化分子的表达11]。因此,forskolin可能参与脑源性神经营养因子的生产(10,11];然而,人类对asc的机制还有待阐明。

在SCs [NRG1控制髓鞘形成的许多方面6,12,13]。NRG1与低水平的刺激信号允许髓鞘形成,但启动脱髓鞘持续激活(6,14- - - - - -16]。我们调查类似的效果是否会通过刺激细胞在dasc GGF-2增加浓度和量化Krox20表达式。dASC^{−/ + GGF}有显著增加Krox20表达式dASC相比呢⁺;然而,没有dASC之间的表达差异^{−/ + GGF}和dASC⁻细胞。这表明,其他生长因子可能对Krox20有抑制作用需要进一步调查。

5。结论

GGF-2本身是不足以维持dasc Schwann-like属性实现。细胞失去形态学特征和表达下调脑源性神经营养因子。然而,我们指出,细胞治疗只有GGF-2增加他们的表达Krox20相对于那些接受所有因素,表明其他因素对Krox20表达有抑制作用。Forskolin出现BDNF所需生产,FGF-2可能负责Schwann-like形态。因此,生长因子的协同作用很可能维持dASC Schwann-like属性,需要进一步的工作在这个领域之前,这些细胞的临床应用。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

爱丽丝·e·莫蒂默的概念和设计,收集和汇编的数据,数据分析和解释,手稿写作和手稿的最终批准。亚历山德罗Faroni导致了概念和设计,金融支持,提供学习资料,数据分析和解释,手稿写,手稿的最终批准。亚当·j·里德的概念和设计,金融支持,提供学习资料和病人,数据分析和解释,手稿写作和手稿的最终批准。Mahmut a科里奇导致了数据分析和解释,组装的数据,并最终批准的手稿。

确认

亚历山德罗Faroni和亚当·j·里德哈格里夫斯和球的信任,支持国家健康研究所(ii - la - 0313 - 20003),医学科学院,曼彻斯特再生医学网络(MaRMN)。作者感谢Acorda疗法好心地为他们提供重组GGF-2用于这项研究。作者还要感谢乔纳森·邓肯先生和小姐Siobhan O 'Ceallaigh顾问整形外科医生和病人在南曼彻斯特大学医院的脂肪组织的捐赠。

引用

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干细胞国际

为未来生产干细胞移植治疗的目的

维护Schwann-Like表型的分化脂肪中提取干细胞需要多种生长因子的协同作用

文摘

1。介绍

2。材料和方法

2.1。细胞收获、隔离和分化

2.2。实验装置

2.3。形态学分析

2.4。实时聚合酶链反应(qPCR)

2.5。酶联免疫吸附试验(ELISA)

2.6。统计分析

3所示。结果

3.1。dASC^{−/ + GGF}回到干细胞形态

3.2。dASC^{−/ + GGF}有dASC表型相似吗⁻

3.3。Forskolin BDNF生产是必要的

4所示。讨论

5。结论

的利益冲突

作者的贡献

确认

引用

版权

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2.2。实验装置

2.3。形态学分析

2.4。实时聚合酶链反应(qPCR)

2.5。酶联免疫吸附试验(ELISA)

2.6。统计分析

3所示。结果

3.1。dASC−/ + GGF回到干细胞形态

3.2。dASC−/ + GGF有dASC表型相似吗−

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